銀杏內(nèi)酯B通過Nrf2/HO-1通路抑制糖尿病大鼠肝損傷機制研究

侯書鵬

(河北省涿州市醫(yī)院，河北 保定 072750)

國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)研究顯示，2019年全球糖尿病患者超過4.6億，并預(yù)計到2045年將超過7億，其中約90%屬于2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者[1]。持續(xù)高血糖能夠誘發(fā)100多種并發(fā)癥，其中肝損傷是其最常見的并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的重要原因[2]。

糖尿病性肝損傷病理機制復(fù)雜，其中氧化應(yīng)激在糖尿病性肝損傷的發(fā)生及其進展過程中發(fā)揮著重要作用，因此，抗氧化應(yīng)激被視為重要的治療靶點[3-4]。核因子E2相關(guān)因子2/血紅素加氧酶1(Nuclear factor E2 related factor 2/Heme oxygenase 1，Nrf2/HO-1)是機體非常重要的抗氧化信號通路，有研究顯示，激活Nrf2/HO-1通路能夠?qū)μ悄虿⌒愿螕p傷具有抑制作用[5]。銀杏內(nèi)酯B(Ginkgolide B，GB)是銀杏葉的主要活性成分之一，具有良好的抗氧化作用[6]。本實驗旨在探討GB對糖尿病大鼠肝臟的保護作用及其機制，為臨床應(yīng)用GB防治糖尿病肝損傷提供理論依據(jù)，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 85只清潔級雄性SD大鼠，體重200 g～240 g，購自河北省實驗動物中心提供，許可證號：SYXK(冀)2018-004。清潔環(huán)境分籠飼養(yǎng)(室溫23 ℃～25 ℃、相對濕度50%～60%、光照黑暗12 h∶12 h)1周后開展實驗。本實驗經(jīng)涿州市醫(yī)院倫理委員會審查批準(zhǔn)，倫理批件號[ZZYY(K)2020-013]。

1.2 藥物與試劑 GB購自上海詩丹德生物技術(shù)有限公司(純度≥95%，批號：201907)；二甲雙胍(Metformin，MET)購自齊魯制藥有限公司(批號：20200114)；鏈尿佐菌素(Streptozotocin，STZ)購自美國Sigma公司(批號：S0130)；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)活性、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)試劑盒和HE、TUNEL染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司(批號：BC1550、BC1560、BC0170、BC1170、BC0020、G1120、T2190)；二喹啉甲酸(Quinolinic acid，BCA)檢測試劑盒購自上海圓創(chuàng)生物科技有限公司(批號：1912027)；Nrf2、HO-1、核因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)、β-肌動蛋白(β-actin)抗體和IgG二抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司(批號：bs-1074R、bs-23397R、bs-20160R、bs-0061R、bs-0295G)；3,3二氨基聯(lián)苯胺(3,3-Diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒購自武漢博士得生物工程有限公司(批號：20191124)。高糖高脂飼料配置：基礎(chǔ)飼料67.5%、20%蔗糖、10%豬油、2.5%膽固醇。

1.3 模型制備與給藥 隨機取65只大鼠參照文獻[7]報道制備T2DM大鼠模型：給予高脂高糖飲食4周后腹腔注射濃度1%的STZ溶液(45 mg/kg)，造模成功判斷標(biāo)準(zhǔn)：注射STZ 72 h后通過血糖儀(One Touch Ⅱ型，美國強生公司)檢測空腹血糖(Fasting blood glucose，F(xiàn)BG)水平≥16.7 mmol/L。共造模成功62只大鼠(造模成功率95.38%)，剔除FBG最高和最低各1只后，將剩余60只T2DM模型大鼠按血糖值分層隨機分為模型組、GB組和MET組，各20只；取剩余20只大鼠設(shè)為正常對照組(常規(guī)飼料喂養(yǎng))。GB組1次/d灌胃給予濃度0.5 mg/ml的GB溶液(10 ml/kg)[8]，MET組1次/d灌胃給予濃度30 mg/ml的MET溶液(10 ml/kg)[9]，正常對照組和模型組1次/d灌胃給予等體積(10 ml/kg)的0.9%氯化鈉溶液，療程8周。

1.4 FBG水平和血清ALT、AST水平檢測 每組隨機取10只大鼠，經(jīng)尾靜脈采空腹血，通過血糖儀(One Touch Ⅱ型，美國強生公司)檢測各組大鼠FBG水平。腹腔注射10%水合氯醛(4 ml/kg)實施麻醉，經(jīng)腹主動脈采血并3500 r/min離心(r=10 cm)5 min取血清，通過全自動生化分析儀(LX-20型，美國貝克曼庫爾特有限公司)檢測各組大鼠血清ALT、AST水平。

1.5 HE染色法行肝組織病理學(xué)檢查與非酒精性肝臟損傷評分(NAS) 頸椎脫臼處死后取肝臟，于肝臟右葉相同部位取各只大鼠部分肝組織，置10%中性甲醛溶液中固定3 d，行石蠟包埋、石蠟切片機(RM2245型，德國Leica公司)切片(4 μm厚度)和梯度乙醇水化處理后，取部分切片行HE染色，通過光學(xué)顯微鏡(DS-5M-L1型，日本尼康儀器有限公司)觀察肝組織病理學(xué)改變。

1.6 TUNEL法觀察肝細胞凋亡狀況并計算凋亡指數(shù)(AI) 取剩余肝臟組織切片行TUNEL染色后通過光學(xué)顯微鏡(DS-5M-L1型，日本尼康儀器有限公司)觀察肝細胞凋亡狀況(細胞核黃褐色為凋亡細胞)，每張染色切片選取5個不重疊的視野計數(shù)細胞總數(shù)和凋亡細胞數(shù)，AI=(凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù))×100%。

1.7 生化分析法檢測肝組織SOD、GSH-Px活性和MDA含量 取每組剩余的10只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛(4 ml/kg)麻醉后頸椎脫臼處死后，于肝臟右葉相同部位取各只大鼠部分肝組織，稱重后按1∶8質(zhì)量體積比加入4 ℃裂解液，研磨勻漿后4 ℃、3500 r/min離心(r=10 cm)10 min取上清液，采用黃嘌呤氧化法檢測SOD活性，鉬酸銨法檢測CAT活性，硫代巴比妥酸法檢測MDA含量。

1.8 Western blot法檢測肝組織Nrf2、HO-1、NF-κB蛋白表達 于肝臟右葉相同部位取各只大鼠約100 g肝組織，加入適量4 ℃ RIPA裂解液、冰上靜置15 min后，4 ℃、12000 r/min離心(r=10 cm)20 min取上清液，BCA法檢測蛋白濃度后上樣，通過電泳儀(DYCZ-40D型，北京六一儀器廠)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰凝膠電泳分離蛋白、通過轉(zhuǎn)膜槽(DYCZ-24DN型，北京六一儀器廠)濕法轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、牛血清白蛋白(濃度5%)室溫封閉1 h，滴加Nrf2(1∶1000)、HO-1(1∶1000)、NF-κB(1∶1000)、β-actin(1∶1500)一抗后4 ℃孵育過夜，TBST溶液洗滌3次，滴加IgG二抗(1∶3000)后室溫孵育2 h，TBST溶液洗滌3次后滴加DAB顯色，根據(jù)目的條帶與β-actin(內(nèi)參)條帶灰度值比值進行半定量分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GB對T2DM大鼠FBG水平的影響 見表1。模型組FBG水平較正常對照組明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，GB組和MET組FBG水平明顯降低(均P<0.05)；GB組和MET組FBG水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

2.2 GB對T2DM大鼠血清ALT、AST水平的影響 見表1。模型組血清ALT、AST水平較正常對照組明顯升高(均P<0.05)；與模型組相比，GB組和MET組ALT、AST水平明顯降低(均P<0.05)；與MET組比，GB組ALT、AST水平明顯降低(均P<0.05)。

表1 GB對T2DM大鼠FBG水平和血清ALT、AST水平的影響

2.3 GB對T2DM大鼠肝組織病變和NAS評分的影響 正常對照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)和肝細胞形態(tài)均未見異常；模型組可見肝索結(jié)構(gòu)模糊、假性肝小葉形成，散在肝細胞空泡樣脂肪變性，炎性細胞浸潤等病變；與模型組相比，GB組和MET組大鼠肝組織上述病變明顯改善，并且GB組效果優(yōu)于MET組(圖1)。

A：正常對照組；B：模型組；C：GB組；D：MET組

2.4 GB對T2DM大鼠肝細胞凋亡的影響 見表2(圖2)。正常對照組大鼠肝組織可見很少量的凋亡細胞；模型組凋亡細胞數(shù)量較正常對照組明顯增多；與模型組相比，GB組和MET組肝細胞凋亡數(shù)量減少。模型組AI較正常對照組明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，GB組和MET組AI明顯降低(均P<0.05)；與MET組相比，GB組AI明顯升高(均P<0.05)。

A：正常對照組；B：模型組；C：GB組；D：MET組

2.5 GB對T2DM大鼠肝組織SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響 見表3。模型組肝組織SOD、GSH-Px活性較正常對照組明顯降低，MDA含量明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，GB組和MET組SOD、GSH-Px活性明顯升高，MDA含量明顯降低(均P<0.05)；與MET組相比，GB組SOD活性明顯升高且MDA含量明顯降低(均P<0.05)，兩組間GSH-Px活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 GB對T2DM大鼠肝組織SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響

2.6 GB對T2DM大鼠肝組織Nrf2、HO-1、NF-κB蛋白表達的影響 見表4(圖3)。

表4 GB對T2DM大鼠肝組織Nrf2、HO-1、NF-κB蛋白相對表達的影響

A：正常對照組；B：模型組；C：GB組；D：MET組

模型組肝組織Nrf2、HO-1表達較正常對照組明顯下調(diào)，NF-κB表達明顯上調(diào)(均P<0.05)；與模型組相比，GB組和MET組Nrf2、HO-1表達明顯上調(diào)且NF-κB明顯下調(diào)(均P<0.05)；與MET組相比，GB組Nrf2、HO-1表達明顯上調(diào)且NF-κB明顯下調(diào)(均P<0.05)。

3 討 論

長期高血糖將導(dǎo)致多器官并發(fā)癥，肝臟是糖脂代謝的主要場所，也是糖尿病最易累及的器官之一。有研究報道糖尿病性肝損傷并發(fā)率約占糖尿病患者的70%，具有發(fā)病隱匿、臨床表現(xiàn)不典型的特點，糖尿病終末期肝病致死率高于其心血管并發(fā)癥[10-11]。病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，胰島素分泌不足導(dǎo)致糖脂代謝紊亂，誘發(fā)氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)大量生成，引發(fā)氧化應(yīng)激損傷和細胞凋亡是糖尿病并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的重要病理機制[12-13]。徐源等[14]和周少英等[15]研究發(fā)現(xiàn)通過藥物干預(yù)抑制氧化應(yīng)激和細胞凋亡對糖尿病大鼠肝臟具有保護作用。

糖尿病在中醫(yī)屬“消渴”范疇，其病機在于氣陰兩虛、脾腎陽虛、瘀血濁毒內(nèi)停。銀杏是中國獨有的一種中生代孑遺植物，銀杏果和銀杏葉為我國傳統(tǒng)中藥品種。其中，銀杏葉性平、味苦澀，具有活血化瘀、通絡(luò)止痛、化濁降脂之功效。GB為銀杏葉的主要活性成分，化學(xué)結(jié)構(gòu)屬于萜類內(nèi)酯化合物，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，GB具有抑制血小板活化、抗氧化、抗凋亡等生物學(xué)活性。MET能夠提高胰島素敏感性、抑制肝糖原異生、抑制腸壁細胞攝取葡萄糖，是糖尿病治療一線用藥，并且對糖尿病所致肝損傷具有良好的治療效果[16]；此外，白福瑞[17]研究發(fā)現(xiàn)MET對中醫(yī)痰濕體質(zhì)和陰虛體質(zhì)的糖尿病均效果顯著。本實驗結(jié)果顯示，給予GB治療能夠明顯降低T2DM大鼠FBG水平和血清ALT、AST水平，明顯改善肝細胞氣球樣變、脂肪性病變、炎性細胞浸潤等病理學(xué)改變和細胞凋亡狀況，降低AI；并且GB組上述作用優(yōu)于MET組，提示GB對T2DM大鼠肝臟具有保護作用。

持續(xù)高血糖導(dǎo)致ROS大量生成與釋放，使以ROS為底物的抗氧化酶SOD、GSH-Px被過度消耗、ROS不能完全還原清除，過剩的ROS破壞生物膜、蛋白質(zhì)等生成有毒性的MDA，所以SOD、GSH-Px活性和MDA含量能夠間接反映機體氧化應(yīng)激水平[18]。本實驗結(jié)果顯示，給予GB治療能夠明顯提高T2DM大鼠肝組織SOD、GSH-Px活性并降低MDA含量，并且GB組對SOD活性和MDA含量的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于MET組，提示GB對T2DM大鼠肝組織氧化應(yīng)激損傷具有抑制作用。

生理狀態(tài)下，Nrf2與特異性抑制劑Keap1結(jié)合而無活性，ROS則能夠破壞“Nrf2-Keap1”結(jié)合體使Nrf2游離，Nrf2核轉(zhuǎn)位而誘導(dǎo)SOD、GSH-Px等轉(zhuǎn)錄與表達[19]。HO-1為Nrf2下游基因，能夠催化降解血紅素、CO等而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)[20-21]。NF-κB能夠誘導(dǎo)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3表達與活化而促進細胞凋亡，而HO-1對NF-κB表達與活化具有抑制作用[22-23]。本實驗結(jié)果顯示，給予GB治療能夠明顯上調(diào)T2DM大鼠肝組織Nrf2、HO-1表達并下調(diào)NF-κB表達，并且GB組對Nrf2、HO-1、NF-κB表達的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于MET組，這可能是GB抑制T2DM大鼠肝組織氧化應(yīng)激損傷的重要分子機制。

綜上所述，GB對糖尿病大鼠肝臟具有保護作用，可能與激活Nrf2/HO-1信號通路進而抑制氧化應(yīng)激有關(guān)。