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    同步輻射共聚焦X射線熒光微探針技術(shù)在生物原位研究中的應(yīng)用

    2021-08-20 02:30:54林曉勝張麗麗李愛國
    核技術(shù) 2021年8期
    關(guān)鍵詞:化學元素擬南芥原位

    林曉勝 張麗麗 何 燕 鄭 怡 閆 帥 李愛國

    1(中國科學院上海應(yīng)用物理研究所 上海201800)

    2(中國科學院大學 北京100049)

    3(中國科學院上海高等研究院 上海201210)

    基于同步輻射光源的X射線熒光微探針技術(shù)(Synchrotron Radiation micro X-ray Fluorescence,μ-SRXRF)由于其高探測靈敏度、對樣品的低損傷性、可分析厚樣品以及可在大氣和水環(huán)境下測量等優(yōu)點,為研究生物樣品的化學元素分布及化學態(tài)變化提供了強大的技術(shù)支持,在生物及環(huán)境等研究領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用[1-6]。然而,在常規(guī)μ-SRXRF實驗中,由于探測器方向上沒有任何限制,在入射光路徑上不同深度的樣品發(fā)射出的X射線熒光(X-ray Fluorescence,XRF)都可被探測器接收,因此探測到的XRF圖像不具有深度分辨信息。為獲得深度方向的信息,通常需要對樣品進行切片后再掃描,而切片制樣過程可能破壞樣品的真實結(jié)構(gòu)。共聚焦μ-SRXRF是一種具有深度分辨的三維元素分析方法[7-13],其原理最先由Gibson和Kumakhov在1992年提出[14]。當入射X射線的焦點與置于探測器前端的毛細管光學元件的焦點重疊時(即共聚焦狀態(tài)),只有焦點重疊區(qū)域的樣品發(fā)射的XRF信號才能夠滿足全反射條件被探測器探測接收,以此來選擇性地采集不同深度的XRF信號。因此共聚焦μ-SRXRF在生物原位研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。

    此外,對于含水量較多的生物樣品,這些樣品在實驗前期的脫水及干燥過程中很可能會導(dǎo)致其離子成分的丟失或結(jié)構(gòu)的收縮、變形甚至崩解等問題[15-17],不能完整反映樣品的真實信息。在μ-SRXRF實驗過程中,由于長時間受到高通量X射線的照射,生物樣品內(nèi)大量積累的熱量可能會破壞其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。為獲得可信的結(jié)果,越來越多的研究人員希望無需復(fù)雜的制樣過程就可獲得生物樣品中感興趣元素的二維/三維分布和成像信息,并希望在μ-SRXRF實驗中能夠保持低溫檢測環(huán)境,可直接對熱敏感的含水生物樣品進行檢測。國外如歐洲同步輻射光源(European Synchrotron Radiation Facility,ESRF)的ID16A[18]、美 國 先 進 光 源(Advanced Photon Source,APS)的21-ID-D[19-20]和德國PETRA III的P06[21]等X射線熒光微探針光束線站都已經(jīng)發(fā)展了針對生物和環(huán)境樣品的低溫X射線熒光微探針技術(shù)。因此,在上海同步輻射光源(Shanghai Synchrotron Radiation Facility,SSRF)硬X射線微聚焦及應(yīng)用光束線站(BL15U1)發(fā)展共聚焦μ-SRXRF及低溫原位檢測技術(shù)非常必要,可以擴展BL15U1線站的檢測分析能力,滿足生物和環(huán)境等用戶對于原位研究的需求,提高其研究結(jié)果的可信度。

    1 共聚焦X射線熒光微探針技術(shù)實驗裝置及低溫原位裝置

    在上海同步輻射光源BL15U1線站搭建了共聚焦μ-SRXRF的實驗裝置及低溫原位裝置,其示意圖及裝置實物圖如圖1和圖2所示。

    圖1 同步輻射共聚焦X射線熒光微探針裝置和低溫原位裝置的示意圖Fig.1 The schematic of confocalμ-SRXRF setup and in-situ cryogenic device at BL15U1 of the SSRF

    圖2 同步輻射共聚焦X射線熒光微探針實驗裝置和低溫原位裝置的實物圖Fig.2 Physical picture of confocalμ-SRXRF and in-situ cryogenic device at BL15U1 of the SSRF

    BL15U1線站采用平面波蕩器(IV-undulator)作為輻射光源,同時采用雙晶單色器(ΔE/E≈10-4)對同步輻射光進行單色化,光子能量范圍為3.5~22.5 keV。X射線經(jīng)過超環(huán)面鏡和K-B聚焦鏡兩級聚焦后,在樣品處的光斑大小約為5.6μm×8μm(H×V)。采用日本OKEN公司的S-1329A1型電離室和S-1196A1型電離室分別監(jiān)測入射光和透射光的強度,由日本Hitachi High-Tech Science America公司的Vortex?-90EX硅漂移探測器(Silicon Drift Detector,SDD)和美國XIA公司的多道分析器組合的探測系統(tǒng)采集測試樣品的XRF信號。為了減少瑞利散射(Rayleigh scattering)和康普頓散射(Compton scattering)背底,探測系統(tǒng)與入射光路徑呈90°放置。樣品與入射光路徑呈45°放置,采用德國Allied Vision公司的光學顯微鏡實時觀察樣品的位置。

    為限制SDD探測器的接收范圍,將美國XOS公司的多毛細管光學元件(Polycapillary X-ray optics)固定在SDD探測器前端。多毛細管光學元件的焦點距離為2.5 mm,在17.4 keV處的焦點尺寸<10μm(Full Width at Half Maximum,F(xiàn)WHM),在8.0 keV處的傳輸效率為3.1%。通過不斷地調(diào)節(jié)SDD探測器的位置,使多毛細管光學元件的焦點與K-B聚焦鏡的焦點重疊,達到共聚焦的狀態(tài)。在共聚焦狀態(tài)下,探測系統(tǒng)接收到的XRF信號是來自共聚焦體積元內(nèi)的信號。保持共聚焦體積元的位置不變,樣品以10μm的步長沿著光學顯微鏡視野的深度方向連續(xù)移動。當SDD探測器從無到有探測到樣品的XRF信號時,即認為共聚焦體積元到達樣品表面。繼續(xù)沿著光學顯微鏡視野的深度方向移動樣品,使共聚焦體積元在樣品內(nèi)部不同深度移動,得到不同深度的化學元素信息。后期數(shù)據(jù)處理過程中,通過重構(gòu)多個不同深度的元素分布圖像,就可以實現(xiàn)三維空間元素分布的分析。

    此外,為了在共聚焦μ-SRXRF實驗中能夠保持低溫檢測環(huán)境,采用英國Oxford Cryosystems公司的液氮低溫系統(tǒng)(Cryostream 800,77 K)保持生物樣品在大氣中處于低溫冷凍狀態(tài)。

    2 共聚焦X射線熒光微探針技術(shù)在生物原位研究中的應(yīng)用

    擬南芥(Arabidopsis Thaliana)是研究物種自然變異和進化的模式植物,在植物科學研究中占據(jù)重要地位。圖3(b)是利用常規(guī)μ-SRXRF對擬南芥種子(圖3(a))進行原位XRF掃描成像的結(jié)果。由于X射線是從樣品表面45°方向入射的,因此XRF分布圖像與圖3(a)所示的光學顯微鏡照片不能完全重合。此外,在入射光路徑上不同深度的樣品發(fā)射出的XRF信號都被探測器接收,因此該XRF分布圖像不具有深度分辨信息。盡管圖3(b)中Fe的分布顯示與整個種子胚胎的維管束有關(guān),但其他化學元素的空間分布細節(jié)嚴重地重疊了。此外,在不使用切片操作的情況下,種子厚度的不均勻性會導(dǎo)致常規(guī)μ-SRXRF獲得的XRF分布圖像失真。圖3(c)是利用共聚焦μ-SRXRF對該擬南芥種子進行原位XRF掃描成像的結(jié)果,共聚焦體積元在距離擬南芥種子表面約100μm深度處掃描。如圖3(c)所示,Ca、Cu和Sr在整個種子胚胎中均有分布,并在種皮中積累更高的水平。Ca的分布與Schnell Ramos等[22]采用粒子誘導(dǎo)X射線熒光分析(Particle-Induced X-ray Emission,PIXE)測得的擬南芥種子切片結(jié)果類似,而Mn和Fe在整個種子中分布并不均勻。這種特異性的聚集可能與其特定的結(jié)構(gòu)有關(guān)。Mn可在線粒體中聚集[23],因此發(fā)芽過程中能量需求大的組織或器官中可能會聚集更多的Mn。Fe的分布顯示了胚根、下胚軸和一部分子葉的維管束。Zn均勻地分布在種子胚胎中。Mn、Fe和Zn的分布圖與Kim等[24]的研究結(jié)果類似。Ca、Zn和Sr的結(jié)果顯示了種子內(nèi)部存在供種子生長發(fā)育的空間。實驗結(jié)果表明:利用共聚焦μ-SRXRF可以在不切片的情況下直接獲得化學元素在擬南芥種子內(nèi)部的空間分布特征,更加準確地觀察化學元素在植物體組織或器官中的特異性分布狀況。

    圖3 擬南芥種子的光學顯微鏡照片(a)、常規(guī)μ-SRXRF成像結(jié)果(b)和共聚焦μ-SRXRF成像結(jié)果(c)Fig.3 Optical microscopic image of Arabidopsis thaliana seed(a),the XRF imaging results of Arabidopsis thaliana seed by conventionalμ-SRXRF(b)and confocalμ-SRXRF(c)

    大型蚤(Daphnia Magna)是國際公認的標準實驗生物,廣泛地用于水生生物毒理試驗,也是評估納米材料水生生物毒性的模式生物之一。圖4(a)是利用常規(guī)μ-SRXRF聯(lián)合低溫原位裝置對暴露在納米TiO2和As(V)中的大型蚤進行原位XRF掃描成像的結(jié)果。實驗過程中采用低溫原位裝置保持含水量較高的大型蚤處于低溫檢測環(huán)境以減少熱量對大型蚤組織和結(jié)構(gòu)的破壞。在常規(guī)μ-SRXRF實驗中,由于探測器方向上沒有任何限制,大型蚤體表和體內(nèi)發(fā)射的XRF信號都被探測器接收,因此圖4(a)的結(jié)果不具有深度分辨信息。雖然Fe、Zn、Ti和As的信號顯示了這些化學元素主要富集在大型蚤的腸道中,但無法確定As(V)是否進入大型蚤體內(nèi)。圖4(b)是共聚焦μ-SRXRF聯(lián)合低溫原位裝置對暴露在納米TiO2和As(V)中的大型蚤進行原位XRF掃描成像的結(jié)果,共聚焦體積元在距離大型蚤表面約150μm深度處掃描。如圖4(b)所示,K的信號清晰地展現(xiàn)了K+在大型蚤體內(nèi)的分布。Ca的信號清晰地展現(xiàn)了大型蚤體內(nèi)鈣化骨骼的形貌,其主要與碳酸鹽和磷酸鹽物質(zhì)有關(guān)[25-26]。Fe和Zn的信號主要富集在大型蚤的腸道中,主要來源于由含有檸檬酸鐵銨和七水硫酸鋅的BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)的食物(綠藻)。Ti的信號幾乎全部聚集在腸道中,個別較強的Ti信號可能是大型蚤捕食到發(fā)生團聚的納米TiO2顆粒。As的信號表明了除了吸附在大型蚤甲殼表面的As(V)外,在體內(nèi)的組織或器官也累積了少量的As(V)。As作為一種需要嚴格防控的有毒物質(zhì),可能通過吸附于納米TiO2后經(jīng)腸道進入生物體內(nèi),對大型蚤產(chǎn)生不利的影響。實驗結(jié)果表明:利用共聚焦μ-SRXRF聯(lián)合低溫原位裝置可以在無需脫水干燥過程直接獲得化學元素在大型蚤體內(nèi)的空間分布特征,不僅避免表面吸附或沾污引起的假性結(jié)果問題,且可以更加細致地觀察到化學元素在生物體內(nèi)部的吸收和分布特征。

    圖4 常規(guī)μ-SRXRF(a)和共聚焦μ-SRXRF(b)聯(lián)合低溫原位裝置對大型蚤進行XRF成像的結(jié)果Fig.4 The XRF imaging results of Daphnia magna by conventionalμ-SRXRF(a)and confocalμ-SRXRF(b)equipped with in-situ cryogenic device

    3 結(jié)語

    本工作在上海同步輻射光源硬X射線微聚焦及應(yīng)用光束線站(BL15U1)搭建了共聚焦X射線熒光微探針實驗裝置。利用共聚焦μ-SRXRF對擬南芥種子進行了原位XRF成像分析,直接獲得了化學元素在擬南芥種子內(nèi)部的空間分布特征,更加準確地探索化學元素在植物體組織/器官中的特異性分布狀況。同時,還搭建了低溫原位裝置,利用共聚焦μ-SRXRF聯(lián)合低溫原位裝置對暴露在納米TiO2和As(V)中的大型蚤進行了低溫環(huán)境下的原位XRF成像分析,直接獲得了化學元素在大型蚤體內(nèi)的空間分布特征,不僅避免表面吸附或沾污引起的假性結(jié)果問題,且可以更加細致地觀察到化學元素在生物體內(nèi)部的吸收和分布特征。

    該裝置的空間分辨率由入射X射線的光斑大小和多毛細管光學元件的焦點大小決定。今后可通過縮小光斑和采用更小焦點尺寸的毛細管光學元件來進一步提高空間分辨率。該裝置后續(xù)還可結(jié)合X射線近邊吸收精細結(jié)構(gòu)(X-ray Absorption Near Edge Structure,XANES)實現(xiàn)低溫共聚焦XANES方法,獲得化學元素在生物體內(nèi)部的化學態(tài)變化,表征化學元素在生物體內(nèi)部的轉(zhuǎn)化和代謝過程。因此,利用共聚焦μ-SRXRF可無需切片及干燥過程直接獲得化學元素在生物體內(nèi)的真實分布信息,同時聯(lián)合低溫原位裝置可以擴展對熱敏感的生物樣品和元素的分析,更深入了解化學元素對生物體的影響與作用,為生命和環(huán)境等研究領(lǐng)域提供強有力的原位表征技術(shù)。

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