α1-抗胰蛋白酶抑制高糖誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)研究

田蘊(yùn)霖，白淑瑋，邵 娟

(西安市人民醫(yī)院 西安市第四醫(yī)院眼科,陜西 西安 710004)

Müller細(xì)胞與感光細(xì)胞以及其它的神經(jīng)元緊密相連，是一種損傷誘導(dǎo)的干細(xì)胞。其也為貫穿視網(wǎng)膜全層的放射狀膠質(zhì)細(xì)胞，可通過(guò)降解谷氨酸等作用，發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)元的作用[1-2]。絕大多數(shù)活化的Müller細(xì)胞都停留在幼稚階段，但是周圍環(huán)境的變化可影響Müller細(xì)胞功能[3]。視網(wǎng)膜病變是臨床上比較常見(jiàn)的眼科疾病，多為高糖誘發(fā)而產(chǎn)生[4]。特別是高糖可破壞血-視網(wǎng)膜屏障，引起脈絡(luò)膜毛細(xì)血管與視網(wǎng)膜血管灌注不足，促使Müller細(xì)胞凋亡[5]。當(dāng)前視網(wǎng)膜病變的治療方法比較多，其中手術(shù)治療具有比較好的效果，但是為有創(chuàng)性操作，可能對(duì)患者的預(yù)后產(chǎn)生負(fù)面影響。常規(guī)藥物治療在一定程度上能減緩視網(wǎng)膜病變病程進(jìn)展，但是患者的復(fù)發(fā)率比較高[6]。α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin，AAT)屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族，主要在肝細(xì)胞中合成，由394個(gè)氨基酸組成，具有絲氨酸蛋白酶抑制劑的作用[7-8]。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3(Signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)是一類DNA結(jié)合蛋白，可表達(dá)于眼上皮細(xì)胞中，也可參與細(xì)胞凋亡等過(guò)程[9-10]。本文具體探討了AAT抑制高糖誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞凋亡的效果與機(jī)制，希望為視網(wǎng)膜病變的治療提供更好的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 大鼠視網(wǎng)永生化膜Müller細(xì)胞系購(gòu)自上海生命科學(xué)院，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。RPMI-1640高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司、MTT檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Promega公司，Annexin V-FITC PI檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，外源性AAT購(gòu)自美國(guó)Corning公司，兔抗人一抗與二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，青-鏈霉素購(gòu)于美國(guó)Gbico公司。

1.2 細(xì)胞分組與處理 待Müller細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。將細(xì)胞分為三組：模型組、試驗(yàn)A組、試驗(yàn)B組，分別加入不同濃度的外源性AAT 100 μl(加藥濃度分別為0、10、100 pg/ml)，處理不同時(shí)間點(diǎn)換回高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×105個(gè)/ml，在96孔板培養(yǎng)，加入20 μl 0.5 mg/ml MTT，培養(yǎng)6 h后再向每孔加入150 μl DMSO，震蕩培養(yǎng)10 min后，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞光密度(波長(zhǎng)=540 nm)，檢測(cè)與計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×103個(gè)/ml，采用200 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，然后再加入5 μl PI與的10 μl Annexin V-FITC，暗室下室溫反應(yīng)15 min，采用BD公司的流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡指數(shù)。

1.5 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲 在Transwell上室當(dāng)中添加Müller細(xì)胞100 μl，在下室添加600 μl培養(yǎng)基，培養(yǎng)6 h固定并染色微孔膜下層細(xì)胞，在400倍光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，計(jì)算細(xì)胞侵襲指數(shù)。

1.6 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) 收取細(xì)胞后消化后提取細(xì)胞的總蛋白，上樣20 μg蛋白進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行4 ℃過(guò)夜封閉，在含有相應(yīng)一抗溶液的抗體孵育盒中(稀釋比例為1∶1000)進(jìn)行孵育，4 ℃過(guò)夜，洗滌3次后，再將膜孵育二抗中(稀釋比例為1∶5000)，室溫孵育1 h，洗滌3次后進(jìn)行暗室曝光，檢測(cè)GAPDH、STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)水平。上述實(shí)驗(yàn)都重復(fù)3次，取平均值作為最終值。

2 結(jié) 果

2.1 三組細(xì)胞增殖指數(shù)對(duì)比 處理3、6 h后，試驗(yàn)A組、試驗(yàn)B組的細(xì)胞增殖指數(shù)均高于對(duì)照組(均P<0.05)，試驗(yàn)B組高于試驗(yàn)A組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 三組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖指數(shù)對(duì)比(%)

2.2 三組細(xì)胞凋亡指數(shù)對(duì)比 處理3、6 h后，試驗(yàn)A組、試驗(yàn)B組的細(xì)胞凋亡指數(shù)均低于對(duì)照組(均P<0.05)，試驗(yàn)B組低于試驗(yàn)A組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 三組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡指數(shù)對(duì)比(%)

2.3 三組細(xì)胞侵襲指數(shù)對(duì)比 處理3、6 h后，試驗(yàn)A組、試驗(yàn)B組的細(xì)胞侵襲指數(shù)均高于對(duì)照組(均P<0.05)，試驗(yàn)B組高于試驗(yàn)A組(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 三組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞侵襲指數(shù)對(duì)比(%)

2.4 三組STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)水平對(duì)比 處理3、6 h后，試驗(yàn)A、B組的STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)水平均低于對(duì)照組(均P<0.05)，試驗(yàn)B組低于試驗(yàn)A組(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 三組不同時(shí)間點(diǎn)STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)水平對(duì)比

3 討 論

Müller細(xì)胞對(duì)于維持視網(wǎng)膜的生長(zhǎng)與發(fā)育具有重要的作用，在內(nèi)外在各種因素的影響下，當(dāng)機(jī)體視網(wǎng)膜受損時(shí)，比如高血糖可破壞血-視屏障功能，可損傷視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)。不過(guò)此時(shí)環(huán)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞可大量活化和增殖，逆分化為視網(wǎng)膜干細(xì)胞，在一定程度下可替代損傷的細(xì)胞，促進(jìn)恢復(fù)視網(wǎng)膜功能[11-12]。但是很多Müller細(xì)胞的功能受限，為此在高糖環(huán)境下提高M(jìn)üller的增殖能力具有重要價(jià)值[13]。

AAT是機(jī)體血清中最豐富的蛋白酶抑制因子之一，主要由肝臟產(chǎn)生。AAT一般還具有較強(qiáng)的血管通透性，在Müller細(xì)胞中也有一定的表達(dá)，并且對(duì)視網(wǎng)膜組織具有一定的保護(hù)作用[14]。AAT也為一個(gè)急性反應(yīng)蛋白，當(dāng)人在處于感染或者炎癥發(fā)生時(shí)，血清中 AAT的濃度會(huì)出現(xiàn)明顯升高[15]。本研究顯示處理3、6 h后，試驗(yàn)A組、試驗(yàn)B組的細(xì)胞增殖指數(shù)、侵襲指數(shù)高于對(duì)照組，試驗(yàn)B組高于試驗(yàn)A組。從機(jī)制上分析，AAT可以激活 MAPK信號(hào)通路，從而促進(jìn)纖維細(xì)胞的增殖，可緩解高血糖引發(fā)的視網(wǎng)膜屏障功能紊亂及血管異常新生，提高M(jìn)üller的增殖與侵襲能力[16]。

高糖環(huán)境可導(dǎo)致視網(wǎng)膜外層細(xì)胞的破壞，促進(jìn)Müller細(xì)胞凋亡，使得內(nèi)層視網(wǎng)膜皺褶、萎縮，從而導(dǎo)致視網(wǎng)膜功能下降甚或喪失[17-18]。AAT是由內(nèi)胚層上皮細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的一種糖蛋白，突變型p53能夠上調(diào)AAT的表達(dá)，導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，且與惡性腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)[19]。AAT也能夠促進(jìn)血管生成素樣蛋白4的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤的血管生成能力[20]。本研究顯示處理3、6 h后，試驗(yàn)A組、試驗(yàn)B組的細(xì)胞凋亡指數(shù)低于對(duì)照組，試驗(yàn)B組低于試驗(yàn)A組，表明AAT能高糖誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的凋亡。當(dāng)前也有研究顯示AAT可導(dǎo)組細(xì)胞可以通過(guò)調(diào)控 NF-κB信號(hào)通路，從而抑制上皮細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，改善患者的病情[21]。

STAT3可在多種細(xì)胞、組織、器官中進(jìn)行表達(dá)，在人類定位于第12號(hào)染色體，STAT3蛋白分子量為84～113 kDa，由750～850個(gè)氨基酸組成[22]。STAT3蛋白結(jié)構(gòu)域中包括亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(bZIP)，可以通過(guò)其bZIP結(jié)合其他含bZIP蛋白調(diào)控轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮相關(guān)疾病的調(diào)控作用[23-24]。本研究顯示處理3、6 h后，試驗(yàn)A組、試驗(yàn)B組的STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)水平低于對(duì)照組，試驗(yàn)B組低于試驗(yàn)A組，表明AAT的應(yīng)用能抑制STAT3的表達(dá)，從而保護(hù)機(jī)體免除炎性因子的損壞，抑制炎癥反應(yīng)。不過(guò)本研究沒(méi)有進(jìn)行動(dòng)物模型分析，且沒(méi)有設(shè)置空白對(duì)照組，將在后續(xù)研究中進(jìn)行探討。

綜上所述，AAT可抑制高糖誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖與侵襲，其作用機(jī)制可能與抑制STAT3表達(dá)有關(guān)。