針刀療法對(duì)肩周炎模型兔肩關(guān)節(jié)囊局部組織中基因蛋白表達(dá)的影響

張照慶，王小飛，尹 晶，武 歡，金 瑋

(武漢市第三醫(yī)院，湖北 武漢 430001)

肩關(guān)節(jié)周圍炎,簡(jiǎn)稱肩周炎,是肩關(guān)節(jié)周圍肌肉、肌腱、韌帶和關(guān)節(jié)囊等軟組織的慢性無菌性炎癥性疾病,據(jù)流行病學(xué)調(diào)查,該病在我國(guó)人群中的發(fā)病率高達(dá)5%,多發(fā)于40歲以上的中老年人,女性多于男性[1]。目前認(rèn)為盂肱關(guān)節(jié)增厚、局部滑膜組織炎癥狀態(tài)和疼痛遞質(zhì)的釋放是引起肩周炎疼痛及活動(dòng)受限的主要原因[2]。近年來，研究表明，肩周炎患者肩關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥介質(zhì)(IL-6)的上調(diào)在其疼痛產(chǎn)生機(jī)制中起著重要作用[3]，同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)特定內(nèi)源性蛋白因子(HMGB1)與肩關(guān)節(jié)疼痛有密切相關(guān)性[4]，ASIC是一類由細(xì)胞外酸化所激活的陽離子通道，ASIC3為其中一個(gè)亞基蛋白，與關(guān)節(jié)炎性疼痛密切相關(guān)[5]；中醫(yī)針刀療法作為一種治療肩周炎的有效方法，文獻(xiàn)研究證實(shí)，在改善肩關(guān)節(jié)功能活動(dòng)、減少肩關(guān)節(jié)疼痛介質(zhì)和降低炎性因子水平具有顯著作用[6-8]。

本研究建立在針刀可改善肩周炎引起的肩關(guān)節(jié)疼痛和活動(dòng)受限有效性基礎(chǔ)上，觀察針刀治療肩周炎關(guān)節(jié)囊滑膜組織形態(tài)學(xué)變化，檢測(cè)肩關(guān)節(jié)滑膜內(nèi)炎性因子6(IL-6)和內(nèi)源性蛋白因子(HLGB1)及酸離子通道蛋白(ASIC3)的蛋白和基因表達(dá)，探討針刀治療肩周炎的療效和可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物 健康新西蘭雄性大白兔30只，6月齡，由武漢市萬千佳興生物科技有限公司提供，許可證號(hào)SCXK(鄂)2016-0011，體重(2.5±0.5)kg，飼養(yǎng)環(huán)境：武漢市第三醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，室溫20～24 ℃,濕度40%～60%，保持實(shí)驗(yàn)環(huán)境舒適、安靜衛(wèi)生。

1.2 動(dòng)物分組和模型制備 采用隨機(jī)數(shù)字表法分為三組，空白組、模型組、針刀組，每組各10只；實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》(中華人民共和國(guó)科技部頒發(fā))[9]。所有動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，1籠1只，單獨(dú)喂養(yǎng)，健康飲食、攝水；空白組正常飼養(yǎng)，不做治療；模型組造模后正常飼養(yǎng)，不做治療。

1.3 針刀干預(yù)方法 造模成功后，固定模型兔于兔臺(tái)，觸診患肢肩關(guān)節(jié)，常規(guī)碘伏消毒，定位喙突外緣、岡上肌腱大結(jié)節(jié)處、結(jié)節(jié)間溝，采用漢章1型4號(hào)針刀與皮膚垂直方向快速刺入，刀口與主要神經(jīng)血管、肌肉走向平行，行縱豎橫剝2～3刀，術(shù)畢，迅速用無菌紗布按壓創(chuàng)口1 min，于造模成功后第2天、第8天、第15天、第22天各治療1次，共4次，不予其他處理。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 ZD-9556多功能水平搖床、10%水合氯醛(武漢卡引生物技術(shù)有限公司)、K3型低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)、DYCP-31A型電泳儀、DY-Ⅲ型電泳槽 (美國(guó)伯樂);凝膠成像系統(tǒng)Image Quant LAS 4000型 (德國(guó)GE公司)，F(xiàn)S/FASS030石蠟切片機(jī)(德國(guó)LETIZ產(chǎn))、光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS株式會(huì)社)、臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、冷凍離心機(jī)(湖南湘儀儀器)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Life technologies公司)、Western blot試劑盒。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 模型制作：造模采用機(jī)械加冰敷造模法[10-12]：將兔右肩部外側(cè)脫毛,面積為6 cm×6 cm，俯臥位固定,后肢和左前肢與兔臺(tái)固定，將模型兔患肢遠(yuǎn)端與IVHE-0電動(dòng)振蕩器(國(guó)營(yíng)東臺(tái)糧油機(jī)械廠生產(chǎn))固定連接，以240次/min頻率，l.5 cm振幅平行搖動(dòng)右肩關(guān)節(jié)，6 h/d，搖動(dòng)過程前后密切觀察模型兔情況，防止右前肢脫離振蕩器，預(yù)防受傷，機(jī)械勞損后的模型兔固定于兔臺(tái)，每天即刻將塑料內(nèi)裝冰塊外敷大鼠左肩部6 h/d，機(jī)械加冰敷持續(xù)3 d，冰塊融化后及時(shí)更換。3 d后觀察兔右前肢形態(tài)變化，若呈“外翻”狀態(tài)，運(yùn)動(dòng)受限，主動(dòng)爬行時(shí)身體傾斜，出現(xiàn)關(guān)節(jié)活動(dòng)不利、疼痛反應(yīng)增強(qiáng)，并且局部軟組織均輕度腫脹，肉眼可見不同程度充血或瘀斑時(shí)，提示肩周炎模型兔造模成功[13]。

1.5.2 干預(yù)方法：空白組給予正常飼養(yǎng),不做治療；模型組：造模后正常飼養(yǎng)，不做治療。針刀組：固定模型兔于兔臺(tái)，觸診患肢肩關(guān)節(jié)，常規(guī)碘伏消毒，定位喙突外緣、岡上肌腱大結(jié)節(jié)處、結(jié)節(jié)間溝，采用漢章1型4號(hào)針刀與皮膚垂直方向快速刺入，刀口與神經(jīng)血管、肌肉走向平行，以松為度，于造模成功后第2天、第8天、第15天、第22天各治療1次，共4次。

1.5.3 標(biāo)本采集：用空氣栓塞法處死實(shí)驗(yàn)兔后迅速剝?nèi)∮覀?cè)肩關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜，取下關(guān)節(jié)滑膜囊及周圍組織，在冰面上用0.9%氯化鈉溶液漂洗干凈，取大小均約2 cm×2 cm×0.3 cm關(guān)節(jié)滑膜囊，于20%多聚甲醛溶液中固定1周，用于病理組織切片HE染色；取大小均約1 cm×1 cm關(guān)節(jié)滑膜囊及周圍組織，液氮速凍24 h后，轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存，用于RT-PCR和Western blot檢測(cè)。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)

1.6.1 HE染色：將新鮮取材局部樣本組織，用4%多聚甲醛固定1周，取出后將目的部位組織修剪平整，經(jīng)過脫水機(jī)內(nèi)依次梯度酒精脫水、包埋、切片、蘇木伊紅染色以及脫水封片步驟后，采用光學(xué)顯微鏡觀察各組局部滑膜肌組織病理形態(tài)。

1.6.2 蛋白免疫印跡法(Western blot)：細(xì)胞裂解法提取肩關(guān)節(jié)囊組織塊總蛋白；BCA法測(cè)定蛋白濃度，Larry法測(cè)蛋白濃度，取40 μg蛋白，在蛋白樣品中加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃沸水浴5 min。配制分離膠、濃縮膠，按濃縮膠80 V、分離膠120 V進(jìn)行恒壓電泳，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)印，將轉(zhuǎn)好的膜置于封閉液封閉，37 ℃，1 h，隨后除去封閉液，加入稀釋好的一抗(稀釋比例：IL-6為1∶500，HMGB1和ASIC3為1∶1000)，4 ℃，孵育過夜，回收一抗，用TBST清洗3次，每次5 min，加入稀釋好的二抗(稀釋比例為1∶10000)，室溫下孵育30 min，用TBST于搖床上清洗4次，每次5 min。滴加ECL溶液于膜上，暗室中進(jìn)行曝光，顯影、定影。以GAPDH為內(nèi)參測(cè)定IL-6、HMGB1和ASIC3蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6.3 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)：IL-6、HMGB1、ASIC3mRNA表達(dá)水平將兔肩關(guān)節(jié)局部組織塊從液氮中取出,研磨后將粉末裝入預(yù)冷的Ep管中,每管加入1 ml Trizol,用槍吹打數(shù)次,室溫放置5 min,獲取總RNA提取物。取3 μl總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以獲取cDNA。PCR反應(yīng)體系，包含樣本體系1.5 μl及引物體系18.5 μl。取3 μl總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以獲取cDNA。PCR反應(yīng)體系包含樣本體系1.5 μl及引物體系18.5 μl。用相對(duì)定量2-△△CT法分析結(jié)果,得到各個(gè)樣本目的基因的CT值-各個(gè)樣本的看家基因。見表1。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。經(jīng)檢測(cè)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，根據(jù)數(shù)據(jù)是否符合方差齊性分別采用單因素方差分析(組間比較采用Tukey檢驗(yàn))或非參數(shù)秩和檢驗(yàn)(組間比較采用Dunn’s檢驗(yàn))等統(tǒng)計(jì)方法。當(dāng)P<0.05時(shí)，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肩關(guān)節(jié)周圍組織肉眼觀察 空白組肩關(guān)節(jié)形態(tài)正常，打開關(guān)節(jié)腔無積液；模型組肩關(guān)節(jié)周圍組織充血腫脹明顯，周圍肌肉有組織粘連，打開關(guān)節(jié)腔時(shí)有大量黃色積液流出；針刀組兔肩關(guān)節(jié)周圍肌肉肥厚和粘連情況較輕，打開關(guān)節(jié)腔時(shí)黃色積液相對(duì)較少。

2.2 肩關(guān)節(jié)周圍組織病理學(xué)觀察 空白組：滑膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)稀疏，毛細(xì)血管較少，肌腱纖維排列整齊，無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組：滑膜上皮層毛細(xì)血管增多，序列紊亂，可見纖維素滲出，肌腱外膜上皮細(xì)胞增生，肌纖維斷裂，肌間質(zhì)中纖維素滲出、機(jī)化和結(jié)締組織增生；針刀組：滑膜細(xì)胞排列同正常組，肌腱纖維排列整齊，較模型組損傷部位明顯減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)相對(duì)較少，同時(shí)模型組病理組織修復(fù)情況較針刀組差(圖1)。

圖1 各組大鼠肩關(guān)節(jié)局部組織情況(HE染色,×200)

2.3 各組肩關(guān)節(jié)滑膜中IL-6、HMGB1和ASIC3蛋白表達(dá)水平比較 見表2(圖2)。空白組、模型組和針刀組間HMGB1、IL-6及ASIC3蛋白表達(dá)水平比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；與空白組比較，模型組家兔肩關(guān)節(jié)滑膜中HMGB1、IL-6和ASIC3蛋白表達(dá)水平比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；與模型組比較，針刀組肩關(guān)節(jié)滑膜中HMGB1、IL-6、ASIC3蛋白表達(dá)水平均降低；與空白組相比，針刀組肩關(guān)節(jié)滑膜中HMGB1、IL-6、ASIC3蛋白表達(dá)水平增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。表明針刀療法可以顯著減少肩周炎模型兔IL-6、HMGB1和ASIC3的蛋白表達(dá)水平。

圖2 各組肩關(guān)節(jié)滑膜中IL-6、HMGB1和ASIC3蛋白條帶

2.4 各組肩關(guān)節(jié)囊中IL-6、HMGB1、ASIC3 mRNA表達(dá)水平比較 見表3?？瞻捉M、模型組和針刀組間IL-16、HMGB1及ASIC3基因表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；與空白組比較，模型組兔肩關(guān)節(jié)滑膜中IL-16、HMGB1和ASIC3基因表達(dá)水平增加(均P<0.05)；與模型組比較，針刀組肩關(guān)節(jié)滑膜中IL-6、HMGB1與ASIC3基因表達(dá)水平降低(均P<0.05)；與空白組相比，針刀組肩關(guān)節(jié)滑膜中IL-6、HMGB1和ASIC3基因表達(dá)水平顯著增加(均P<0.05)。表明針刀療法可以顯著減少肩周炎模型兔IL-6、HMGB1和ASIC3的基因表達(dá)水平。

表2 各組肩關(guān)節(jié)滑膜中IL-6、HMGB1和ASIC3蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

表3 各組肩關(guān)節(jié)囊中IL-6、HMGB1和ASIC3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

3 討 論

肩周炎是以肩關(guān)節(jié)疼痛和功能受限為主要癥狀的病癥，目前其機(jī)制研究集中于炎癥反應(yīng)和纖維化相關(guān)細(xì)胞因子[14-15]。中醫(yī)認(rèn)為肩周炎歸類于“痹癥”或“漏肩風(fēng)”等范疇，其病因病機(jī)主要為肝腎虧虛、風(fēng)寒濕邪侵襲，氣機(jī)阻滯不通而致病[16]，造成肩關(guān)節(jié)廣泛粘連、軟組織瘢痕、攣縮等引起肩關(guān)節(jié)活動(dòng)受限和疼痛。針刀療法可對(duì)局部軟組織進(jìn)行松解，可降低自由基、促進(jìn)炎癥因子吸收、修復(fù)局部組織攣縮[17],將生物力學(xué)與人體解剖學(xué)相結(jié)合來發(fā)揮治療軟組織疼痛及骨關(guān)節(jié)病的作用[18]，是中醫(yī)“扶正祛邪”和“舒筋止痛”作用的體現(xiàn)。

IL-6作為重要的炎性細(xì)胞因子，也是重要的致痛因子，可誘導(dǎo)機(jī)械性異常性疼痛和熱痛覺過敏[19],同時(shí)IL-6可以充當(dāng)中樞敏化介質(zhì)導(dǎo)致A-δ纖維和C纖維初級(jí)傳入神經(jīng)元變得異常敏感，從而導(dǎo)致外周敏化產(chǎn)生疼痛[20],廣泛參與機(jī)體炎癥反應(yīng)與自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程[21]。HMGB1是一種與染色質(zhì)松散相關(guān)的非組蛋白脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白，可以介導(dǎo)先天免疫反應(yīng)的激活，包括趨化和細(xì)胞因子的釋放,在無菌損傷，缺血性損傷中可誘發(fā)典型的炎癥反應(yīng)[22-23]，HMGB1可以誘導(dǎo)分解代謝的分子，例如基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的表達(dá)，這些分子負(fù)責(zé)關(guān)節(jié)軟骨的分解，持續(xù)產(chǎn)生HMGB1及其下游促炎和分解代謝分子，最終會(huì)導(dǎo)致軟組織損傷。Thankam等[24]通過對(duì)15例肩袖損傷后疼痛患者的局部組織采用組織學(xué)、免疫熒光、RT-PCR等檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞和HMGB1過表達(dá)，并且和肩關(guān)節(jié)疼痛嚴(yán)重程度密切相關(guān)，證實(shí)了HMGB1是參與了肩關(guān)節(jié)疼痛的重要影響因子之一。疼痛相關(guān)ASIC3，可以引起關(guān)節(jié)損傷而導(dǎo)致痛覺過敏的產(chǎn)生，廣泛分布于肩關(guān)節(jié)滑膜中，通過PAR2信號(hào)傳導(dǎo)中樞誘導(dǎo)外周敏化，參與痛覺過敏的外周機(jī)制，在慢性炎癥性疼痛病理過程中產(chǎn)生重要作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，針刀療法在治療肩周炎中作用機(jī)制可能是通過減少IL-6、HMGB1表達(dá)水平和下調(diào)ASIC3的釋放來改善肩周炎局部病理變化，可抑制滑膜組織增殖、延緩肩關(guān)節(jié)囊組織的炎性浸潤(rùn),從而有效緩解肩周炎疾病的進(jìn)一步發(fā)展，本實(shí)驗(yàn)因樣本量有限，其具體作用機(jī)制有待更進(jìn)一步探討。