miRNA-200b通過靶向RhoA抑制宮頸癌細胞增殖、促進細胞凋亡

何麗杰 陳會佳 王靜 常丹丹 呂丹丹 李海娜（天津市第五中心醫(yī)院檢驗科，天津300450）

宮頸癌是世界范圍內(nèi)常見癌癥，是嚴重威脅婦女生命的常見惡性腫瘤之一，女性患者死亡率較高［1］。微小RNA（microRNA，miRNA）是內(nèi)源性單鏈小RNA，可通過翻譯后修飾在人類腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。研究報道，miRNA與宮頸癌細胞增殖、凋亡、侵襲等密切相關(guān)，是宮頸癌診斷、治療和預(yù)后評估的新靶點［2-3］。miRNA-200是一類抑制腫瘤的miRNA家族，包括miRNA-200a、miRNA-200b、miRNA-200c等，促進miR-200家族表達可抑制胰腺癌細胞侵襲和遷移［4］。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-200b在上皮性卵巢癌中異常表達，且血漿miRNA-200b水平可作為早期診斷上皮性卵巢癌的分子標志物［5］。RhoA是具有GTP酶活性的小分子G蛋白，參與腫瘤細胞生長、血管生成及浸潤轉(zhuǎn)移等進程。研究發(fā)現(xiàn)，RhoA在胃癌組織及肺腺癌組織中均存在過度表達，參與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移、侵襲［6-7］。Bax為Bcl-2家族成員，具有促凋亡作用，過表達Bax可促進多種細胞自發(fā)凋亡，還可增加由多種因素引起的細胞凋亡［8］。CyclinD1在多種惡性腫瘤中異常高表達，可促進腫瘤細胞增殖［9］。目前關(guān)于miRNA-200b及RhoA蛋白對宮頸癌細胞增殖凋亡的影響鮮有報道。因此，本研究驗證miRNA-200b與RhoA蛋白在宮頸癌細胞中的靶向關(guān)系，并探討其在宮頸癌細胞增殖、凋亡中的作用，為宮頸癌治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑人宮頸癌HeLa細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫；胎牛血清購自美國Gibco公司；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、ECL化學發(fā)光液、CCK8試劑盒均購自碧云天生物有限公司；兔抗人RhoA單克隆抗體（克隆號：EPR18134）、兔抗人CyclinD1單克隆抗體（克隆號：EPR2241）、兔抗人Bax單克隆抗體（克隆號：EPR18283）、兔抗人VEGF單克隆抗體（克隆號：Y103）、小鼠抗人TGF-β1單克隆抗體（克隆號：TB21）均購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG（二抗）均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要儀器CO2細胞培養(yǎng)箱購自美國SHELDON公司；BD FACS Calibur流式細胞儀購自美國BD公司；實時熒光定量PCR儀購自德國Eppendorf公司；低溫高速離心機購自德國Heraeus公司；全自動酶標儀、電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀均購自美國Bio-Rad公司；搖床（TS-8）購自上海精密儀器制造公司；化學發(fā)光成像系統(tǒng)購自美國GE公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染將人宮頸癌HeLa細胞接種于RPMI1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清），37℃、5%CO2培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。根據(jù)處理方法不同將HeLa細胞分為5組：空白對照組、mimic-NC組、miRNA-200b mimic組、RhoA-NC組和RhoA過表達組，HeLa細胞以1×106個/ml接種于6孔板，培養(yǎng)過夜。取2管，第1管加45μl DMEM分別與5 μl miRNA-200b模擬物、過表達陰性對照、RhoA空白對照質(zhì)粒、RhoA過表達質(zhì)?；靹?；第2管加45μl DMEM和5μl Lipofectamine2000混勻，放置5 min，融合20 min，加至6孔板，建立miRNA-200b mimic組、mimic-NC組、RhoA-NC組和RhoA過表達組，未轉(zhuǎn)染細胞作為空白對照組。分別于轉(zhuǎn)染后收集各組細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 RT-PCR檢測各組細胞miRNA-200b表達Trizol法提取各組HeLa細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，miRNA-200b以U6為內(nèi) 參，采 用SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR法檢測各組細胞miRNA-200b表達。引物由上海生工公司設(shè)計合成，miRNA-200b F：5'-GGGGTAATACTGCCTGGT-3'，R：5'-TGCGTGTCGTGGCGTC-3'；U6 F：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，R：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性10 s，60℃退火30 s，共40個循環(huán)。各樣本重復(fù)檢測3次，2-ΔΔCt法計算miRNA-200b相對表達。

1.2.3 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灢捎蒙镄畔W軟件TargetScan等數(shù)據(jù)庫分析miRNA-200b的靶基因，結(jié)果顯示，RhoA基因3′端存在miRNA-200b的結(jié)合位點，提示RhoA是miRNA-200b的直接靶基因。采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C該結(jié)果，分別擴增出含miRNA-200b結(jié)合位點的RhoA 3′UTR及miRNA-200b結(jié)合位點突變的RhoA 3′UTR系列，將其插入熒光素酶報告基因載體上，構(gòu)建野生型RhoA-Wt和突變型RhoA-Mut重組質(zhì)粒。將HeLa細胞接種于96孔板，37℃培養(yǎng)24 h，分別將RhoA-Wt重組質(zhì)粒、RhoA-Mut重組質(zhì)粒與miRNA-200b mimic（5'-UAAUACUGCCUGGUAAUGAUGA-3'）或mimic-NC（5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′）共轉(zhuǎn)染至細胞中，37℃培養(yǎng)48 h，收集并裂解細胞，雙熒光素酶報告基因分析。

1.2.4 Western blot和RT-PCR檢測各組細胞RhoA蛋白及mRNA表達分別收集轉(zhuǎn)染48 h的各組細胞，加入RIPA細胞裂解液于冰上提取細胞中總蛋白，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒對蛋白進行定量，將蛋白樣品與上樣緩沖液混勻，沸水浴加熱變性，取等量變性蛋白樣品加入上樣孔，行SDS-PAGE凝膠電泳。待蛋白分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗膜，加入RhoA一抗（1∶1 500），4℃雜交過夜，TBST洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶3 000），室溫雜交1 h，TBST洗膜，ECL化學發(fā)光，暗室成像拍照，以β-actin為內(nèi)標蛋白，Image J軟件計算各組細胞RhoA蛋白表達，RhoA mRNA檢測方法參照1.2.2。引物設(shè)計：RhoA F：5'-TGATTGTTGGTGATGGAGCCT-3'；R：5'-ACTCTACCTGCTTTCCATCCAC-3'；β-actin F：5'-GATTGGAATCTGGCTACT-3'，R：5'-TAGGGCTGAAGCACAGGG-3'。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡取轉(zhuǎn)染后的各組細胞，不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，PBS離心洗滌3次。將細胞重懸于預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液中，調(diào)整細胞密度為1×106個/ml，加入1.25μl Annexin V-FITC輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min，用0.5 ml預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液重懸，加入10μl Ptopidium Iodide，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，實驗重復(fù)3次取平均值。

1.2.6 CCK8法檢測細胞增殖分別收集各組細胞以2×103個/孔接種至96孔板，37℃常規(guī)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48 h，各孔細胞中加入混有10% CCK8檢測試劑的培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)2 h，酶標儀測定波長450 nm處各孔光密度（OD）。實驗重復(fù)3次。

1.2.7 Western blot和RT-PCR檢測Bax、CyclinD1和VEGF、TGF-β1蛋白及mRNA表達檢測方法參照1.2.2和1.2.4。Bax F：5'-GTGGAGGAGCTCTT

CAGGGA-3'，R：5'-AGGCACCCAGGGTGATGCAA-3'；CyclinD1 F：5'-GCCGAATTCATGGAACACCAGCT-3'，R：5'-TGCACCTGTAGACTGAGCTCGC-3'；VEGF F：5'-ATGAACTTTCTGCTGTCTTGG-3'；R：5'-TCACCGCCTCGGCTTGTCACA-3'；TGF-β1 F：5'-CTACTACGCCAAAGAAGTCACC-3'，R：5'-GAAATCGGCCCTGTACCGTCTCT-3'。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布，結(jié)果以±s表示，多樣本實驗結(jié)果采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染miRNA-200b后HeLa細胞miRNA-200b表達比較與空白對照組和mimic-NC組相比，miRNA-200b mimic組miRNA-200b表達顯著升高（P＜0.05）?？瞻讓φ战M與mimic-NC組miRNA-200b mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖1）。

圖1 各組miRNA-200b表達Fig.1 miRNA-200b expressions in each group

2.2 miRNA-200b對RhoA的靶向調(diào)控作用驗證雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，miRNA-200b與RhoA基因3′UTR存在互補結(jié)合位點，miRNA-200b和RhoA可靶向結(jié)合。熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染野生型RhoA基因表達載體WT-3′UTR后再轉(zhuǎn)染miRNA-200b mimic細胞的熒光素酶活性與再轉(zhuǎn)染mimic-NC組顯著降低；而轉(zhuǎn)染突變性RhoA基因 表達載 體Mutant-3′UTR后，再轉(zhuǎn) 染miRNA-200b mimic的HeLa細胞熒光素酶活性無明顯抑制作用（圖2）。

圖2 miRNA-200b結(jié)合位點的保守性分析及熒光素酶活性分析Fig.2 Conservative analysis of miRNA-200b binding sites and activity analysis of luciferase

2.3 各組細胞RhoA蛋白和mRNA表達比較與空白對照組和mimic-NC組相比，miRNA-200b mimic組RhoA蛋白及mRNA表達顯著降低，與RhoA-NC組相比，過表達RhoA，RhoA蛋白及mRNA表達顯著升高（P＜0.05）?？瞻讓φ战M與mimic-NC組、RhoA過表達組RhoA蛋白及mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖3）。

圖3 各組RhoA蛋白和mRNA表達Fig.3 RhoA protein and mRNA expressions in each group

2.4 各組細胞增殖和凋亡水平與空白對照組和mimic-NC組相比，miRNA-200b mimic組細胞凋亡比例顯著升高，細胞增殖受到抑制，RhoA過表達組細胞凋亡比例降低，細胞增殖能力顯著增強（P＞0.05）；空白對照組、mimic-NC組、RhoA-NC組細胞凋亡、增殖能力差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖4、5）。

圖4 各組細胞轉(zhuǎn)染后增殖能力Fig.4 Cell proliferation ability after transfection in each group

圖5 各組細胞轉(zhuǎn)染后細胞凋亡能力Fig.5 Cell apoptotic ability in each group after transfection

2.5 各組細胞增殖相關(guān)基因和凋亡相關(guān)基因表達比較與空白對照組和mimic-NC組相比，miRNA-200b mimic組細胞Bax mRNA和蛋白表達顯著升高，而CyclinD1 mRNA和蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；與RhoA-NC組相比，RhoA過表達組Bax mRNA和蛋白表達下降，而CyclinD1 mRNA和蛋白表達升高（P＜0.05，圖6）。

圖6 各組CyclinD1和Bax mRNA、蛋白表達Fig.6 CyclinD1 and Bax mRNA and protein expressions in each group

2.6 各組細胞VEGF、TGF-β1表達比較與空白對照組和mimic-NC組相比，miRNA-200b mimic組細胞VEGF、TGF-β1 mRNA和蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；與RhoA-NC組相比，RhoA過 表 達 組VEGF、TGF-β1 mRNA和蛋白表達顯著升高（P＜0.05，圖7）。

圖7 各組VEGF和TGF-β1 mRNA和蛋白表達Fig.7 VEGF and TGF-β1 mRNA and protein expressions in each group

3 討論

宮頸癌是一種常見婦科惡性腫瘤，是全世界女性，特別是發(fā)展中國家女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因，因此，深入了解參與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因，探討其分子機制具有重要意義。研究表明，miRNA在轉(zhuǎn)錄后通過負調(diào)控靶基因穩(wěn)定性或翻譯效率調(diào)節(jié)基因表達，起致癌或抑癌作用［10］。miRNA-200b家族可在多種人類癌癥中發(fā)揮腫瘤抑制作用［11］。miRNA-200b異常表達在乳腺癌、結(jié)直腸癌和膠質(zhì)瘤細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和轉(zhuǎn)移中起重要作用［12-13］。RhoA在人類多種癌癥中異常表達，并參與腫瘤發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移［14-15］。MA等［16］研究發(fā)現(xiàn)，RhoA是miR-200b下游靶基因，miR-200b通過直接靶向RhoA調(diào)節(jié)血腫瘤屏障滲透性。本研究選擇人宮頸癌細胞HeLa，采用生物信息學驗證miRNA-200b與RhoA的靶向關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-200b與RhoA基因3′UTR存在互補結(jié)合位點；在轉(zhuǎn)染miRNA-200b模擬物后，RhoA表達水平顯著降低。上述結(jié)果均提示RhoA是miRNA-200b的下游靶基因，可能參與宮頸癌發(fā)生發(fā)展。

miRNAs可通過靶向作用mRNA的3′UTR抑制其轉(zhuǎn)錄翻譯，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等多種功能［17］。彭彪等［18］研究報道，miRNA-200b可通過靶向調(diào)控PROM1表達抑制膠質(zhì)瘤細胞侵襲。LIU等［19］研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-144通過雙重靶向RhoA和ROCK1在體外顯著抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲能力，在體內(nèi)抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程復(fù)雜，通常是由于抑癌基因失活和癌基因激活導(dǎo)致細胞周期和生存相關(guān)分子改變。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是血管內(nèi)皮細胞特異性結(jié)合因子，是促進腫瘤血管生成的關(guān)鍵刺激因子［20］。轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）是一種具有雙向調(diào)節(jié)功能的細胞負性免疫調(diào)節(jié)因子，在腫瘤細胞免疫逃逸及免疫抑制過程中發(fā)揮重要負性調(diào)節(jié)作用［21-22］。研究表明，惡性腫瘤患者中血清VEGF水平升高，細胞免疫功能異常減弱；VEGF水平越高，惡性腫瘤患者病情越嚴重，轉(zhuǎn)移和侵襲風險越高［23］。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1、Foxp3蛋白在宮頸癌組織中表達增高，可能在促使宮頸癌細胞免疫逃逸、促進宮頸癌形成及轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用［24-25］。miRNAs被認為是基因表達轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要分子，在不同來源的腫瘤中有差異表達，不僅具有抑癌和致癌潛能，且具有免疫調(diào)節(jié)功能［26］。研究報道，miRNA可參與癌細胞免疫逃逸，從而導(dǎo)致腫瘤細胞免于凋亡而無限增殖［27］。羅衛(wèi)民等［28］發(fā)現(xiàn)，miR-200b可能通過靶向VEGF抑制非小細胞肺癌細胞侵襲。LADAK等［29］研究表明，miR-200b可調(diào)控TGF-β1表達保護氣道上皮細胞免受EMT影響。因此，從miRNA參與腫瘤細胞免疫逃逸角度研究腫瘤增殖、遷移的分子機制，可為腫瘤轉(zhuǎn)移治療提供理論依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miRNA-200b模擬物后，HeLa細胞VEGF、TGF-β1基因表達及細胞增殖能力顯著降低，凋亡水平升高；過表達RhoA基因表達后，VEGF、TGF-β1基因表達及細胞增殖能力明顯升高，凋亡水平下降。提示miRNA-200b通過靶向RhoA抑制HeLa細胞增殖能力并促進其凋亡，可能通過抑制宮頸癌細胞免疫逃逸抑制宮頸癌發(fā)展。

綜上所述，miRNA-200b可通過靶向調(diào)控RhoA抑制HeLa細胞增殖并促進其凋亡，其作用機制可能為miRNA-200b抑制宮頸癌細胞免疫逃逸。因此，從腫瘤免疫逃逸角度為miRNA-200b治療宮頸癌提供了重要依據(jù)，但具體作用機制有待進一步研究。