降脂瘦身湯對非酒精性脂肪肝大鼠脂代謝及核轉(zhuǎn)錄因子-κB蛋白表達影響的實驗研究

董文娟，楊立宏，張文佳

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830054)

隨著人們物質(zhì)生活水平的提高，非酒精性脂肪肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)逐步發(fā)展為最常見的慢性肝病，且發(fā)病率日益升高[1]。更引起人們重視的是，NAFLD是許多代謝性疾病的危險因素，包括肥胖、2型糖尿病[2]及心血管疾病等，可進展為脂肪性肝炎、肝纖維化、肝癌，嚴重威脅著人們的身體健康[3]。許多學(xué)者認為脂肪組織核轉(zhuǎn)錄因子κB(Nuclear factor kappa-B，NF-κB)可調(diào)控多種脂肪因子和炎癥因子在脂肪細胞中的表達，參與脂肪代謝等過程[4-5]。目前中藥制劑治療非酒精性脂肪肝病已在臨床中取得一定療效，本研究旨在觀察降脂瘦身湯對非酒精性脂肪肝病大鼠脂代謝的干預(yù)效應(yīng)及對脂肪組織NF-κB蛋白表達的影響，為臨床使用降脂瘦身湯治療NAFLD提供新的科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：健康雄性SD級大鼠，共32只，采購于新疆醫(yī)科大學(xué)動物中心，體重(210±10) g,合格證號：SCXK(新)2018-0003。

1.1.2 主要試劑：血糖含量試劑盒，購自索萊寶公司；游離脂肪酸測試盒、伊紅染液(水溶性)、蘇木素染色液、TG試劑盒及T-CHO試劑盒均購自南京建成公司；大鼠胰島素(INS)ELISA Kit購自武漢華美。Easy Ⅱ Protein Quantitative Kit (BCA)，全式金公司，批號：DQ111-01；蛋白酶抑制劑，蛋白酶抑制劑公司，批號：AR1178；蛋白預(yù)染Marker，上海生工公司，批號：C610013；NF-κB-p65(D14E12) XP?Rabbit mAb，CST公司，批號：8242T；Phospho-NF-κB-p65(Ser536)(93H1) Rabbit mAb，CST公司，批號：3033T。

1.1.3 實驗儀器：臺式離心機(上海力申科學(xué)儀器制造廠)，型號：Neofuge；漩渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，型號：GL-88B；酶標儀(Bio-Rad,China)，型號：xMarkTM；移液器(Eppendorf,Germany)，型號：Dragon lab；化學(xué)發(fā)光成像儀系統(tǒng)(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司)，型號：Chemiscope 3000；蛋白轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad,USA)，型號：Mini-PROTEAN Tetra system；電泳儀(Beijing Liuyi,China)，型號：DYCZ-24DN；脫色搖床(江蘇其林貝爾)，型號：TS-3D，等。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗藥品：降脂瘦身湯組成為，生黃芪、黨參各30 g，半夏、紅花各9 g，澤瀉12 g，陳皮、炒桃仁、山楂、荷葉、決明子各15 g，丹參20 g等。以上中藥飲片由三九藥業(yè)生產(chǎn)提供；動物高脂飼料由新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。

1.2.2 造模及分組：SD大鼠32只適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機取11只為正常組，予普通飼料喂養(yǎng)；余造模組21只，予高脂飼料喂養(yǎng)，各組大鼠均自由飲水。飼養(yǎng)8周后，分別從正常組、模型組中隨機抽取1只大鼠取肝臟做病理切片，證實造模成功，以《非酒精性脂肪性肝病診療指南》的診斷為標準。造模成功后，將造模組20只大鼠隨機分為降脂瘦身湯組及模型組，每組10只。

1.2.3 干預(yù)方法：正常組及模型組均給予等量0.9 %氯化鈉溶液灌胃，中藥降脂瘦身湯組根據(jù)《人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表》計算，每100 g大鼠每天中藥用量為0.108 g，每天下午1次，連續(xù)灌服4周。4周后處死，處死前夜禁食禁水12 h。

1.3 觀察指標

1.3.1 體重、肝濕重及肝指數(shù)：實驗期間每周對大鼠進行稱重，記錄體重，實驗結(jié)束后，摘取大鼠肝臟稱重，肝指數(shù)=肝濕重/體重×100%。

1.3.2 生化指標：腹主動脈取血，按照血糖、甘油三酯、膽固醇、游離脂肪酸等生化指標試劑盒操作方法進行測定。

1.3.3 觀察大鼠肝臟組織病理情況：在肝臟左葉相同部位取肝組織進行梯度脫水，將脫水處理過的組織用石蠟進行包埋，最后切成5 μm厚的薄片，放在溫水浴中進行展片，將展勻稱的組織固定于載玻片上，做成石蠟切片。鏡下觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)改變。

1.3.4 檢測NF-κB-p-p65、NF-κB-p65的表達：取各組的肝臟脂肪組織，按Western blot實驗報告中實驗步驟進行操作，檢測其中NF-κB-p-p65、NF-κB-p65蛋白的表達。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，用方差分析或非參數(shù)檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況比較 整個實驗過程中各組動物飲食飲水正常，皮膚完整無潰爛，皮毛干凈有光澤；大便成形，未發(fā)現(xiàn)有稀便；小便不渾濁，顏色正常。動物精神活躍、抓捕抵抗強烈。在藥物干預(yù)開始后，降脂瘦身湯組死亡1只大鼠。經(jīng)觀察，死亡動物體表有撕咬、打斗的傷口。經(jīng)解剖，死亡動物臟器均未發(fā)現(xiàn)異常。故而判斷，可能是由于動物體型偏大為爭搶活動空間而進行打斗，從而導(dǎo)致死亡。調(diào)整飼養(yǎng)密度，并將好斗的動物隔離后再無動物死亡。

2.2 各組大鼠體重、肝濕重及肝指數(shù)比較 見表1。與正常組相比，模型組大鼠體重、肝濕重、肝指數(shù)增加(均P<0.01)；與模型組相比，降脂瘦身湯組大鼠體重、肝濕重、肝指數(shù)下降(均P<0.01)。

表1 各組大鼠體重、肝濕重及肝指數(shù)比較

2.3 各組大鼠血清生化指標比較 見表2。模型組血清中的Glu、FFA、TG、TC、INS含量與正常組相比顯著升高(均P<0.05)；降脂瘦身湯組血清中的Glu、FFA、TG、TC、INS含量與模型組相比顯著降低(均P<0.05)。

表2 各組大鼠血清生化指標比較

2.4 各組大鼠肝臟組織HE染色結(jié)果 實驗結(jié)束后，取肝臟組織樣本進行HE染色后，在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：模型組大鼠的肝臟脂肪變性較為明顯，占全視野的80%以上，肝臟細胞變大變圓，部分肝臟細胞內(nèi)可見巨大的脂肪滴，部分肝臟細胞內(nèi)可見炎性細胞浸潤；降脂瘦身湯組同樣有肝臟細胞的脂肪變性，但與模型組比較明顯減輕，少見脂肪滴及炎性細胞的浸潤(圖1)。

圖1 各組大鼠肝臟病理組織學(xué)比較(HE染色，×400)

2.5 各組大鼠脂肪組織中NF-κB-p-p65、NF-κB-p65蛋白表達比較 見表3(圖2)。免疫印跡法測定顯示：與正常組相比，模型組的NF-κB-p-p65表達水平顯著升高；與模型組相比，降脂瘦身湯組的NF-κB-p-p65表達水平顯著降低(均P<0.05)。

表3 各組大鼠脂肪組織中NF-κB-p-p65、NF-κB-p65蛋白表達比較

圖2 各組大鼠脂肪組織中NF-κB-p-p65、NF-κB-p65蛋白表達

3 討 論

NAFLD是指除酒精和其他明確的肝臟損害因素導(dǎo)致的以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征，發(fā)病機制尚不清楚，但許多學(xué)者認為其發(fā)病機制主要是各種原因?qū)е碌闹|(zhì)代謝紊亂，使過多的脂質(zhì)在肝細胞內(nèi)沉積，導(dǎo)致肝臟脂肪變性發(fā)生炎癥壞死和纖維化[6-8]。NF-κB作為一種可被炎癥因子和反應(yīng)性氧介導(dǎo)物激活的轉(zhuǎn)錄因子，參與了肝臟細胞的再生和凋亡等進程，而p65亞基及其磷酸化在NF-κB的激活中扮演了重要的角色[9]。大量的臨床研究表明中醫(yī)藥治療脂肪肝在降低血脂、改善肝功能、緩解臨床癥狀等方面療效顯著[10-12]，可以彌補西藥在治療NAFLD的局限性。

我們通過閱讀文獻并結(jié)合大量非酒精性脂肪肝病患者的長期臨床觀察，認為非酒精性脂肪肝病為過食肥甘，損傷脾胃，脾虛氣弱，失其“游溢精氣”和“散精”功能，津液輸布異常，導(dǎo)致脂肪堆積，溢于肌膚則為肥胖，積聚于肝則為脂肪肝。同時津液輸布異常則水濕痰濁內(nèi)生，痰阻氣滯，氣不行血，血行不暢成瘀血。因痰致瘀，因瘀致痰，痰瘀交阻亦導(dǎo)致脂肪肝的發(fā)生[13]。治療應(yīng)以健脾降濁、祛瘀化痰為法，降脂瘦身湯作為我科協(xié)定處方，經(jīng)過多年的臨床應(yīng)用，被證實具有改善肥胖、降低體重、降低血脂的作用，對于非酒精性脂肪肝病具有較好的臨床療效。前期相關(guān)研究顯示降脂瘦身湯能明確調(diào)節(jié)肥胖大鼠體重、空腹血糖、甘油三酯、轉(zhuǎn)氨酶等生化指標。降脂瘦身湯重用生黃芪、黨參補氣健脾以升脾氣治其本。方中丹參具有活血調(diào)經(jīng)、祛瘀止痛、涼血消癰、除煩安神的作用，現(xiàn)代藥理研究證實其可增加肝血流量、改善肝內(nèi)微循環(huán)，從而降低肝中脂肪的含量[14-15];方中桃仁活血化瘀、潤腸通便，研究發(fā)現(xiàn)桃仁具有改善血流動力學(xué)、抗炎、提高免疫力等作用[16]。決明子、陳皮能調(diào)節(jié)肝脂代謝，抑制肝臟脂肪變性[17-18]。澤瀉、山楂可通過改善血液黏稠度，增強與脂質(zhì)代謝有關(guān)酶和蛋白的基因轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮消脂作用[19-21]。諸藥共行健脾降濁、祛瘀化痰的作用。

由此可見，降脂瘦身湯可下調(diào)NF-κB蛋白表達，阻止肝臟細胞脂肪變性，改善血清中Glu、FFA、TG、TC、INS的含量。但降脂瘦身湯作為中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，其治療作用具有多靶點、多通道的特點，值得進一步深入探討降脂瘦身湯治療非酒精性脂肪肝的機制。