基于Notch信號通路探討銀屑平丸對銀屑病模型小鼠皮損及血清炎性因子的調(diào)節(jié)作用

鮑秋羽，席建元，劉 梨

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410208)

銀屑病(Psoriasis，PS)是一種免疫介導(dǎo)的炎癥性、瘙癢性皮膚病，影響全球約2%～3%的人口[1]。PS有多種特征表現(xiàn)，如表皮棘皮癥、角化過度或角化不全、炎癥浸潤物或者免疫細(xì)胞廣泛存在于真皮與表皮而形成的膿皰或微小膿皰等[2-3]。根據(jù)PS發(fā)病時的臨床表現(xiàn)，可分為關(guān)節(jié)病型、膿皰型、紅皮病型、尋常型等4種類型[4]。其中尋常型PS患者占總數(shù)的90%以上，主要表現(xiàn)為紅色炎性丘疹，表面附著多層干燥的白色鱗屑，刮除可見篩狀出血，及“阿氏征”，遍布頭皮、四肢，甚至泛發(fā)全身[5-6]。中醫(yī)因其皮疹“色白而癢，瘙起而皮”而稱之為“白疕”，或因其“狀如蒼松之皮，紅白點相連”而稱之為“松皮癬”?！夺t(yī)宗金鑒》中敘述本病“皆是風(fēng)邪客肌膚，亦有血燥難外榮”，即是內(nèi)外合邪，外感六淫，不能宣泄，內(nèi)失疏導(dǎo)，肌表阻滯。PS發(fā)病原因不明，現(xiàn)代研究顯示其發(fā)病可能與環(huán)境、感染[7]、精神、遺傳[8]、病毒[9]及膽固醇[10]等相關(guān)，但具體機制仍未完全明確。在前期研究中，臨床中廣泛應(yīng)用銀屑平丸治療PS取得了顯著、穩(wěn)定的療效，同時不良反應(yīng)較小[11-12]。本實驗研究以前期研究為基礎(chǔ)，通過用咪喹莫特乳膏制造BALB/c小鼠PS樣模型，進(jìn)一步探討銀屑平丸治療PS的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF清潔級BALB/cByJ(BALB/c)小鼠(雌雄各半)購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司[動物許可證號：SCXK(湘)2019-0004)]，體重18～20 g，周齡為8～12周，共50只。將小鼠置于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動物實驗中心[溫度保持在(21±3)℃、相對濕度保持在40%～70%]飼養(yǎng)，小鼠飼料及可用飲水均由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。每組每只小鼠在實驗前予以5 d的適應(yīng)性喂養(yǎng)。實驗全程按照動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.2 實驗藥物 銀屑平丸為湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，主要藥物為生地黃、牡丹皮、紫草、丹參、白花蛇舌草、半枝蓮、大青葉、赤芍、防風(fēng)、女貞子、旱蓮草、甘草等。由我院制劑室提供(批號：20201204)；阿維A膠囊(國藥準(zhǔn)字H20010126)；5%咪喹莫特乳膏(國藥準(zhǔn)字H20030129)；白凡士林(贛食藥準(zhǔn)字F20050006)。

1.3 主要試劑與儀器 Notch受體1(Notch1)一抗(美國Proteintech，貨號：20687-1-AP)、JAGGED1蛋白(Jagged-1)1一抗(美國Proteintech，貨號：66890-1-Ig)、Hes1轉(zhuǎn)錄因子(Hes-1)一抗(美國Proteintech，貨號：66890-1-Ig)、IL-32一抗一抗(美國Proteintech，貨號：11079-1-AP)；PBS(美國Hyclone，貨號：80334412)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)白細(xì)胞介素-32(IL-32)、白細(xì)胞介素-33(IL-33)、白細(xì)胞介素-36(IL-36)試劑盒(武漢博士德生物，貨號分別為：EK1599、EK0930、EK1247)；總RNA提取試劑盒、實時熒光定量(RT-PCR)Notch1、Jagged-1、Hes-1試劑盒(購于武漢博士德生物，貨號分別為：A00033-2、MK3569、MK2837、M03286)；搖床(其林貝爾，型號：TS-92)、熒光定量RCP儀(美國Thermo，型號：PIKOREAL96)、電泳儀(北京六一，型號：DYY-2C)，轉(zhuǎn)膜儀(北京六一，型號：DYCZ-40D)。

1.4 動物分組 選用隨機分組法將50只健康小鼠分為五組，包括空白對照組、模型組、阿維A膠囊組、銀屑平丸組、阿維A膠囊+銀屑平丸組(聯(lián)合用藥組)，每組各10只小鼠。

1.5 PS小鼠模型的建立 實驗前首先將50只健康小鼠使用戊巴比妥鈉通過腹腔注射的方式進(jìn)行藥物麻醉(80 mg/kg)，隨后使用動物專用剃毛儀給麻醉后的實驗小鼠清除背部白毛，充分暴露背部皮膚以外涂藥物造模，面積約3 cm×4 cm大小，其中空白對照組小鼠使用凡士林造模，其他各組小鼠則使用5%咪喹莫特乳膏造模，1次/d，連續(xù)外用8 d。

1.6 動物給藥 銀屑平丸的臨床使用劑量標(biāo)準(zhǔn)為0.75 g/kg，根據(jù)人與實驗小鼠體重比例計算，本研究中用量與臨床等效劑量相當(dāng)，設(shè)定為6.49 g/(kg·d)。同樣公式換算可以得出阿維A膠囊組的臨床等效劑量為6 mg/(kg·d)。使用0.9 %氯化鈉溶液加熱充分溶解銀屑平丸粉劑及阿維A膠囊粉劑制備實驗所用藥液。外用藥物造模同時，空白對照組以及模型組小鼠通過灌胃針灌胃0.9 %氯化鈉溶液0.4 ml；阿維A膠囊組小鼠通過灌胃針灌胃阿維A藥液0.4 ml；銀屑平丸組小鼠以上述制備的銀屑平丸藥液通過灌胃針灌胃0.4 ml；每組小鼠每天均灌胃1次，連續(xù)用藥8 d。

1.7 動物取材 第8日24 h后，每只小鼠通過在眼球處取血1.0 ml左右，隨即將血液置于4 ℃的低溫下離心1500 r/min共5 min，并立即抽吸上層血清，置于-20 ℃的環(huán)境下保存，用于檢測本次實驗的炎性細(xì)胞因子IL-32、IL-33、IL-36。后續(xù)斷頸處死每只小鼠，使用無菌儀器在小鼠造模處留取皮膚組織，面積約1 cm×1 cm左右，分組固定保存于已經(jīng)序號標(biāo)記的福爾馬林溶液中，脫水后石蠟包埋，然后切片，進(jìn)行HE染色，用于研究組織病理、免疫熒光、Western blot及RT-PCR。

1.8 觀察指標(biāo) 觀察每組小鼠皮損變化并予以PS皮損面積及嚴(yán)重程度指數(shù)(Psoriasis Area and Severity Index,PASI)評分，ELISA法檢測各組小鼠血清IL-32、IL-33、IL-36等炎性因子的表達(dá)水平，Western blot檢測皮損組織中Notch1、Jagged-1、Hes-1等蛋白水平的表達(dá)。實時定量PCR檢測皮損組織中Notch1、Jagged-1、Hes-1等的mRNA的表達(dá)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。實驗結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠形態(tài)學(xué)觀察及PASI評分情況 見表1。對照組、阿維A膠囊組、銀屑平丸組、聯(lián)合用藥組小鼠均以咪喹莫特乳膏進(jìn)行處理，選取造模第1天及第8天的皮損情況進(jìn)行觀察，模型組小鼠可見其皮損處出現(xiàn)成片紅斑、大量鱗屑，且皮疹較為肥厚，表現(xiàn)為銀屑樣改變，阿維A膠囊組、銀屑平丸組、聯(lián)合用藥組小鼠皮損均有不同程度的緩解，其中聯(lián)合用藥組小鼠皮損改善最明顯(圖1)。與空白對照組相對比，模型組、阿維A膠囊組、銀屑平丸組、聯(lián)合用藥組小鼠背部皮損的嚴(yán)重程度通過計算PASI評分均有顯著升高(P<0.05)；與模型組相對比，阿維A膠囊組、銀屑平丸組、聯(lián)合用藥組小鼠背部皮損的嚴(yán)重程度通過計算PASI評分均有顯著降低(P<0.05)，其中聯(lián)合用藥組效果最佳(P<0.05)。

表1 各組小鼠PASI評分情況(分)

A：空白對照組；B：模型組；C：阿維A膠囊組；D：銀屑平丸組；E：聯(lián)合用藥組

2.2 各組小鼠組織病理學(xué)情況 見圖2?？梢娍瞻讓φ战MHE染色皮膚組織有完整的結(jié)構(gòu)，分別為分界清晰的角質(zhì)層和顆粒層，由多角細(xì)胞組成的外棘層以及有較多的單層柱狀細(xì)胞組成的基底層。相較于模型組中的HE染色結(jié)果，視野中出現(xiàn)角質(zhì)層斷裂，角質(zhì)層層數(shù)變少、變薄，呈現(xiàn)較不規(guī)則的角質(zhì)不全，以及大量的乳頭水腫。阿維A膠囊組、銀屑平丸組、聯(lián)合用藥組視野下可見角質(zhì)層斷裂存在不同程度的改善，其中聯(lián)合用藥組改善程度較為明顯。

A：空白對照組；B：模型組；C：阿維A膠囊組；D：銀屑平丸組；E：聯(lián)合用藥組

2.3 各組小鼠血清炎性因子情況比較 見表2。ELISA結(jié)果顯示，阿維A膠囊組、銀屑平丸組、聯(lián)合用藥組均可顯著降低小鼠血清IL-32、IL-33、IL-36水平，其中聯(lián)合用藥組效果最佳(P<0.05)，提示銀屑平丸能夠有效降低PS小鼠模型的血清炎性因子水平，同時與阿維A膠囊聯(lián)合使用效果更佳。

表2 各組小鼠血清炎性因子情況比較(ng/ml)

2.4 各組小鼠皮損組織Notch1、Jagged-1、Hes-1蛋白及mRNA表達(dá)情況 見表3、4(圖3)。Western blot及RT-PCR結(jié)果顯示，阿維A膠囊組、銀屑平丸組、聯(lián)合用藥組均可降低小鼠皮損組織的Notch1、Jagged-1、Hes-1蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)，且聯(lián)合用藥組效果最優(yōu)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示銀屑平丸能夠通過抑制小鼠皮損組織Notch信號通路降低Notch1、Jagged-1、Hes-1等蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)。

表3 各組小鼠皮損組織Notch1、Jagged-1、Hes-1蛋白表達(dá)情況比較(/β-actin )

表4 各組小鼠皮損組織Notch1、Jagged-1、Hes-1 mRNA表達(dá)情況比較(/β-actin)

A：空白對照組；B：模型組；C：阿維A膠囊組；

3 討 論

PS是一種由免疫所介導(dǎo)的以紅色斑塊并覆有鱗屑為主要臨床表現(xiàn)的慢性、炎癥性皮膚病[13]。Puig等[14]的流行病學(xué)研究顯示近年來我國PS患病率呈現(xiàn)出持續(xù)增長的趨勢。PS除發(fā)生皮膚部位的臨床表現(xiàn)外，存在部分患者發(fā)生關(guān)節(jié)疼痛不利，或伴隨有心腦血管疾病以及糖尿病等代謝性疾病，嚴(yán)重影響了PS患者的身心健康及生活質(zhì)量[15]。長期以來，PS被單純認(rèn)為是一種典型的基底細(xì)胞過度增殖性角質(zhì)形成細(xì)胞疾病，隨著T淋巴細(xì)胞在真皮層的浸潤這一重要病理特征的發(fā)現(xiàn)，PS是一種由多種細(xì)胞參與的慢性炎癥性皮膚病已經(jīng)成為一種共識[16]。角質(zhì)形成細(xì)胞和T細(xì)胞之間的交互作用是PS發(fā)生發(fā)展關(guān)鍵機制之一，并且這種交互作用需要細(xì)胞-細(xì)胞間的直接接觸誘發(fā)炎癥因子和趨化因子的大量釋放。目前多項研究表明，Notch信號通路與角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、分化及免疫系統(tǒng)關(guān)系密切，可能是PS發(fā)病機制的重要組成部分，而角質(zhì)形成細(xì)胞和T細(xì)胞及其他免疫細(xì)胞的交互作用在PS發(fā)生、發(fā)展中對于角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和皮膚局部炎癥發(fā)生至關(guān)重要，但關(guān)于T細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞之間如何進(jìn)行交互作用來引發(fā)PS仍未被很好地闡述[17]。

Notch信號途徑家族是一個在進(jìn)化上十分保守的跨膜受體蛋白家族，在多種組織和器官的早期發(fā)育過程中，其家族成員對細(xì)胞的發(fā)育、生長、增殖及凋亡都起著重要的調(diào)控作用[18]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)PS患者皮損中Notch受體、配體表達(dá)異常，如Sondhi等[19]發(fā)現(xiàn)PS患者表皮內(nèi)的Notch1、Jagged-1、Hes-1等分子的表達(dá)顯著高于健康人群，提示Notch信號通路與PS的發(fā)生關(guān)系密切，是近年來PS的研究熱點之一。此外，Notch信號還參與了T細(xì)胞的發(fā)育、活化與增殖、細(xì)胞因子的分泌等，同時亦參與了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生、擴增及功能發(fā)揮。Edigin等[20]報道當(dāng)致敏的CD4+T細(xì)胞受到異性抗原刺激后，Notch中的關(guān)鍵蛋白Notch1、Jagged-1、Hes-1等受體的mRNA表達(dá)水平均顯著升高，同時血清中IL-32、IL-33、IL-36等炎性因子顯著上升，提示Notch信號在T細(xì)胞活化中起到重要作用，促進(jìn)了T細(xì)胞的增殖。以上證據(jù)都表明，Notch信號不僅是表皮角質(zhì)異常增殖的關(guān)鍵，同時也是T細(xì)胞活化的重要閥門，導(dǎo)致角質(zhì)生成細(xì)胞-T細(xì)胞功能失衡，進(jìn)而出現(xiàn)皮膚炎癥應(yīng)答級聯(lián)放大，可能是PS發(fā)病關(guān)鍵分子機制之一。

從古至今，PS頑固難愈，給廣大醫(yī)者及患者都帶來嚴(yán)重困擾。古今各醫(yī)家根據(jù)自身臨床經(jīng)驗已開創(chuàng)多種關(guān)于PS的治療辦法，在繼承前人經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，并結(jié)合多年的臨床實踐，認(rèn)為PS是內(nèi)外邪相因而為病，外邪總因風(fēng)、濕、熱、燥、毒蘊積肌腠，內(nèi)邪多因素體血分熱盛，又因飲食辛辣厚膩，情志不舒而化熱入里，血熱毒邪久蘊陰損津耗，化生血燥；或邪熱久蘊血分，致使?fàn)I陰燔灼而營血虧耗，化為血虛；或血熱煎熬津液，日久凝生血瘀，瘀熱膠結(jié)；內(nèi)外因相合，化為熱、虛、燥、瘀，氣血失于條暢，肌膚失于榮養(yǎng)而致紅斑、鱗屑迭生，以生疕。導(dǎo)師根據(jù)該病的病因病機，結(jié)合多年臨床經(jīng)驗創(chuàng)立“涼血養(yǎng)陰，清熱解毒”這一治療原則，并研發(fā)出“銀屑平丸”，該丸劑由生地黃、牡丹皮、紫草、丹參、白花蛇舌草、半枝蓮、大青葉、赤芍、防風(fēng)、女貞子、旱蓮草、甘草組成。方中生地黃味甘而苦寒，以寒之性涼解血熱，以其養(yǎng)陰之效顧護(hù)津液，使邪氣祛除同時不損正氣，重用為君藥。赤芍、丹皮、丹參味苦性微寒，均以血治，達(dá)肝經(jīng)清疏郁滯之火毒，入血分清散蘊結(jié)之瘀熱，涼解血熱之時又能消散瘀血，防止內(nèi)熱與血相結(jié)；紫草甘寒同入血分，清解血分熱毒，活血透泄斑疹；白花蛇舌草酸涼，半枝蓮、大青葉苦寒，三藥相合，清泄血熱，涼解火毒，功?；馃岫臼?，共為臣藥。血熱內(nèi)蘊，煎熬津液，津傷不能濡潤肌膚，女貞子、墨旱蓮互為佐藥入肝腎以滋養(yǎng)肝腎之陰，益下榮上，養(yǎng)陰潤燥以生津化液榮養(yǎng)肌膚。防風(fēng)辛散驅(qū)邪外出，且為治風(fēng)潤藥，功善疏風(fēng)止癢，風(fēng)祛則癢止；甘草功善清熱解毒并能調(diào)和諸藥，與防風(fēng)共為使藥，諸藥相合，共奏涼血養(yǎng)陰，清熱解毒之效。

本研究結(jié)果表明，相對于單獨使用阿維A膠囊或銀屑平丸，聯(lián)合用藥的效果最佳，亦顯示出中西醫(yī)結(jié)合治療本病的獨特優(yōu)勢。本次實驗通過銀屑平丸干預(yù)PS小鼠模型，結(jié)果顯示銀屑平丸能有效改善PS小鼠模型的皮損及病理損害，有效降低血清炎性因子水平，同時抑制Notch信號通路Notch1、Jagged-1、Hes-1等關(guān)鍵蛋白及mRNA的表達(dá)，同時與阿維A膠囊聯(lián)合使用起到協(xié)同增效作用。說明銀屑平丸可通過抑制Notch信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)，緩解PS角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增殖分化以及炎性反應(yīng)，加速皮膚病理損害的愈合，最終起到治療PS的臨床效果。