小檗堿抑制人卵巢癌細(xì)胞HO-8910體外增殖機(jī)制研究

孫 育，劉朝陽(yáng)，劉英潔

(西北婦女兒童醫(yī)院，陜西 西安 710061)

卵巢癌發(fā)病率僅次于子宮體癌和子宮頸癌，是女性生殖器官最難治療的惡性腫瘤之一[1]，嚴(yán)重影響廣大患者的生活質(zhì)量和壽命。卵巢上皮癌是最常見(jiàn)的卵巢惡性腫瘤，其病死率在各類婦科腫瘤中排首位，對(duì)女性生命造成嚴(yán)重威脅[2-3]。由于直到癌癥廣泛擴(kuò)散臨床上才可能觀察到癥狀，因此在該疾病的早期階段診斷僅僅占所有患者的四分之一。目前，手術(shù)與細(xì)胞毒性化學(xué)療法相結(jié)合可在超過(guò)一半以上的患者中產(chǎn)生良好的臨床反應(yīng)[2]。紫杉醇和鉑類是該聯(lián)合治療方案中使用的兩種藥物。但大多數(shù)患者接受紫杉醇和鉑類聯(lián)合治療后，最終仍會(huì)復(fù)發(fā)[4]。腫瘤常見(jiàn)的治療方法如手術(shù)切除、藥物治療和放射治療等均不能起到理想的治療效果[5]，基于此，尋求簡(jiǎn)便易行且安全有效的治療方法極為重要。文獻(xiàn)[6]報(bào)道，中藥單體比如龍葵堿等具有抑制腫瘤細(xì)胞體外增殖的作用。另?yè)?jù)文獻(xiàn)[7]報(bào)道從中藥黃連、黃柏中提取的小檗堿具有降血脂、抗癌、抗氧化等作用。最新研究[8]表明，小檗堿可以通過(guò)抑制血管生成進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，但其對(duì)人卵巢癌上皮細(xì)胞體外增殖以及β-catenin信號(hào)通路的影響尚不清楚。本研究旨在探討小檗堿對(duì)人卵巢癌上皮細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制，藉此為防治卵巢癌尋找新的藥物。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 HO-8910細(xì)胞株(人卵巢癌上皮細(xì)胞)購(gòu)自廣州賽萊拉干細(xì)胞科技股份有限公司。小檗堿購(gòu)于成都曼思特生物科技有限公司，純度≥98%，小檗堿溶于DMSO。DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco 公司)、青霉素/鏈霉素雙抗(美國(guó)Gibco 公司)，CCK8試劑購(gòu)于美國(guó)Apexbio公司，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(中國(guó)碧云天生物公司)，BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(中國(guó)碧云天生物公司)，細(xì)胞周期試劑盒試劑盒購(gòu)于美國(guó)BD公司，Cyclin D1、 p21、β-catenin 和GAPDH 抗體均購(gòu)于中國(guó)博士德生物公司，免疫組化試劑盒購(gòu)于美國(guó)Cell Signal Technology有限公司。流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)BD Pharmingen 公司，轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad 公司)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo 公司)，倒置顯微鏡(德國(guó)奧林巴斯公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：HO-8910細(xì)胞株由DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，DMEM 完全培養(yǎng)基包含1% 雙抗，10%胎牛血清，培養(yǎng)基3 d更換1次，細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)達(dá)到70%～80% 時(shí)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化、傳代和接種。

1.2.2 CCK8法檢測(cè)小檗堿對(duì)HO-8910細(xì)胞株活力的影響：將HO-8910細(xì)胞培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期，消化并計(jì)數(shù)，按照3×103個(gè)/孔接種于96孔板中，向?qū)?yīng)試驗(yàn)孔中分別加入含有不同濃度的小檗堿(0、12.5、25、50、100 μmol/L)DMEM完全培養(yǎng)基,每個(gè)濃度組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，將10 μl CCK-8染液加入到100 μl細(xì)胞培養(yǎng)液中，37 ℃條件下繼續(xù)孵育4 h，使用酶標(biāo)儀在490 nm測(cè)量吸光度。

1.2.3 流式細(xì)胞法檢測(cè)小檗堿對(duì)HO-8910細(xì)胞周期分布的影響：將HO-8910細(xì)胞株以每孔3×105個(gè)/ml的密度接種至6 孔培養(yǎng)板，次日，加入不含小檗堿或含有50 μmol/L 小檗堿的DMEM完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，消化轉(zhuǎn)移至離心管中，1000 r/min 離心5min。收集細(xì)胞，用預(yù)冷PBS在4 ℃冰箱固定4 h，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.4 Western blot 檢測(cè)小檗堿對(duì)HO-8910細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響：將HO-8910細(xì)胞株消化傳代，并以每孔3×105個(gè)/ml的密度接種至6 孔培養(yǎng)板，次日，加入不含小檗堿或含有50 μmol/L 小檗堿的DMEM完全培養(yǎng)基處理24 h，倒掉培養(yǎng)基，參考BCA試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)提取和蛋白濃度測(cè)定。每孔上樣30 μg，用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜，之后用5%牛血清白蛋白(BSA)封閉1 h，分別加入一抗β-catenin(1∶1000)、Cyclin D1(1∶1000)、p21(1∶1 000)和GAPDH(1∶1000)稀釋液，將膜放入4 ℃冰箱搖床上，孵育過(guò)夜，次日加入TBST洗3 次，分別加入二抗(1∶3000)稀釋液，用ECL 發(fā)光液浸膜 5 min，用凝膠成像儀進(jìn)行顯色反應(yīng)并拍照記錄，用GAPDH作為內(nèi)參，用Image Lab 3.0軟件進(jìn)行條帶定量分析。

1.2.5 RT-PCR法：將HO-8910細(xì)胞株消化傳代，并以每孔3×105個(gè)/ml的密度接種至6 孔培養(yǎng)板，次日，加入不含小檗堿或含有50 μmol/L 小檗堿的DMEM完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，收集培養(yǎng)24 h后的各組細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，采用Trizol法提取RNA。以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，GAPDH作為內(nèi)參，各引物序列見(jiàn)表1。

2 結(jié) 果

2.1 小檗堿對(duì)HO-8910細(xì)胞活力的影響 見(jiàn)圖1。當(dāng)小檗堿濃度為12.5、25 μmol/L 時(shí)，小檗堿對(duì)HO-8910細(xì)胞株活性沒(méi)有顯著作用，當(dāng)小檗堿濃度為50、100 μmol/L 時(shí)，小檗堿顯著抑制HO-8910細(xì)胞株活性，與對(duì)照組(0 μmol/L小檗堿組)相比，其組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，本研究在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選用50 μmol/L小檗堿為小檗堿組。

注：與0 μmol/L小檗堿組比較，**P<0.01

2.2 小檗堿對(duì)HO-8910細(xì)胞株細(xì)胞周期的影響 見(jiàn)表2。小檗堿組G0/G1期細(xì)胞百分比與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，小檗堿組中S期細(xì)胞百分比與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表2 兩組細(xì)胞周期分布比較(%)

2.3 小檗堿對(duì)HO-8910細(xì)胞株增殖相關(guān)蛋白 mRNA表達(dá)水平的影響 見(jiàn)圖2 。與對(duì)照組相比，小檗堿組中，β-catenin和Cyclin D1 mRNA表達(dá)量顯著減少(P<0.05、P<0.01)，p21 mRNA表達(dá)量顯著增加(P<0.01)。

2.4 小檗堿對(duì)HO-8910細(xì)胞株增殖相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 見(jiàn)圖3。與對(duì)照組相比，小檗堿組中，β-catenin和Cyclin D1蛋白表達(dá)量顯著減少(P<005、P<0.01)，p21蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.01)。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

3 討 論

卵巢癌是臨床婦科最常見(jiàn)和最棘手的惡性腫瘤之一，其難于早期發(fā)現(xiàn)且發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，因此，多年來(lái)卵巢癌病死率穩(wěn)居?jì)D科第一[9]。目前，手術(shù)、化療以及放療仍是臨床上主要的診治方法，但對(duì)患者具有較大的創(chuàng)傷和不良反應(yīng)[10]，而中藥活性單體具有來(lái)源廣泛、廉價(jià)，治療安全有效的特點(diǎn)，未來(lái)中藥活性單體具有廣闊的應(yīng)用前景。

小檗堿是一種生物堿，研究[11-12]發(fā)現(xiàn)小檗堿促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡是通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞的形成介導(dǎo)的。本研究通過(guò)CCK8實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小檗堿可顯著抑制HO-8910細(xì)胞增殖，并抑制細(xì)胞從G0/G1期向S 及G2期細(xì)胞轉(zhuǎn)變。RT-PCR和Western blot探明了小檗堿可顯著抑制HO-8910細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，即小檗堿抑制了HO-8910細(xì)胞株β-catenin、Cyclin D1和p21蛋白和mRNA的表達(dá)。文獻(xiàn)[13]報(bào)道，小檗堿通過(guò)降低Bcl-2、MMP-9、NF-κB p65表達(dá)及提高Bax表達(dá)，有效抑制宮頸癌增殖及侵襲轉(zhuǎn)移并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，小檗堿通過(guò)將細(xì)胞阻滯于G0/G1期，并能夠阻斷NF-κB信號(hào)通路，從而抑制子宮內(nèi)膜癌的轉(zhuǎn)移[14]。本研究中，小檗堿通過(guò)抑制細(xì)胞從G0/G1期向S 及G2期細(xì)胞轉(zhuǎn)變進(jìn)而抑制HO-8910細(xì)胞增殖這一結(jié)果與已報(bào)道的小檗堿可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相符[15]。

Wnt/β-catenin一般通路較多參與腫瘤的形成和發(fā)展，決定著腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的去向[9]。β-catenin是Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，在腫瘤中表達(dá)上調(diào)[16]，在各類細(xì)胞中起著粘連并傳遞信號(hào)的作用[17]，β-catenin與人類癌癥中的致癌活性有關(guān)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，β-catenin參與了卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[18-19]。Cyclin D1在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用。Lin等[20]發(fā)現(xiàn)了一個(gè)完美的T細(xì)胞因子4(Tcf4)結(jié)合位點(diǎn)(CTTGATC)，位于Cyclin D1啟動(dòng)子區(qū)域中的核苷酸-80和-73之間，提示β-連環(huán)蛋白/Tcf4途徑可能參與了對(duì)T細(xì)胞因子4的調(diào)控下Cyclin D1表達(dá)。文獻(xiàn)[21]報(bào)道在乳腺癌細(xì)胞系中，β-catenin/Tcf4途徑參與細(xì)胞 Cyclin D1啟動(dòng)子的激活。Cyclin D1和p21是細(xì)胞周期調(diào)控極為重要的調(diào)節(jié)因子，Cyclin D1主要參與細(xì)胞周期的基因突變和隨后細(xì)胞周期G1/S期的轉(zhuǎn)變[22]。p21 作為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CKIs)家族成員之一，可通過(guò)與Cyclin/CDK 蛋白激酶復(fù)合體相結(jié)合而抑制酶的活性，p21對(duì)CDK的抑制會(huì)在細(xì)胞周期的G1和G2階段觸發(fā)細(xì)胞周期停滯[23]，p21基因既與腫瘤抑制作用密切相關(guān)，又能通過(guò)抑制周期素依賴激酶復(fù)合物活性，協(xié)調(diào)細(xì)胞周期、DNA復(fù)制與修復(fù)之間的關(guān)系，從而將腫瘤抑制作用與細(xì)胞周期控制過(guò)程緊密相連[24]。本研究中，小檗堿抑制了HO-8910細(xì)胞株Cyclin D1并促進(jìn)p21的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在G1期，進(jìn)而抑制了HO-8910細(xì)胞進(jìn)一步增殖。此外，本研究的不足之處在于沒(méi)有檢測(cè)小檗堿對(duì)HO-8910細(xì)胞凋亡蛋白指標(biāo)的影響，尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，小檗堿可通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)周期蛋白表達(dá)抑制HO-8910細(xì)胞增殖。該結(jié)果為小檗堿的抗癌作用提供了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。