VEGF調(diào)控肥胖小鼠棕色脂肪組織炎癥反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)及通路的研究①

李思琦 蘆小單 王國(guó)慶 高鴻霞（北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林132013）

肥胖是一種低級(jí)別的慢性炎癥性疾病，與2型糖尿病和胰島素抵抗等代謝紊亂相關(guān)［1］。目前對(duì)肥胖的研究多集中在脂肪組織，而脂肪組織又分為白色脂肪組織（white adipose tissue，WAT）和棕色脂肪組織（brown adipose tissue，BAT）。白色脂肪細(xì)胞的主要作用是儲(chǔ)存能量，而棕色脂肪細(xì)胞參與調(diào)節(jié)能量消耗和快速產(chǎn)熱。近年研究發(fā)現(xiàn)，BAT通過減少脂肪炎癥，能夠抵抗高脂肪飲食（high fat diet，HFD）誘導(dǎo)的肥胖并維持全身葡萄糖穩(wěn)態(tài)［2］。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA/VEGF）參與調(diào)控脂肪組織能量代謝，抑制VEGF表 達(dá) 的小鼠，能 夠抵抗HFD誘導(dǎo)的肥 胖［3］。但VEGF調(diào)控BAT能量代謝的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

RNA-Seq是近年發(fā)展起來(lái)的一種基于序列分析的檢測(cè)整體轉(zhuǎn)錄組表達(dá)的方法。同早期的技術(shù)方法相比，如微列陣，RNA-Seq具有更廣泛的動(dòng)態(tài)范圍和更高的檢測(cè)低豐度轉(zhuǎn)錄本的靈敏度，允許檢測(cè)更多的差異表達(dá)基因和更高的折疊變化［4］。本研究利用VEGF可逆抑制轉(zhuǎn)基因小鼠，通過RNA-Seq建立了BAT轉(zhuǎn)錄組圖譜，并篩選出VEGF正常表達(dá)組BAT和VEGF抑制表達(dá)組BAT中差異表達(dá)的基因，對(duì)其進(jìn)行功能注釋（GO）和信號(hào)通路（KEGG）富集分析，以探究VEGF調(diào)控BAT炎癥反應(yīng)的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物文獻(xiàn)［3］報(bào)道過四環(huán)素調(diào)節(jié)VEGF可逆抑制小鼠模型，小鼠飼養(yǎng)于東北師范大學(xué)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。溫度（22±2）℃，濕度40%～70%，12 h/12 h光暗循環(huán)，可自由獲取食物和水。所有程序均獲得東北師范大學(xué)動(dòng)物護(hù)理與使用委員會(huì)批準(zhǔn)。將小鼠分為VEGF正常表達(dá)組（dox+組）和VEGF抑制表達(dá)組（dox-組），每組6～10只，所有小鼠選用基因型：VEGFtetO/tetO：bAKtg，小鼠出生后喂食普通飼料4周后換成高脂飼料喂養(yǎng)，持續(xù)8周。

1.1.2 試劑TRIzol、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；iScript RT-PCR、SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；MinuteTM動(dòng)物組織總蛋白提取試劑盒購(gòu)自北京Invent生物技術(shù)有限公司；VEGF抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；β-actin購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 熒光定量PCR（real-time PCR，RT-PCR）以TRIzol法從小鼠肩胛BAT中提取總RNA。按照說明書使用iScript RT-PCR試劑盒對(duì)純化的1μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。依據(jù)SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說明書取2 μl cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)。RT-PCR分析在7500fast real-time PCR系統(tǒng)上進(jìn)行，PCR條件為：98℃5 min，98℃30 s，72℃1 min，40個(gè)循環(huán)。在實(shí)驗(yàn)中以18s為內(nèi)參照，用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequences

1.2.2 Western blot取小鼠肩胛處BAT，按照MinuteTM動(dòng)物組織總蛋白提取試劑盒說明書提取組織總蛋白。酶標(biāo)儀測(cè)定蛋白濃度后，將20μg/孔的蛋白質(zhì)樣品裝入10%SDS聚丙烯酰胺凝膠中，PVDF膜濕轉(zhuǎn)2 h，隨后用溶于TBST中的5%脫脂牛奶的封閉1 h。VEGF、β-actin在搖床上4℃過夜孵育（TBS緩沖液=1：1 000），然后TBST洗滌3次，5 min/次，并在室溫下與HRP標(biāo)記的二抗（TBS緩沖液=1：2 000）孵育2 h。以β-actin為內(nèi)參，通過化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒在成像系統(tǒng)上對(duì)蛋白信號(hào)條帶進(jìn)行分析，Image J圖像處理與分析軟件具體量化蛋白信號(hào)值。

1.2.3 RNA文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序提取的RNA經(jīng)8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA降解程度以及是否有污染。文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序均由華大基因公司（BGI）完成。具體的步驟如下：采用mRNA富集法處理total RNA。mRNA富集：以帶有OligodT的磁珠富集含polyA尾的mRNA。以打斷buffer將獲得的RNA片段化，隨機(jī)的N6引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再合成cDNA雙鏈形成雙鏈DNA。將合成的雙鏈DNA末端補(bǔ)平并5'端磷酸化，3'端形成突出1個(gè)“A”的黏末端，再連接1個(gè)3'端有凸出“T”的鼓泡狀接頭。連接產(chǎn)物通過特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物熱變性成單鏈，再用1段橋式引物將單鏈DNA環(huán)化得到單鏈環(huán)狀DNA文庫(kù)。對(duì)構(gòu)建好的文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)檢，合格后測(cè)序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析通過HISAT軟件將測(cè)序獲得的核苷酸長(zhǎng)度（reads）比對(duì)至小鼠全基因組。使用DEG-seq軟件包計(jì)算基因差異表達(dá)情況。根據(jù)差異表達(dá)倍數(shù)、P值和表達(dá)量（FPKM）篩選差異表達(dá)的mRNA（差異倍數(shù)＞1.5，P＜0.05且FPKM＞0.5）。利用華大公司提供的DR.TOM操作系統(tǒng)對(duì)篩選出的差異基因進(jìn)行GO分析和KEGG通路分析，P＜0.05為顯著富集。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理本研究數(shù)據(jù)采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以±s表示，進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF在BAT中的表達(dá)受到抑制利用已有的四環(huán)素調(diào)節(jié)VEGF可逆抑制小鼠模型，使研究者能夠通過給藥強(qiáng)力霉素（一種四環(huán)素類似物）可逆地調(diào)節(jié)VEGF表達(dá)。當(dāng)鼠糧中含有強(qiáng)力霉素（200 mg/kg）時(shí)，tetR蛋白與dox結(jié)合，不與tetO結(jié)合，VEGF能夠正常表達(dá)。在常規(guī)食物中，tetR與tetO結(jié)合，則抑制了VEGF表達(dá)（圖1A）。RT-PCR結(jié)果顯示，VEGF mRNA水平在BAT中下降40%（圖1B）。Western blot結(jié)果顯示，BAT中的VEGF蛋白下降12%（圖1C、D）。

圖1 VEGF在BAT組織中的表達(dá)受到抑制Fig.1 Expression of VEGF in BAT is suppressed

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 基因的功能注釋以1.5倍表達(dá)差異、P＜0.05且FPKM＞0.5為條件篩選差異表達(dá)基因，共篩選出953個(gè)差異基因，dox-組與dox+組相比，發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因402個(gè)，下調(diào)基因551個(gè)；對(duì)差異基因進(jìn)行GO注釋分析，953個(gè)基因在GO注釋中被分為3大類：生物學(xué)過程（biological process）、細(xì)胞組分（cellular component）、分子功能（molecular function）（圖2）。這些基因主要參與細(xì)胞過程、代謝過程、免疫系統(tǒng)進(jìn)程和黏附等生物學(xué)過程。

圖2 差異表達(dá)基因GO注釋分類Fig.2 GO annotation of differentially expressed genes

2.2.2 差異基因KEGG通路分析KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果顯示，富集最為顯著的是細(xì)胞因子受體相互作用。此外，在富集前20位的信號(hào)通路中，還包括鈣信號(hào)通路、胰島素分泌信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路等（圖3）。其中IL-17信號(hào)通路與細(xì)胞增殖、凋亡、代謝及中性粒細(xì)胞的募集密切相關(guān)。富集到此通路的差異表達(dá)基因包括鈣結(jié)合蛋白S100a9、S100a8、基質(zhì)金屬蛋白3（MMP3）、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（Lcn2）、IL-6，這些基因在dox-組的相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)（P＜0.05，表2）。

表2 富集到“IL-17信號(hào)通路”的基因Tab.2 Genes enriched to"IL-17 signaling pathway"

圖3 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析Fig.3 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes

2.3 RT-PCR驗(yàn)證為了驗(yàn)證VEGF抑制之后差異表達(dá)基因富集到“IL-17信號(hào)通路”的表達(dá)量變化的真實(shí)可靠性，本研究選擇顯著上調(diào)的5個(gè)差異表達(dá)基因（S100a9、S100a8、MMP3、Lcn2、IL-6），設(shè)計(jì)特異性引物后進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，dox-組較dox+組表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05，圖4），與RNA-seq顯示的變化趨勢(shì)基本一致。

圖4 qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組結(jié)果Fig.4 Validation of transcription results with qRT-PCR

3 討論

肥胖已成為一個(gè)全球性的健康問題，可導(dǎo)致多種代謝性疾病的發(fā)展，如心血管疾病、2型糖尿病和癌癥。目前普遍認(rèn)為，食用高熱量食物是導(dǎo)致全球肥胖發(fā)病率上升的主要原因之一。因此，飲食引起的肥胖對(duì)脂肪組織的影響值得關(guān)注。WAT是主要的脂肪倉(cāng)庫(kù)，用于儲(chǔ)存能量。BAT是一種線粒體含量豐富、產(chǎn)熱能力強(qiáng)的脂肪組織，專門用于產(chǎn)熱和消耗儲(chǔ)存能量［5］。然而，相對(duì)于WAT在HFD誘導(dǎo)的肥胖發(fā)展過程中的研究，針對(duì)BAT的研究相對(duì)較少。最近的研究已經(jīng)明確，成年人類體內(nèi)也有棕色脂肪，主要集中在頸部、鎖骨和脊髓等代謝比較活躍的部位，其活性在寒冷環(huán)境中增加［6-7］。鑒于BAT能夠燃燒能量，生物醫(yī)學(xué)界對(duì)BAT的研究越來(lái)越多，因?yàn)槠湓谥委煼逝趾头逝窒嚓P(guān)并發(fā)癥方面具有治療潛力［8-9］。

肥胖與慢性低級(jí)別炎癥有關(guān)。當(dāng)受試者喂食高脂飲食時(shí)，過剩的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)會(huì)增加脂肪組織中脂質(zhì)儲(chǔ)存，并伴隨免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)及炎癥趨化因子的增加，最終導(dǎo)致代謝功能障礙的發(fā)展，對(duì)人體健康產(chǎn)生負(fù)面影響［10-11］。本研究用VEGF可逆抑制小鼠模型揭示了抑制VEGF表達(dá)可增加小鼠BAT炎癥反應(yīng)，并且與IL-17信號(hào)通路密切相關(guān)。使用RNA-Seq測(cè)序分析抑制VEGF表達(dá)組與正常VEGF表達(dá)組的差異表達(dá)基因，并對(duì)這些基因進(jìn)行GO功能和KEGG信號(hào)通路分析，發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)基因參與機(jī)體的多種生物學(xué)過程，尤其是細(xì)胞過程、代謝過程、免疫系統(tǒng)過程的調(diào)節(jié)；KEGG富集分析結(jié)果表明IL-17信號(hào)通路在VEGF抑制表達(dá)的BAT中起重要作用，且富集于該通路的基因S100a9、S100a8、MMP3、Lcn2、IL-6表達(dá)量顯著上調(diào)，表明VEGF可能通過調(diào)控IL-17信號(hào)通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)，參與BAT的炎癥反應(yīng)調(diào)控。

IL-17是輔助性T細(xì)胞（helper T cell，Th）亞群的標(biāo)志細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)天然免疫細(xì)胞（如中性粒細(xì)胞）的擴(kuò)張和吸收，并與Toll樣受體（TLR）配體、IL-1β和TNF-α協(xié)同作用，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，刺激β防御素和其他抗菌肽的產(chǎn)生［12］。IL-17在成纖維細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)能夠激活NF-κB并誘導(dǎo)NF-κB依賴性細(xì)胞因子進(jìn)而促進(jìn)炎癥產(chǎn)生［13］。隨后的研究發(fā)現(xiàn)了IL-17調(diào)控的主要炎癥基因，包括促炎細(xì)胞因子（IL-6、IL-1、TNF等）、趨化因子（CXCL1、CCL2、IL-8等）、抗菌肽（β防御素、S100蛋白、Lcn2等）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和炎癥效應(yīng)因子［13-14］。JIN等［15］研究發(fā)現(xiàn)，IL-17可通過誘導(dǎo)S100A8和S100A9的表達(dá)介導(dǎo)特應(yīng)性皮炎的炎癥反應(yīng)。此外，IL-17家族還可通過其相應(yīng)的受體，激活包括NF-κB、MAPK和C/EBPs在內(nèi)的下游通路，誘導(dǎo)抗菌肽、細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)［13，16-17］。新的臨床研究表明，IL-17在肥胖人群中的表達(dá)水平較高［18］。飲食誘導(dǎo)的肥胖增加了Th17細(xì)胞在脂肪組織和脾臟中的分化，阻斷IL-17可減輕脂肪組織炎癥、促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化以及葡萄糖攝取［19-21］。因此，IL-17在代謝中的作用具有直接臨床意義。

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)分析及對(duì)關(guān)鍵基因表達(dá)的驗(yàn)證，證實(shí)了VEGF對(duì)BAT中免疫炎癥因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，當(dāng)VEGF的表達(dá)受到抑制時(shí)，BAT的炎癥反應(yīng)加劇，這一調(diào)控機(jī)制可能通過激活I(lǐng)L-17信號(hào)通路，上調(diào)相關(guān)炎癥基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。