牦牛GPRIN3基因的克隆及組織表達分析

向 婭，柴志欣，武志娟，王吉坤，鐘金城，信金偉

(1.西南民族大學青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省重點實驗室，四川 成都 610041；2.西南民族大學青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，四川 成都 610041；3.省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國家重點實驗室，西藏 拉薩 850000)

G蛋白的全稱是鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白(GTPBinding protein)，G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)是膜整合蛋白中最多的一類，為細胞表面受體超家族.在動物中，G蛋白主要在細胞通訊過程中發(fā)揮作用，傳遞細胞外信號，如激素、神經(jīng)遞質(zhì)、離子和脂質(zhì)，以及感覺刺激，如信息素、口味和增味劑[1－3].涉及G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)的信號通路可調(diào)節(jié)哺乳動物的多種生理過程，是許多藥物治療的主要靶點.G蛋白在結(jié)構(gòu)上的差異主要源于α亞單位，α亞單位的多樣性實現(xiàn)了G蛋白對多種生理功能的調(diào)節(jié)[4－5]，根據(jù)α亞單位可將G蛋白分為四個亞家族:①Gαs(激活腺苷酸環(huán)化酶)，產(chǎn)生重要胞內(nèi)信使cAMP，激活依賴于cAMP的蛋白激酶A，還可激活磷脂酶C和鈣通道；②Gαi(抑制腺苷酸環(huán)化酶)，調(diào)控部分離子的轉(zhuǎn)運和磷脂肌醇的代謝，參與促有絲分裂原蛋白激酶級聯(lián)和Hh信號傳導(dǎo)途徑，通常把Gt和Go也歸入該家族；③Gαq，介導(dǎo)磷脂酶C的激活和多種胞內(nèi)第二信使的產(chǎn)生及蛋白激酶C的激活；④Gα12/13，與凝血酶受體偶聯(lián)，參與激活MAPK且不依賴于Rho因子，還可介導(dǎo)Rho因子依賴的傳導(dǎo)信號到細胞骨架的過程[6].Gαi/o調(diào)節(jié)蛋白可誘導(dǎo)G蛋白調(diào)節(jié)誘導(dǎo)神經(jīng)突增生家族(G protein－regulated inducer of neurite outgrowth family，GPRIN)介導(dǎo)GPCR與順序細胞內(nèi)靶標之間的通訊[7].

GPRIN家族是具有組成型活性形式的共表達信號傳導(dǎo)分子，包括GPRIN1、GPRIN2和GPRIN3三個亞型，這三個成員間表現(xiàn)出顯著的同源性.GPRIN抗體已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生物學和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)領(lǐng)域的研究，Gαo可以刺激神經(jīng)分支細胞，但其在體內(nèi)的作用機制尚不清楚，GPRIN可能是Go調(diào)節(jié)神經(jīng)生長的下游作用因子，Gαo－GRIN相互作用可調(diào)節(jié)神經(jīng)突增生，使細胞通過GPCR－Gαi/O介導(dǎo)的信號分化為神經(jīng)突起.研究發(fā)現(xiàn)，Gαi/O－GPRIN信號在小鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中具有重要作用，能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)元的定向遷移，Gαo－GPRIN途徑可以顯著調(diào)控共表達神經(jīng)元在胚胎階段的遷移和分化，從出生后到成熟階段，發(fā)揮定位功能并維護特定的神經(jīng)系統(tǒng)，在神經(jīng)元中特異表達并定位于樹突和軸突且與Gαo相互作用的GPRIN蛋白很可能參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和神經(jīng)元分化過程[7－9].還有研究表明，GP RIN1介導(dǎo)了μ阿片受體的功能[10]，與激活Gαo蛋白的Cdc42結(jié)合，導(dǎo)致細胞形態(tài)發(fā)生顯著變化[8].GPRIN2也有類似的現(xiàn)象[9]，GPRIN1和GPRIN2被稱為GPCR信號的替代(腺苷酸環(huán)化酶)介體[7].GPRIN3的作用定義不多，通過BLAST搜索發(fā)現(xiàn)它為脊椎動物所特有，在大腦中高表達，最近被標記為β－arrestin－2的伴侶，可調(diào)節(jié)多巴胺受體脫敏，影響選擇性行為任務(wù)[11].

GPRIN3的研究主要集中在人類疾病方面，楊嬋[12]研究表明，參芪復(fù)方可能通過同為差異mRNA和差異lncRNA靶基因的GPRIN3基因調(diào)控細胞增殖凋亡，從而抑制炎癥反應(yīng)，防治糖尿病大血管(胸主動脈)病變.Karadurmus[13]等研究發(fā)現(xiàn)，GPRIN3是紋狀體中D2R功能的假定選擇性控制器，在紋狀體相關(guān)行為和細胞功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用，這為解決與D2R相關(guān)的紋狀體功能障礙(精神分裂癥，帕金森氏病等)提供了新方向.目前尚未見牦牛GP RIN3基因相關(guān)研究報道，故本研究通過PCR技術(shù)克隆麥洼牦牛GPRIN3基因CDS區(qū)序列，分析其核苷酸、氨基酸序列，預(yù)測其蛋白結(jié)構(gòu)和功能，利用RT－qPCR技術(shù)分析其組織表達情況，旨在探討牦牛GP RIN3基因的分子特性.

1 材料與方法

1.1 試驗動物

于四川省阿壩藏族羌族自治州紅原縣選取雄性麥洼牦牛3頭(0.5歲).屠宰后快速采集心臟、肝臟、肺臟、腎臟、臀肌等組織，DEPC水沖洗后，置于液氮中保存?zhèn)溆?

1.2 試驗試劑

北京天根生化科技有限公司:動物組織DNA提取試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DH5α感受態(tài)細胞、DNA純化回收試劑盒；TaKaRa公司:2000 bp Marker、pMD19－T Vector cloning kit、TB Green Premix Ex Taq.

1.3 提取基因組DNA

使用動物組織DNA提取試劑盒獲得牦牛肺臟組織基因組DNA，loading buffer染色，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品質(zhì)量；NanoDrop 2000分光光度計測定其濃度及OD260nm/280nm值，OD260nm/280nm值在1.8～2.0方可使用，置于－20℃保存?zhèn)溆?

1.4 總RNA提取及cDNA合成

利用Trizol法提取牦牛各組織總RNA.采用NanoDrop 2000分光光度計測定RNA濃度及OD260nm/OD280nm(Ratio，R)值，R在1.8～2.0時方可采用.當R<1.8時，說明溶液有蛋白或其他有機物污染；當R>2.2時，說明RNA已經(jīng)水解成單核酸.配制1.0%瓊脂糖凝膠，5μL RNA樣品加1μL 6×Loading buffer，混勻，180 V電泳5 min，于凝膠成像儀上拍攝，檢測RNA樣品質(zhì)量，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于－20℃保存?zhèn)溆?

1.5 基因克隆及熒光定量PCR

根據(jù)GeneBank收錄的野牦牛GPRIN3基因序列(XM_005897777)及牦牛GAPDH(XM_014482068)基因序列，采用Primer 5.0設(shè)計特異性引物(見表1)，由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成.

表1 GPRIN3基因引物序列Table 1 GPRIN3 gene primer sequences

以牦牛耳樣基因組DNA為模板進行PCR擴增.反應(yīng)體系、程序見表2、表3.PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外燈下切膠，根據(jù)DNA純化回收試劑盒說明書純化回收PCR產(chǎn)物，4℃存放.將PCR回收產(chǎn)物與載體進行連接、轉(zhuǎn)化、復(fù)蘇、倒置培養(yǎng)，具體操作參照向婭等[14]基因克隆步驟.熒光定量PCR反應(yīng)體系、程序見表2、表3，每個樣品3個生物學重復(fù)，3個技術(shù)重復(fù).

表2 PCR反應(yīng)體系Table 2 PCR reaction system

表3 PCR反應(yīng)程序Table 3 PCR reaction program

1.6 生物信息學分析

分析麥洼牦?；蚪MDNA序列，預(yù)測其蛋白結(jié)構(gòu)和功能(表4).

表4 DNA和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)分析工具Table 4 DNA and protein sequence data analysis tools

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增結(jié)果

以10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的牦?；蚪MDNA樣品，結(jié)果顯示，條帶單一清晰(見圖1A)，可用于后續(xù)實驗；用紫外分光光度計檢測其濃度并記錄，－20℃保存?zhèn)溆?

以麥洼牦牛耳樣DNA為模板進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，有目的條帶且條帶單一，長度為690、717、909、751 bp(見圖1B)，與預(yù)期片段大小一致.

圖1 牦?；蚪MDNA瓊脂糖凝膠電泳(A)和GPRIN3基因PCR擴增結(jié)果(B)Fig.1 Agarose gel electrophoresis of genome DNA in yak(A)and PCR amplification results of GPRIN3 gene(B)

2.2 氨基酸序列比對

測序拼接獲得麥洼牦牛GPRIN3基因CDS區(qū)序列長度為2343 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，編碼780個氨基酸殘基，序列提交GenBank得到登錄號MT978152.將麥洼牦牛與GenBank中野牦牛(XM_005897777)GPRIN3的核苷酸序列比對顯示(見圖2)，共有4處堿基突變，分別位于第309、413、1099、1212位點，一致性為99.83%；氨基酸序列比對顯示，共3個位點發(fā)生突變，分別是第103(G→R)、366(T→M)、404(E→K)位點，一致性為99.62%；第413位的堿基突變屬于同義突變.

圖2 牦牛、野牦牛GPRIN3基因氨基酸序列比對Fig.2 Sequence comparison ofdiduced amino acid sequence of GPRIN3 genebetween yak and wild yak

2.3 系統(tǒng)進化樹分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載8個不同物種GPRIN3基因的CDS區(qū)序列，利用MEGA 7.0軟件分析牦牛、野牦牛、普通牛等8個物種GP RIN3基因編碼區(qū)核苷酸序列并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹.結(jié)果顯示，牦牛與野牦牛遺傳距離最近，其次是普通牛，再與野豬、犬聚為一類，與小鼠、人親緣關(guān)系較遠，與黑猩猩的親緣關(guān)系最遠(見圖3)，說明GPRIN3基因編碼區(qū)在哺乳動物間高度保守.

圖3 GPRIN3基因系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of GPRIN3

2.4 蛋白理化性質(zhì)預(yù)測與分析

蛋白理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果顯示，牦牛GPRIN3蛋白分子式為C3481H5697N1053O1190S29，分子質(zhì)量為82.270 ku，等電點為7.18，為偏堿性蛋白，負電荷氨基酸殘基(Asp＋Glu)、正電荷氨基酸殘基(Arg＋Lys)均為85個.由氨基酸組成可知(見表5)，Ser(S)含量最豐富，占比13.20%，Trp(W)、Tyr(Y)含量最低，均只占0.3%.不穩(wěn)定指數(shù)為60.07，說明牦牛GPRIN3蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定；脂肪系數(shù)為63.12；總平均親水系數(shù)(GRAVY)為－0.644，與ExPASy－ProtScale預(yù)測結(jié)果相符，牦牛GPRIN3氨基酸序列中大多數(shù)氨基酸為親水性殘基，此蛋白屬于親水性蛋白.

表5 麥洼牦牛GPRIN3基因編碼蛋白的氨基酸組成Table 5 The amino acid composition of the protein encoded by the Maiwa yak GPRIN3 gene

2.5 蛋白結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測

2.5.1 跨膜結(jié)構(gòu)及信號肽預(yù)測

跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，GPRIN3蛋白的氨基酸均位于細胞膜表面，無跨膜結(jié)構(gòu)域；結(jié)合ExPASy－TMPred軟件分析結(jié)果，牦牛GPRIN3蛋白在第384～404位氨基酸處存在1個由內(nèi)而外的跨膜螺旋，但僅為明顯的TM片段，為非跨膜蛋白(見圖4).信號肽預(yù)測結(jié)果表明，牦牛GPRIN3蛋白不含信號肽，為非分泌型蛋白(見圖5).

圖4 麥洼牦牛GPRIN3基因編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.4 Transmembrane domain prediction of Maiwa yak GPRIN3 protein

圖5 麥洼牦牛GPRIN3基因編碼蛋白信號肽預(yù)測Fig.5 Signal peptide prediction of Maiwa yak GPRIN3 gene encoding protein

2.5.2 磷酸化位點及糖基化位點預(yù)測

磷酸化位點預(yù)測結(jié)果顯示，閾值為0.5時，牦牛GPRIN3蛋白存在74個Ser磷酸化位點，32個Thr磷酸化位點，無Tyr磷酸化位點(見圖6).糖基化位點預(yù)測結(jié)果表明，GPRIN3蛋白含有152個O－糖基化位點，3個N－糖基化位點(第271、422、652位)(見圖7).

圖6 麥洼牦牛GPRIN3基因編碼蛋白磷酸化位點預(yù)測Fig.6 Phosphorylation sites prediction of Maiwa yak GPRIN3 gene encoding protein

圖7 麥洼牦牛GPRIN3基因編碼蛋白N－糖基化位點預(yù)測Fig.7 N－glycosylation site prediction of Maiwa yak GPRIN3 gene encoding protein

2.5.3 二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，牦牛GPRIN3蛋白無規(guī)則卷曲(Cc)含量最高，共562處，占二級結(jié)構(gòu)的72.05%；α螺旋(Hh)有158處，占比20.26%；延伸鏈(Ee)42處，占二級結(jié)構(gòu)的5.38%；β轉(zhuǎn)角(Tt)含量最低，僅2.31%(見圖8).

圖8 牦牛GPRIN3蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測長線為α－螺旋(Hh)，中長線為延伸鏈(Ee)，短線為β－轉(zhuǎn)角(Tt)，最短線為無規(guī)則卷曲(Cc)Fig.8 Secondary structure prediction of yak GPRIN3 proteinThe long line isα－h(huán)elix(Hh)，the middle and long line is the extended chain(Ee)，the short line is theβ－turn(Tt)，and the shortest line is the random coil(Cc)

基于PDB數(shù)據(jù)庫預(yù)測GPRIN3蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型(見圖9)，牦牛GPRIN3蛋白與2g0f.1.A模型相似性最高，三級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)構(gòu)相符.

圖9 牦牛GPRIN3蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.9 Tertiary structure prediction of yak GPRIN3 protein

2.5.4 保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測

保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示，牦牛GPRIN3蛋白含有GRIN－C超家族結(jié)構(gòu)域，GRIN－C超家族代表G蛋白調(diào)節(jié)神經(jīng)突生長誘導(dǎo)物的C末端(見圖10).

圖10 牦牛GPRIN3基因編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.10 Conserved domain prediction of yak GPRIN3 gene encoding protein

2.5.5 蛋白功能分析

蛋白亞細胞定位預(yù)測顯示，牦牛GPRIN3蛋白主要分布于細胞核(82.6%)中，13.0%分布于細胞骨架中，在分泌系統(tǒng)的囊泡中僅占4.3%.蛋白功能分類預(yù)測表明，牦牛GPRIN3蛋白可能在輔因子的生物合成、運輸和結(jié)合、翻譯途徑中發(fā)揮重要作用(見表6)，同時在電壓激活離子通道過程中發(fā)揮功能(見表7).

表6 牦牛GPRIN3基因編碼蛋白功能分類分析Table 6 Functional category analysis of yak GPRIN3 gene encoding protein

表7 牦牛GPRIN3基因本體分類分析Table 7 Gene Ontology category analysis of yak GPRIN3 gene encoding protein

2.5.6 蛋白互作分析

分析牦牛GPRIN3蛋白的互作關(guān)系發(fā)現(xiàn)，GPRIN3與WIZ蛋白相關(guān)性最高(0.721)(見圖11)，WIZ是一種蛋白質(zhì)向?qū)В蓪HMT1和EHMT2組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶鏈接到CTBP核心加壓機制，可參與EHMT1－EHMT2異二聚體的形成和穩(wěn)定，屬于C2H2型鋅指蛋白家族.與GPRIN1蛋白相關(guān)性為0.688，GPRIN是G蛋白調(diào)節(jié)神經(jīng)突生長的誘導(dǎo)物1，與神經(jīng)突生長有關(guān).SYNGAP1(0.468)是突觸RasGTPase活化蛋白1，突觸后信號PSD的主要成分，可在AMPAR膜運輸和突觸可塑性的NMDAR依賴性控制中發(fā)揮重要作用，可調(diào)節(jié)AMPAR介導(dǎo)的微型興奮性突觸后電流.

圖11 GPRIN3蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析Fig.11 GPRIN3 protein network interaction analysis

2.6 牦牛GPRIN3 mRNA組織表達分析

2.6.1 標準曲線及線性范圍

將PCR原液10倍梯度稀釋的6個濃度(10－1～10－6)作為模板，每個濃度3個重復(fù)進行實時熒光定量PCR，根據(jù)擴增曲線得到Ct值，QuantStudio軟件自動擬合出標準曲線(見圖12).GP RIN3基因擴增效率為100.826%，相關(guān)系數(shù)為0.990，表明建立的標準曲線線性關(guān)系很好，標準線性方程為:y＝－3.302x＋1.260.

圖12 GPRIN3基因的標準曲線Fig.12 Standard curve of GPRIN3 gene

2.6.2 熒光定量PCR結(jié)果

熒光定量結(jié)果顯示，GPRIN3基因在麥洼牦牛心臟、肝臟、肺臟、腎臟和臀肌組織中均有表達，在肺臟組織中表達量最高，與肝臟組織差異顯著(P<0.05)，與腎臟、心臟組間差異極顯著(P<0.01)，在臀肌組織中表達量極低，且與其他組織均差異極顯著(P<0.01)(見圖13).

圖13 GPRIN3基因在麥洼牦牛不同組織的mRNA表達量大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；字母不同表示差異顯著，字母相同表示差異不顯著(P>0.05)Fig.13 mRNA expression of GPRIN3 gene in different tissues of Maiwa yakCapital letters means the difference is extremely significant(P<0.01)，lowercase letters means the difference is significant(P<0.05)；different letters means the difference is significant，and the same letters means the difference is insignificant(P>0.05)

3 討論

大量研究表明，G蛋白主要在細胞通訊過程中發(fā)揮作用，傳遞細胞外信號，而細胞通訊異常可能導(dǎo)致牦牛生長發(fā)育障礙甚至死亡，GPRIN3基因可能作為影響牦牛生長發(fā)育的候選基因發(fā)揮作用.本研究對麥洼牦牛GP RIN3基因進行了克隆、生物信息學分析及組織表達分析研究，初步探索該候選基因在其各組織中的表達情況.

本研究中麥洼牦牛與野牦牛GPRIN3基因的核苷酸、氨基酸序列比對結(jié)果顯示，其與野牦牛核苷酸序列相比，共有4處堿基突變，序列一致性為99.83%；氨基酸序列比對顯示，4處堿基突變1處為同義突變，3處屬于錯義突變，分別是第103(G→R)、366(T→M)、404(E→K)位點，一致性為99.62%.在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中甘氨酸(Gly)與谷氨酸(Glu)均為激動劑，可讓動物因超興奮死亡；甘氨酸在CNS中廣泛分布，在神經(jīng)信號傳遞及參與各種生理和病理反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[15].因此，推測甘氨酸、谷氨酸的突變可能會影響牦牛神經(jīng)信號傳導(dǎo)進而影響牦牛相關(guān)激素的分泌，從而影響牦牛生長發(fā)育.系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示，牦牛與野牦牛遺傳距離最近，其次是普通牛，再與野豬、犬聚為一類，與黑猩猩的親緣關(guān)系最遠，說明GPRIN3基因編碼區(qū)在哺乳動物間高度保守.

本研究牦牛GPRIN3蛋白中絲氨酸(13.2%)、丙氨酸(10.0%)、脯氨酸(8.0%)含量較高.絲氨酸(Ser)在脂肪和脂肪酸的新陳代謝、肌肉生長、細胞膜的制造加工、肌肉組織和包圍神經(jīng)細胞的鞘的合成中均發(fā)揮重要作用[16]；D－絲氨酸同時也是重要的神經(jīng)遞質(zhì)，可調(diào)控中樞系統(tǒng)[17].譚茹尹等[18]研究發(fā)現(xiàn)，包括人類在內(nèi)，高等動物的高級中樞存在區(qū)域性高濃度的D－絲氨酸，并發(fā)揮著重要的神經(jīng)遞質(zhì)作用，與癲癇、精神分裂癥、焦慮癥、成癮等神經(jīng)精神疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系.脯氨酸(Pro)是動物膠原蛋白的重要組成成分，進入肽鏈后可發(fā)生羥基化作用.根據(jù)伊利諾斯大學一項最新的研究，脯氨酸重復(fù)對于理解許多天然蛋白的結(jié)構(gòu)和功能很重要；且脯氨酸重復(fù)片段越長，泡沫狀的蛋白就越大，研究人員推測這些發(fā)現(xiàn)有助于神經(jīng)組織退化疾病的治療[19].Karadurmus[13]等研究表明，G PRIN3在間接中棘神經(jīng)元(indirect medium spiny neurons，iMSN)中通過調(diào)控細胞樹突狀排列，維持興奮性和D2R依賴性行為.GPRIN3產(chǎn)生的D2R信號微調(diào)為治療需要補充多巴胺的疾病(例如帕金森氏病)或必須減少多巴胺的緊張性疾病(例如精神分裂癥)提供了新思路，但其具體機制尚未明確.故后續(xù)的研究可以此為思路，探索GPRIN3產(chǎn)生D2R信號微調(diào)對病例情況的影響，為預(yù)防牦牛神經(jīng)性疾病提供參考.

亞細胞定位預(yù)測顯示，GPRIN3蛋白主要分布于細胞核、細胞骨架和分泌系統(tǒng)的囊泡中，且在細胞核中分布最多，可發(fā)揮核定位作用.保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示，GPRIN3蛋白含有GRIN－C超家族結(jié)構(gòu)域.對牦牛GPRIN3蛋白進行功能分類預(yù)測，結(jié)果表明，GPRIN3蛋白可能在輔因子的生物合成、運輸和結(jié)合、翻譯途徑中發(fā)揮重要作用，同時在電壓激活離子通道過程中發(fā)揮功能.結(jié)合保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果，GPRIN蛋白可能在調(diào)節(jié)輔因子的生物合成、運輸和結(jié)合及細胞通訊等過程發(fā)揮重要作用.

麥洼牦牛主要生活在高海拔、低壓缺氧的環(huán)境，為適應(yīng)高原極端惡劣生態(tài)環(huán)境，肺臟、肝臟等機體主要呼吸器官發(fā)生顯著變化，實時熒光定量PCR結(jié)果表明，GP RIN3在麥洼牦牛肺臟組織中表達量最高，與肝臟組織差異顯著(P<0.05)，與腎臟、心臟組間差異極顯著(P<0.01)，在臀肌組織中表達量極低.目前，GPR IN3基因在家畜中的研究較少缺乏可供參考比對的數(shù)據(jù)和文獻，通過本研究對牦牛GPRIN3基因的克隆和組織表達分析可為該基因在家畜中的研究提供可參考的數(shù)據(jù).

4 結(jié)論

本研究克隆獲得麥洼牦牛GP RIN3基因長度為2343 bp的開放閱讀框，編碼780個氨基酸殘基；系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示，牦牛與野牦牛、普通牛親緣關(guān)系最近；存在GRIN－C保守功能結(jié)構(gòu)域，是G蛋白調(diào)節(jié)誘導(dǎo)的神經(jīng)突增生C末端結(jié)構(gòu)域，推測GPRIN3可能調(diào)節(jié)輔因子的生物合成、運輸和結(jié)合，并在細胞通訊等過程中發(fā)揮重要作用；實時熒光定量PCR結(jié)果表明，G PRIN3在牦牛肺臟組織中表達量最高，本研究為今后進一步探討牦牛G PRIN3基因及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能提供理論基礎(chǔ).