多肽膠束負(fù)載二氫卟吩e6促進(jìn)小鼠骨髓源性樹突狀細(xì)胞抗原呈遞功能的研究①

王策 吳瑩娟 蘇少玩 李富榮（深圳市人民醫(yī)院（暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，南方科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院）轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，深圳518020）

基于蛋白質(zhì)/肽載體構(gòu)建的治療性癌癥疫苗作為一種有前途的癌癥免疫療法通過激發(fā)患者的抗癌免疫消除癌細(xì)胞［1］。有效的抗癌疫苗應(yīng)該能觸發(fā)CD8+T細(xì)胞活化及抗腫瘤細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）反應(yīng)，需要MHCⅠ類（MHCⅠ）抗原提呈細(xì)胞如樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）和巨噬細(xì)胞［1-2］。獲得最佳MHCⅠ抗原呈現(xiàn)，蛋白質(zhì)/肽抗原需要降解變成小肽，主要通過蛋白酶體途徑。然而腫瘤衍生的蛋白質(zhì)或肽抗原通常經(jīng)過內(nèi)/溶酶體途徑，更有利于MCHⅡ而不是MHCⅠ抗原呈遞［2-3］。因此，增強(qiáng)腫瘤抗原的MHCⅠ類抗原提呈有望提高癌癥疫苗的功效。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）作為細(xì)胞內(nèi)的副產(chǎn)物氧化磷酸化，參與先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)［4］。既往研究表明，激光或過氧化氫引發(fā)的ROS可作為一種“危險”信號促進(jìn)DC成熟并增強(qiáng)其促進(jìn)T細(xì)胞增殖的能力［5］。近期研究表明，ROS不僅會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的氧化損傷，也可增強(qiáng)蛋白酶體的激活，從而成為病毒感染組織中增強(qiáng)MHCⅠ遞呈的關(guān)鍵機(jī)制［6-7］。然而，ROS是否參與抗原提呈細(xì)胞中可溶性抗原的交叉遞呈尚不清楚。

ROS誘導(dǎo)劑種類多樣，其中二氫卟吩e6（chlorin e6，Ce6）因其產(chǎn)生單線態(tài)氧的效率很高被廣泛應(yīng)用，故適合開發(fā)用于光動力治療［8］。迄今為止，大部分光敏劑都表現(xiàn)為疏水性，在溶液中容易聚集，故在實際應(yīng)用中面臨困難。由此以納米顆粒、聚合物類、糖類、脂類等為基礎(chǔ)的納米探針逐漸發(fā)展，成為Ce6實際應(yīng)用的新型模式［9-11］。

多肽所具備的惰性使其性質(zhì)相對穩(wěn)定且安全，同時具有合成方法簡單、易修飾、生物相容性好等優(yōu)點［12］。聚多肽作為一種研究較為成熟的納米材料，不僅是一種理想的光熱轉(zhuǎn)換材料，且可作為藥物載體，因此在多種疾病診療一體化的研究中得到廣泛應(yīng)用［13-15］。

本研究將多肽作為載體，與光敏劑Ce6物理吸附后形成多肽膠束（polypeptide micelles，PM）＠Ce6。本文比較PM＠Ce6與Ce6對DC的抗原呈遞效果，及其在治療肺癌中潛在的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料O-（2-氨基乙基）-O'-（2-甲基）聚乙二醇（PEG-NH2，Mw=2 000）購自Sigma公司；L-亮氨酸（LLeu）和ε-芐氧羰基-L-賴氨酸（LLZ）購自德國勞氏生物化工有限公司；卵清蛋白（OVA，V級）購自Sigma公司；Ce6購自百靈威公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自Hyclone公司；X-vivo 15培養(yǎng)基購自Lanza公司；新生牛血清（NBS）購自Gibco公司；Annexin VFITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自翊圣生物公司；MTT及Hoechst 33342染色液購自Sigma公司；2，7-二氯二氫熒光素乙酸酯（DCFH-DA）購自Sigma公司；5，6-羧熒光素二乙酸酯琥珀酰亞胺酯（CFSE）購自Invitrogen公司；氯化二亞苯基碘（DPI，NADPH氧化酶抑制劑）購自Sigma公司；重組小鼠GM-CSF、IL-4和IL-2購自Peprotech公司；熒光標(biāo)記抗鼠單克隆抗體購買抗體（CD8和CD11c）購自eBioscience公司；蛋白酶體活性熒光分析試劑盒購自Biovision公司；小鼠細(xì)胞因子ELISA試劑盒（IFN-γ）購自BioLegend公司；CD8+T細(xì)胞純化試劑盒購自Miltenyi Biotec公司；6～8周齡C57BL/6J小鼠購自廣東省實驗動物中心；紫外分光光度計購自美國Agilent公司；酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher公司；TCS SP5Ⅱ型激光共聚焦顯微鏡購自德國Leica公司；Beckman-Coulter型流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼公司。

1.2 方法

1.2.1 PM＠Ce6的制備及其形態(tài)學(xué)觀察采用N-羧酸酐（NCA）開環(huán)聚合法合成PEG-PLL-PLLeu共聚物。首先以PEG-NH2為引發(fā)劑，通過開環(huán)聚合法合成PEG-PLLZ共聚物。其次，采用PEG-PLLZ引發(fā)L-亮氨酸N-羧酸酐（LLeu-NCA）的開環(huán)聚合，合成了PEG-PLLZ-PLLeu共 聚 物。PEG-NH2與LLZ-NCA、LLeu-NCA的摩爾比為1：30：40。然后用冷凍干燥法收集產(chǎn)物，用Bruker-400 mhz核磁共振儀進(jìn)行分析。最后將適量的Ce6加入PM溶液，37℃恒溫振蕩箱中避光孵育12 h，離心洗滌得到PM＠Ce6。取適量合成的PM＠Ce6懸液，通過粒徑儀檢測平均粒徑及分布情況。PM＠Ce6濃度以負(fù)載上的Ce6計算：通過紫外分光光度計測定并得到Ce6標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算包封率。

1.2.2 小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞（BMDC）的培養(yǎng)和刺激BMDC來源于C57BL/6小鼠骨髓［16］。小鼠骨髓在含GM-CSF（20 ng/ml）和IL-4（10 ng/ml）的X-vivo 15培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)6 d，獲得未成熟DC。

1.2.3 PM＠Ce6經(jīng)激光后對BMDC產(chǎn)生ROS的作用首先，BMDCs以1×106個/孔接種于預(yù)先包被多聚賴氨酸的共聚焦培養(yǎng)皿，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。實驗分成5組：①OVA處理組：10μg/ml OVA處理20 h；②Ce6/OVA處理組：15 μg/ml Ce6和10 μg/ml OVA作用20 h；③Ce6/OVA+DPI處理組：提前2 h加入5 mmol/L DPI，再加入15 μg/ml Ce6和10 μg/ml OVA作用20 h；④PM＠Ce6/OVA處理組：15μg/ml的PM＠Ce6和10μg/ml OVA作用20 h；⑤PM＠Ce6/OVA+DPI處理組：提前2 h加入5 mmol/L DPI，再 加 入15 μg/ml的PM＠Ce6和10 μg/ml OVA作用20 h。吸棄上清，PBS洗滌2次后，加入1 ml培養(yǎng)基，用波長為633 nm的He-Ne NIR照射6 min后繼續(xù)避光孵育4 h。吸棄上清，PBS洗滌2次后，加入含20 mmol/L DCFH-DA無血清培養(yǎng)基1 ml，于37℃下孵育30 min。吸棄上清，PBS洗滌2次，激光共聚焦觀察ROS表達(dá)情況。另取一部分BMDCs以1×106個/孔接種于24孔板，重復(fù)上述操作，流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度，以平均熒光強(qiáng)度代表ROS含量，實驗重復(fù)3次。

1.2.4 PM＠Ce6經(jīng)激光后對DC蛋白酶體活性的影響為了測定蛋白酶體活性，將實驗按1.2.3中方法分成5組。然后利用熒光分析試劑盒評估蛋白酶體活性。吸棄上清，PBS洗滌2次后，樣本孔加入50μl含0.5%NP-40的PBS裂解細(xì)胞，補(bǔ)加蛋白酶體分析緩沖液至100μl。設(shè)陽性對照孔：10μl陽性對照物，補(bǔ)加蛋白酶體分析緩沖液至100μl。另設(shè)抑制劑對照組：重復(fù)上述操作，每孔加1μl蛋白酶體抑制劑。對應(yīng)孔加1μl蛋白酶體分析緩沖液。最后將上述各孔均加入蛋白酶體底物1μl，避光混勻。37℃下酶標(biāo)儀檢測Ex/Em=350/440 nm處各孔30～60 min熒光動力學(xué)變化。T1讀取不含蛋白酶體抑制劑孔的蛋白酶體活性值RFU1和含蛋白酶體抑制劑孔的非蛋白酶體活性值iRFU1。30 min后，讀取T2時的RFU2和iRFU2。蛋白酶體活性產(chǎn)生ΔRFU=（RFU2–iRFU2）-（RFU1-iRFU1），然后將ΔRFU應(yīng)用于AMC標(biāo)準(zhǔn)曲線得到B值。T1和T2間產(chǎn)生的蛋白酶體活性=B/（T2-T1）/預(yù)處理樣本體積×樣本稀釋倍數(shù)。

1.2.5 PM＠Ce6經(jīng)激光后對DC抗原提呈的作用檢測BMDC誘導(dǎo)的CD8+和CD4+T細(xì)胞增殖［17］。首先按1.2.3中方法，分別獲得OVA、Ce6/OVA、Ce6/OVA+DPI、PM＠Ce6/OVA、PM＠Ce6/OVA+DPI處理的BMDCs。其次獲得OVA特異性T細(xì)胞，6～8周雌性C57BL/6小鼠腹腔注射20μg OVA+20μg佐劑PolyI：C，每周1次，連續(xù)免疫3次［17-18］。最后1次免疫后7 d，獲取小鼠脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，用CD8+T細(xì)胞純化試劑盒負(fù)性分選純化脾臟中CD8+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞純度大于90%。具體方法：將細(xì)胞懸液300 g離心10 min，吸去上清。加入40μl/107個細(xì)胞的緩沖液和10μl/107個細(xì)胞的生物素抗體混合物，混合均勻后，4℃孵育10 min。然后加入30μl/107個細(xì)胞的緩沖液和20μl/107個細(xì)胞的抗生物素磁珠，混合均勻后，4℃孵育15 min。加入2 ml緩沖液，300 g離心10 min。以500μl緩沖液重懸細(xì)胞。先將色譜柱置于MACS分離器的磁場中，然后將細(xì)胞懸液滴入柱內(nèi)，收集流出未標(biāo)記的細(xì)胞，表示CD8+T細(xì)胞。另外回收柱內(nèi)細(xì)胞，利用CD4作為表面標(biāo)志通過分選型流式細(xì)胞儀進(jìn)一步純化，獲得CD4+T細(xì)胞。

最后分別將上述獲得CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞進(jìn)行CFSE預(yù)標(biāo)記。5 μmol/L CFSE溶液制備細(xì)胞懸液（1×107個/ml），室溫下避光孵育10 min后，加入等體積全培養(yǎng)液混勻，4℃下1 400 r/min離心5 min，重復(fù)洗滌1次。分別將CFSE標(biāo)記的CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞與上述獲得的不同處理的BMDCs按10：1和5：1接種于24孔培養(yǎng)板，于37℃、5%CO2條件下用培養(yǎng)48 h。流式細(xì)胞術(shù)檢測CFSElowCD8+T細(xì)胞的增殖代表BMDC的MHCⅠ抗原呈遞，CF SElowCD4+T細(xì)胞的增殖代表BMDC的MHCⅡ抗原呈遞。ELISA法檢測培養(yǎng)上清液中IFN-γ含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用Graphpad Prism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，組間數(shù)據(jù)資料對比采用ANOVA分析，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PM＠Ce6的表征

2.1.1 PM＠Ce6的粒徑使用粒徑儀檢測合成的PM/OVA、PM＠Ce6和PM＠Ce6/OVA的粒徑大小。PM＠Ce6的粒徑分布情況如圖1所示，PM＠Ce6粒徑在170 nm左右，且粒徑較均一。

圖1 PM＠Ce6粒徑分布Fig.1 Size distribution of PM＠Ce6

2.1.2 PM＠Ce6的形態(tài)對PM/OVA、PM＠Ce6和PM＠Ce6/OVA納米復(fù)合物在PBS溶液中的穩(wěn)定性進(jìn)行檢測，結(jié)果表明PM/OVA、PM＠Ce6和PM＠Ce6/OVA納米復(fù)合物在4℃的PBS溶液中放置2周后，顆粒大小均一，穩(wěn)定性良好（圖2）。

圖2 PM＠Ce6的穩(wěn)定性Fig.2 Stability of PM＠Ce6

2.1.3 探針PM＠Ce6包封率Ce6的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示，y=0.000 825x+0.135，該曲線中各點較均勻地分散在曲線兩側(cè)，分散系數(shù)為0.999，說明該標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合程度高，誤差小，可以進(jìn)一步應(yīng)用。本研究計算得出PM＠Ce6中Ce6的包封率約為47%。

圖3 Ce6的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of Ce6

2.1.4 紫外分光光度計表征分別將Ce6和PM＠Ce6溶液分散于超純水中，紫外分光光度計測定情況如圖4。Ce6在波長400 nm和660 nm有特征峰，探針PM＠Ce6在相應(yīng)波長處也出現(xiàn)了與Ce6相同的特征峰，說明Ce6已成功負(fù)載到該納米多肽PM＠Ce6中。

圖4 Ce6和PM＠Ce6的紫外可見吸收光譜Fig.4 UV-Vis spectrophotometry of Ce6 and PM＠Ce6

2.2 PM＠Ce6通過增強(qiáng)ROS激活蛋白酶體活化PM＠Ce6或Ce6與DC細(xì)胞共孵育20 h后，經(jīng)NIR照射，再孵育4 h。共聚焦觀察結(jié)果顯示，Ce6單獨輕微誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，而PM＠Ce6顯著增強(qiáng)ROS產(chǎn)生。表明在激光照射下，PM＠Ce6較Ce6對BMDC有更好的增強(qiáng)ROS的效果。另外，采用抗氧化劑DPI阻斷后，明顯抑制ROS產(chǎn)生（圖5A）。流式檢測結(jié)果顯示，PM＠Ce6/OVA組與OVA組相比，ROS表達(dá)上調(diào)2.5倍?？寡趸瘎〥PI阻斷后PM＠Ce6/OVA組ROS表達(dá)顯著降低（P＜0.01，圖5B）。

圖5 PM＠Ce6對BMDCs產(chǎn)生ROS的影響Fig.5 Effect of PM＠Ce6 on ROS production by BMDCs

此外，如圖6所示，PM＠Ce6/OVA 2倍提高蛋白水解酶活性，而預(yù)處理DPI后顯著降低蛋白酶體活性。且蛋白酶體活性與BMDC中的ROS含量成正相關(guān)（圖7）。這些數(shù)據(jù)表明，PM＠Ce6/OVA可通過觸發(fā)ROS提高蛋白酶體活性。

圖6 PM＠Ce6對BMDCs蛋白酶體的活化影響Fig.6 Effect of PM＠Ce6 on proteasome activity by BMDCs

圖7 蛋白酶體與ROS相關(guān)性分析Fig.7 Correlation analysis of proteasome and ROS

2.3 PM＠Ce6顯著增強(qiáng)DC抗原呈遞效果圖8A～C顯示，PM＠Ce6顯著增強(qiáng)MCHⅠ抗原呈遞，而DPI預(yù)處理后，CD8+T細(xì)胞增殖明顯受到抑制（圖8B），同時降低IFN-γ產(chǎn)生（圖8C）。此外，研究結(jié)果顯示，Ce6和PM＠Ce6也能增強(qiáng)CD4+CFSElowT細(xì)胞增殖，并上調(diào)IFN-γ表 達(dá)。但PM＠Ce6比Ce6更 顯 著 地 增 強(qiáng)CD4+CFSElowT細(xì)胞增殖。值得注意的是，DPI預(yù)處理后，PM＠Ce6和PM對CD4+T細(xì)胞增殖并沒有受到抑制，同時對IFN-γ表達(dá)也沒有明顯改變（圖8D、E）。

圖8 PM＠Ce6對MHC抗原呈遞作用Fig.8 Effect of PM＠Ce6 on MHC antigen presentation

3 討論

隨著納米技術(shù)的發(fā)展，一系列基于自組裝納米膠束的非病毒載體為實現(xiàn)基因治療的臨床應(yīng)用提供了重要思路和保障［19］。其中，以兩親性多肽共聚物為骨架的納米顆粒在結(jié)構(gòu)上與天然蛋白相似，具有生物安全性好和可生物降解等優(yōu)點，因而成為研究者近年來關(guān)注的焦點［20］。多肽共聚物納米載體的核酸負(fù)載和轉(zhuǎn)染能力與其氨基酸序列直接相關(guān)。RYU等［21］報道在精氨酸-纈氨酸納米膠束中增加精氨酸的數(shù)量可顯著提高其轉(zhuǎn)染效率。張先正課題組合成了一系列聚組氨酸-賴氨酸納米顆粒，結(jié)果表明改變氨基酸的序列和數(shù)量均可顯著改善納米顆粒的核酸負(fù)載能力及轉(zhuǎn)染效率［22］。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，改變PEG-PLL-PLLeu多肽納米膠束中疏水性氨基酸聚合度不但可改善納米顆粒的生物相容性，還能提高其核酸負(fù)載能力。與此同時，增加賴氨酸的數(shù)量則顯著提高納米膠束在體內(nèi)外的轉(zhuǎn)染效率［23］。

本研究先用PEG-NH2與N-羧酸酐（NCA）以開環(huán)聚合法合成PEG-PLL-PLLeu共聚物，再物理吸附上光敏劑Ce6，形成具有光敏功能的PM＠Ce6。根據(jù)粒徑儀觀察結(jié)果表明PM＠Ce6顆粒大小約為170 nm，粒徑均一，4℃存放2周穩(wěn)定性良好。本研究中PM＠Ce6濃度以負(fù)載上的Ce6計算，得到Ce6的包封率約為47%。Ce6和PM＠Ce6溶液的紫外分光光度圖顯示，納米顆粒PM＠Ce6在波長400 nm和660 nm處與光敏劑Ce6具有相似的特征峰，說明PM＠Ce6中已成功負(fù)載光敏劑Ce6［24］。

越來越多的證據(jù)表明ROS在調(diào)節(jié)先天免疫和適應(yīng)性免疫，如多形核白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞遷移、淋巴細(xì)胞活化和分化以及炎癥應(yīng)答中發(fā)揮重要作用［4］。近期研究也發(fā)現(xiàn)納米顆粒誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS也是一種誘導(dǎo)DC成熟的重要調(diào)控因子［16，25］。本研究發(fā)現(xiàn)，在NIR照射下，PM＠Ce6較Ce6更能顯著上調(diào)BMDC產(chǎn)生ROS，通過DPI對BMDC進(jìn)行預(yù)處理可有效阻止ROS的產(chǎn)生。

另一方面在抗原遞呈細(xì)胞中，如DC和巨噬細(xì)胞，蛋白酶體也是抗原的關(guān)鍵酶，限制性處理MHC I抗原提呈［6］。有研究表明，自由基，如ROS和過氧亞硝酸鹽，可提高蛋白酶體活性，繼而促進(jìn)去氧化發(fā)生，從而維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)定［26-27］。然而，ROS是否參與可溶性抗原的交叉表達(dá)仍不清楚。在本研究中，BMDC被OVA、Ce6/OVA或PM＠Ce6/OVA作用20 h，結(jié)果表明PM＠Ce6/OVA與OVA相比，可顯著增強(qiáng)蛋白體活性，而預(yù)處理DPI后蛋白酶體活性顯著降低。

此外，本研究表明，蛋白酶體活性與BMDC中的ROS呈正相關(guān)。表明在激光照射下，PM＠Ce6/OVA通過觸發(fā)ROS產(chǎn)生提高蛋白酶體活性。PM＠Ce6較Ce6更顯著地增強(qiáng)MCHⅠ抗原呈遞，而DPI預(yù)處理后，CD8+T細(xì)胞增殖明顯受到抑制，同時也降低IFN-γ產(chǎn)生，這結(jié)果也與上述蛋白酶體活性的抑制作用一致。值得注意的是，DPI預(yù)處理后，PM＠Ce6和Ce6對CD4+T細(xì)胞增殖并沒有受到抑制，對IFN-γ表達(dá)也沒有明顯改變。提示ROS可能不是影響MHCⅡ抗原呈遞的關(guān)鍵條件。

綜上所述，本文基于多肽膠束PM負(fù)載光敏劑Ce6制備新型NIR刺激響應(yīng)的PM＠Ce6載體，其通過NIR照射產(chǎn)生ROS，從而增強(qiáng)DC中蛋白酶體活性和下游MHCⅠ抗原呈遞。因此，光敏響應(yīng)的PM＠Ce6有望成為腫瘤疫苗研制的有效載體。