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    藏藥中有效成分與功能蛋白的相互作用與相互識(shí)別

    2021-08-18 11:58:56孫芳云張曉英李巖松
    中國(guó)民族民間醫(yī)藥 2021年12期
    關(guān)鍵詞:色氨酸藏藥常數(shù)

    冀 旭 孫芳云 趙 勤 張曉英 李巖松

    1.西藏民族大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,陜西 咸陽(yáng) 712082;2.西藏民族大學(xué)藏藥檢測(cè)技術(shù)教育部工程研究中心,陜西 咸陽(yáng) 712082

    在生物學(xué)中,分子間相互作用與識(shí)別是形成高度專一性識(shí)別、反應(yīng)及調(diào)控等過程的基礎(chǔ),諸如底物與受體的結(jié)合識(shí)別、酶反應(yīng)及抗體-抗原的結(jié)合識(shí)別等。而在藥學(xué),尤其是民族藥的開發(fā)研究領(lǐng)域,分子間相互作用也是一個(gè)重要的研究?jī)?nèi)容,它在基于傳統(tǒng)藥物的新藥篩選開發(fā)、藥物藥效學(xué)及藥動(dòng)學(xué)研究中均得到廣泛應(yīng)用。藏藥在我國(guó)有著悠久的應(yīng)用歷史、深厚的民眾基礎(chǔ)及豐富的藏民族文化內(nèi)涵。近年來,藏藥以其獨(dú)特的功效受到越來越多研究者的關(guān)注,對(duì)其的現(xiàn)代化研究與應(yīng)用也日益得到重視。而關(guān)于藏藥當(dāng)中有效成分與離子通道、膜蛋白等藥物受體、功能蛋白的相互作用與識(shí)別研究還未見報(bào)道。

    秦艽為龍膽科植物秦艽GentianamacrophyllaPall.,麻花秦艽GentianastramineaMaxim.,粗莖秦艽GentianacrassicaulisDuthie ex Burk.或小秦艽GentianadahuricaFisch.的干燥根[1],屬于常用藏藥[2-4],藏文名為吉解嘎保、吉解那保等[5]。該藥物為藏族人民的繁衍生息做出了重要的貢獻(xiàn),如《四部醫(yī)典》中記載:“吉解嘎??芍瘟瓱岷湍憻帷保弧度缫鈱殬洹分杏涊d:“吉解嘎??芍寡谥坪笸夥笙[、愈傷。吉解那保可消炎,治四肢關(guān)節(jié)紅腫,喉蛾,咽喉嘶啞”;《晶珠本草》中記載:“吉解那可用于消腫、喉蛾、干黃水”等[5]。櫟癭酸為一種五環(huán)三萜類化合物,是2015版《中國(guó)藥典》中規(guī)定秦艽藥材的藥材鑒別成分[1],其藥理臨床作用如抗炎也常見報(bào)道[6]。

    本研究以藏藥秦艽為代表,選用秦艽中有效成分櫟癭酸,利用光譜學(xué)方法研究了櫟癭酸與以運(yùn)載蛋白牛血清白蛋白(BSA)為代表的功能蛋白之間的相互作用與識(shí)別過程,旨在進(jìn)一步理解傳統(tǒng)藏藥有效成分的作用機(jī)制。并以此為例,建立一套可用于表征其它藏藥有效成分與功能蛋白如受體、離子通道等之間相互作用與識(shí)別的實(shí)驗(yàn)方法,進(jìn)而為傳統(tǒng)藏藥作用機(jī)制的現(xiàn)代化分析研究,以及基于傳統(tǒng)藏藥的藥物開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及理論支撐。

    1 儀器與試劑

    1.1 儀器 PerkinElmer LS55熒光光譜儀及PTP-1 Peltier system控溫控件,Perkin Elmer Lambda 25紫外-可見分光光度儀器光度計(jì),Millipore Milli-Q超純水系統(tǒng)。

    1.2 主要試劑 櫟癭酸(中國(guó)食品藥品檢定研究院,98%),用二甲基亞砜(DMSO,Sigma-Aldrich,≥99.9%)配置成濃度為4.0×10-2mol/L的儲(chǔ)備溶液。BSA(Amresco,>98%)用0.01mol/L的PBS配置成1×10-6mol/L的儲(chǔ)備溶液。華法林(中國(guó)食品藥品檢定研究院,98%),布洛芬(大連美侖生物技術(shù)有限公司,>98%),實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 熒光猝滅實(shí)驗(yàn) 移取1×10-6mol/L的BSA溶液 2 mL置于石英比色皿中并分別于288K、298K和308K實(shí)驗(yàn)溫度下測(cè)定樣品的熒光發(fā)射光譜。測(cè)定完成后,用微量注射器分別向其中注入不同體積的4.0×10-2mol/L的櫟癭酸儲(chǔ)備液進(jìn)行混合,使得櫟癭酸終濃度分別為5×10-6、10×10-6、15×10-6、20×10-6、25×10-6、35×10-6mol/L,混合完成后分別于相應(yīng)溫度下反應(yīng)至穩(wěn)定后再次測(cè)定其熒光發(fā)射光譜。相關(guān)儀器參數(shù)如下:激發(fā)波長(zhǎng)278 nm,激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫寬度均為3 nm,掃描速度1200 nm/min,掃描范圍300~400 nm。

    2.2 結(jié)合位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn) 移取1×10-6mol/L的BSA 溶液2 mL置于石英比色皿中,分別注入華法林/布洛芬儲(chǔ)備液,使對(duì)應(yīng)藥品終濃度均分別為1×10-6mol/L,在298 K溫度下進(jìn)行相互作用30 min。反應(yīng)完成后,用微量進(jìn)樣器分別向其中加入不同體積的櫟癭酸儲(chǔ)備液,使得櫟癭酸終濃度分別為5×10-6、10×10-6、15×10-6、20×10-6、25×10-6、35×10-6mol/L,混合完成至反應(yīng)穩(wěn)定后再次測(cè)定其熒光發(fā)射光譜。相關(guān)儀器參數(shù)如2.1。

    2.3 同步熒光 于298K下移取1×10-6mol/L的BSA 溶液2 mL置于石英比色皿中,測(cè)定樣品同步熒光光譜。測(cè)定完成后,用微量注射器分別向其中加入不同體積的櫟癭酸儲(chǔ)備液進(jìn)行混合,使得櫟癭酸終濃度分別為5×10-6、10×10-6、15×10-6、20×10-6、25×10-6、35×10-6mol/L,反應(yīng)穩(wěn)定后于298 K溫度下分別測(cè)定其同步熒光光譜。相關(guān)儀器參數(shù)如下:當(dāng)測(cè)定Δλ=60 nm的同步熒光光譜時(shí),激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫寬度均為3 nm。當(dāng)測(cè)定Δλ=15 nm的同步熒光光譜時(shí),激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫寬度均為8 nm。掃描速度均為1200 nm/min,掃描范圍220~320 nm。

    2.4 Rees紅邊激發(fā)熒光位移的測(cè)定 分別在激發(fā)波長(zhǎng)為266、272、278、284、290和296 nm下,測(cè)定1×10-6mol/L的BSA溶液在298 K溫度下的熒光發(fā)射光譜,之后在BSA溶液中分別加入不同體積的櫟癭酸儲(chǔ)備液,使得櫟癭酸終濃度分別為0×10-6、5×10-6、15×10-6、20×10-6、25×10-6mol/L,并測(cè)定其在不同激發(fā)波長(zhǎng)下對(duì)應(yīng)熒光發(fā)射光譜。相關(guān)儀器參數(shù)如下:激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫寬度均為3 nm,掃描速度1200 nm/min,掃描范圍300~400 nm。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 BSA與櫟癭酸結(jié)合過程的熒光發(fā)射光譜分析 圖1所示為BSA與櫟癭酸在298 K溫度下作用過程的熒光發(fā)射光譜,可以看出,伴隨著櫟癭酸濃度的上升,樣品體系發(fā)生了熒光猝滅現(xiàn)象,熒光強(qiáng)度由754.3下降至487.9,同時(shí)最大熒光發(fā)射峰位從341 nm輕微的藍(lán)移至335.5 nm。這一現(xiàn)象表明BSA與櫟癭酸之間發(fā)生了相互作用,熒光發(fā)射峰位輕微藍(lán)移表明蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生了細(xì)微的改變,蛋白結(jié)構(gòu)的疏水性有了輕微的增加[7]。

    圖1 BSA與櫟癭酸作用的熒光發(fā)射光譜注:從上至下櫟癭酸濃度分別為0×10-6、5×10-6、10×10-6、15×10-6、20×10-6、25×10-6、35×10-6 mol/L

    3.2 BSA與櫟癭酸相互作用的熒光猝滅類型判斷 為證實(shí)BSA與櫟癭酸相互作用時(shí)產(chǎn)生的熒光猝滅的特性,本研究利用Stern-Volmer方程進(jìn)行判斷,方程如下所示:

    F0/F=1+KSV·[Q]=1+Kq·τ0[Q]

    (1)

    式中F0和F分別表示在加入熒光猝滅劑前后的內(nèi)源熒光發(fā)射強(qiáng)度;KSV為熒光基團(tuán)Stern-Volmer常量;[Q]為熒光猝滅劑濃度;Kq為熒光猝滅過程的猝滅速率常量,動(dòng)態(tài)猝滅最大速率常量約等于2.0×1010L/mol/s[8];τ0為熒光物質(zhì)中熒光基團(tuán)的平均熒光壽命,對(duì)蛋白質(zhì)分子來說約為10-8s[9]。取不同溫度下BSA自身熒光發(fā)射強(qiáng)度F0及加入不同濃度櫟癭酸后BSA的最大熒光發(fā)射強(qiáng)度F,以F0/F對(duì)櫟癭酸濃度[Q]做線性擬合,結(jié)果如圖2所示。由所得直線的斜率獲得不同溫度下的猝滅常數(shù)KSV以及猝滅速率常數(shù)Kq,結(jié)果匯總于表1。

    圖2 不同溫度下櫟癭酸對(duì)BSA熒光猝滅的Stern-Volmer曲線

    從表1中可以看出,伴隨著反應(yīng)溫度的上升,BSA與櫟癭酸結(jié)合過程中KSV持續(xù)下降,說明溫度升高并不利于二者的結(jié)合,因?yàn)闇囟壬哂欣趧?dòng)態(tài)猝滅的發(fā)生與發(fā)展,所以該猝滅過程不是由擴(kuò)散和碰撞所引起的動(dòng)態(tài)猝滅。同時(shí)該反應(yīng)Kq均大于最大動(dòng)態(tài)猝滅速率常量2×1010L·mol-1·s-1,所以BSA與櫟癭酸結(jié)合過程所產(chǎn)生的熒光猝滅是由于BSA與櫟癭酸生成了基態(tài)絡(luò)合物所引起的靜態(tài)猝滅。

    表1 不同溫度下櫟癭酸對(duì)BSA的熒光猝滅常數(shù)KSV和猝滅速率常數(shù)Kq

    3.3 BSA與櫟癭酸相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù) 對(duì)于靜態(tài)猝滅過程來說,熒光體的熒光強(qiáng)度與猝滅劑濃度之間符合以下公式[10]:

    lg[(F0-F)/F)=lgKa+nlg[Q]

    (2)

    式中F0、F仍分別代表猝滅劑不存在以及存在時(shí)樣品體系的熒光強(qiáng)度;Ka指蛋白質(zhì)分子與小分子物質(zhì)之間的結(jié)合常數(shù);n是蛋白質(zhì)分子與小分子物質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。在不同溫度下,以lg[(F0-F)/F]對(duì)lg[Q]做線性擬合,結(jié)果如圖3所示。由所得直線的斜率及截距即可獲得不同溫度下的結(jié)合常數(shù)Ka以及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n,結(jié)果匯總于表2。

    圖3 不同溫度下櫟癭酸猝滅BSA的lg[(F0-F)/F]對(duì)lg[Q]圖■:288K,●:298K,▲:308K

    從表2中可以看出,櫟癭酸對(duì)BSA熒光猝滅過程的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)介于0.8181~0.8149近乎于1,表明理論上每個(gè)BSA分子能夠結(jié)合一個(gè)櫟癭酸分子。同時(shí)伴隨反應(yīng)溫度的上升,BSA與櫟癭酸的結(jié)合常數(shù)由最初的3.242×103L·mol-1下降至1.620×103L·mol-1,同時(shí)結(jié)合位點(diǎn)數(shù)由0.8181下降至0.8149,可以看出溫度升高并不利于結(jié)合的進(jìn)行,這也從另一方面說明BSA與櫟癭酸的結(jié)合過程中形成了不穩(wěn)定的復(fù)合物,隨著實(shí)驗(yàn)溫度的增加,復(fù)合物的穩(wěn)定性下降,二者之間發(fā)生的熒光猝滅現(xiàn)象屬于靜態(tài)猝滅過程。

    表2 櫟癭酸對(duì)BSA熒光猝滅的結(jié)合常數(shù)Ka以及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n

    3.4 BSA與櫟癭酸相互作用的熱力學(xué)參數(shù)和作用力類型 根據(jù)Ross定律,本研究可利用蛋白質(zhì)與小分子配體反應(yīng)過程熱力學(xué)參數(shù)的變化即可確定蛋白質(zhì)分子與小分子配體之間的作用力類型:若反應(yīng)過程焓變?chǔ)>0,熵變?chǔ)>0,則二者之間作用力主要為為疏水作用力;若反應(yīng)過程ΔH<0,ΔS>0,則二者之間作用力主要為靜電作用力;若反應(yīng)過程ΔH<0,ΔS<0,則二者之間作用力主要為氫鍵和范德華力[11]。對(duì)于蛋白質(zhì)分子與小分子配體結(jié)合過程,其熱力學(xué)參數(shù)之間符合以下關(guān)系[12]:

    lnKa=-ΔH/RT+ΔS/R,ΔG=ΔH-TΔS

    (3)

    式中Ka為不同溫度下二者之間的結(jié)合常數(shù);氣體常數(shù)R=8.314 J/(K·mol);T為反應(yīng)絕對(duì)溫度。以櫟癭酸與BSA在不同溫度下相互作用過程的lnKa對(duì)1/T作圖,由斜率與截距即可分別計(jì)算出二者結(jié)合過程的焓變?chǔ)以及熵變?chǔ),進(jìn)一步即可得出結(jié)合反應(yīng)過程的吉布斯自由能變?chǔ),結(jié)果匯總于表3。通過表中結(jié)果可以看出,不同溫度下吉布斯自由能變?chǔ)均小于零,說明BSA與櫟癭酸的相互作用是自發(fā)進(jìn)行的;ΔH<0和ΔS<0時(shí),說明BSA與櫟癭酸之間相互作用力主要為氫鍵和范德華力,且整個(gè)過程是焓驅(qū)動(dòng)占主導(dǎo)的。另外,ΔH<0說明二者的相互作用是一個(gè)放熱的過程。

    表3 BSA與櫟癭酸結(jié)合過程的熱力學(xué)參數(shù)

    3.5 BSA與櫟癭酸相互作用的能量轉(zhuǎn)移機(jī)制以及結(jié)合距離 Foster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論認(rèn)為[13-14],當(dāng)供能體可發(fā)射熒光,且與受能體的結(jié)合距離小于等于7 nm,同時(shí)供能體熒光發(fā)射光譜與受能體吸收光譜有重疊時(shí),能量可以非輻射能量轉(zhuǎn)移形式從供能體激發(fā)態(tài)轉(zhuǎn)移到能量受體。且非輻射能量轉(zhuǎn)移效率E、供能體與受能體之間的距離r及能量轉(zhuǎn)移效率為50%的臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0之間存在以下關(guān)系[15]:

    (4)

    式中,K2為偶極空間取向因子2/3;N為介質(zhì)折射指數(shù)1.336;φ為熒光供體的熒光量子產(chǎn)率0.118;J為熒光供體的熒光發(fā)射光譜與熒光受體的吸收光譜重疊積分,可由以下關(guān)系式獲得:

    J=∑[(λ)ε(λ)λ4Δλ]/∑F(λ)Δλ,A=lg(1/D)=εbc

    (5)

    式(5)中F(λ)是熒光供體在波長(zhǎng)λ處的熒光發(fā)射強(qiáng)度;ε(λ)是熒光受體在波長(zhǎng)λ處的紫外摩爾吸光系數(shù);A為熒光供體的紫外吸光度;D為其透射比;ε為紫外摩爾吸光系數(shù);c為吸光物質(zhì)的濃度;b為吸光介質(zhì)的厚度。

    圖4所示為BSA與櫟癭酸的光譜圖,由圖中可以看到,BSA的熒光發(fā)射光譜與櫟癭酸的紫外吸收譜有明顯重疊部分。利用光譜數(shù)據(jù),通過式(4)、(5)計(jì)算即可得到BSA與櫟癭酸結(jié)合過程中的相關(guān)參數(shù),結(jié)果匯總于表4。從表中可以看出BSA與櫟癭酸之間作用的平均距離為4.134 nm,同時(shí)說明二者之間確實(shí)發(fā)生了非輻射能量轉(zhuǎn)移。

    圖4 BSA熒光發(fā)射光譜與櫟癭酸吸收光譜

    表4 BSA與櫟癭酸的結(jié)合距離信息

    3.6 結(jié)合位置取代實(shí)驗(yàn) BSA分子上有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(Site Ⅰ和Site Ⅱ),而華法林和布洛芬分別是這兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的特異性標(biāo)志物[16-17]。因此,通過選用華法林和布洛芬作為不同結(jié)合位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)劑,可獲得櫟癭酸的結(jié)合位點(diǎn)的相關(guān)信息。當(dāng)不存在、以及及分別存在競(jìng)爭(zhēng)劑華法林、布洛芬的情況下,櫟癭酸與BSA結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的變化情況匯總于表5。由表5可知,在Site Ⅱ位點(diǎn)被布洛芬所占據(jù)時(shí),櫟癭酸的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n以及結(jié)合常數(shù)Ka只有微弱的減少,說明藥物與標(biāo)志物之間不存在明顯的直接競(jìng)爭(zhēng)作用;而在Site Ⅰ位點(diǎn)被標(biāo)志物布洛芬占據(jù)后,櫟癭酸的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)Ka以及結(jié)合常數(shù)n均明顯降低,表明櫟癭酸與華法林之間發(fā)生直接競(jìng)爭(zhēng)作用,即櫟癭酸與BSA作用的結(jié)合位點(diǎn)為Site Ⅰ位點(diǎn)。

    表5 不同競(jìng)爭(zhēng)劑存在下BSA與櫟癭酸的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及結(jié)合常數(shù)

    3.7 BSA與櫟癭酸識(shí)別過程的構(gòu)象變化-同步熒光光譜光譜分析

    圖5展示了BSA在與櫟癭酸結(jié)合過程中當(dāng)Δλ=60nm和Δλ=15nm的同步熒光光譜。從圖中可以看出,伴隨著加入的櫟癭酸濃度的增加,BSA在Δλ=60nm和Δλ=15nm時(shí)的同步熒光強(qiáng)度均發(fā)生了明顯改變,說明BSA分子中的酪氨酸、色氨酸殘基均參與了熒光猝滅過程,其中對(duì)色氨酸的猝滅效果更為明顯。同時(shí)我們注意到,伴隨著櫟癭酸濃度的增加,Δλ=15 nm時(shí)的同步熒光光譜的最大發(fā)射峰位并未發(fā)生明顯的改變,而當(dāng)Δλ=60 nm的同步熒光光譜則顯示出輕微藍(lán)移現(xiàn)象,說明在BSA與櫟癭酸的結(jié)合過程中,蛋白中酪氨酸殘基所處的微環(huán)境微環(huán)境沒有明顯的改變,而色氨酸殘基所處的微環(huán)境微環(huán)境疏水性略微增強(qiáng)。

    圖5 BSA與櫟癭酸相互作用的同步熒光發(fā)射光譜.A: Δλ=60nm,B: Δλ=15nmC (Roburic acid,a-g):0×10-6、5×10-6、10×10-6、15×10-6、20×10-6、25×10-6、35 ×10-6 mol/L.

    3.8 BSA與櫟癭酸識(shí)別過程的構(gòu)象變化—紅邊激發(fā)位移(REES)分析 紅邊激發(fā)位移是指當(dāng)溶劑介質(zhì)存在緩慢舒張作用時(shí),色氨酸中吲哚環(huán)與臨近偶極子的電子結(jié)合作用即可引起色氨酸電子躍遷能分配的一種現(xiàn)象,是一種監(jiān)測(cè)熒光發(fā)色基團(tuán)微環(huán)境改變的方法。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)受到激發(fā)光照射時(shí),若蛋白質(zhì)中色氨酸殘基所處微環(huán)境是流動(dòng)的,則其在發(fā)射熒光之前就已經(jīng)出現(xiàn)了緩慢舒張作用,此時(shí)色氨酸殘基產(chǎn)生的熒光光譜的發(fā)射波長(zhǎng)不發(fā)生變化。如果色氨酸殘基處在受限環(huán)境當(dāng)中,色氨酸中處于激發(fā)態(tài)的吲哚環(huán)將會(huì)產(chǎn)生緩慢舒張作用,并且激發(fā)波長(zhǎng)不同,其發(fā)射波長(zhǎng)也不同[18-19]。

    在實(shí)驗(yàn)中可以發(fā)現(xiàn),在266 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下,BSA熒光發(fā)射光譜的最大發(fā)射波長(zhǎng)位于346 nm,所以選取326(FL)和366(FR)這兩個(gè)等波長(zhǎng)點(diǎn)進(jìn)行雙波長(zhǎng)處理。由圖6可見,在相同激發(fā)波長(zhǎng)下,BSA的FL/FR值伴隨著櫟癭酸濃度的增大而上升,說明伴隨著BSA與櫟癭酸反應(yīng)的進(jìn)行,熒光發(fā)射光譜發(fā)生藍(lán)移[18],這也從另一方面驗(yàn)證“3.1”中得到的結(jié)果,即說明BSA結(jié)構(gòu)的疏水性伴隨著反應(yīng)的進(jìn)行而有所增加。

    圖6 櫟癭酸對(duì)BSA紅邊激發(fā)熒光位移的影響,C(櫟癭酸a→e):0×10-6、5×10-6、15×10-6、20×10-6、25×10-6 mol/L

    當(dāng)櫟癭酸濃度分別為0×10-6、5×10-6、15×10-6mol/L時(shí),隨著激發(fā)波長(zhǎng)的逐漸增大,BSA的FL/FR值緩慢降低,產(chǎn)生了Rees現(xiàn)象,說明在上述情況下,BSA中色氨酸殘基的運(yùn)動(dòng)受到限制。然而,隨著體系中櫟癭酸濃度的擴(kuò)大,當(dāng)櫟癭酸濃度分別為20×10-6、25×10-6mol/L時(shí),BSA的FL/FR值不再隨著激發(fā)波長(zhǎng)的增大而明顯降低,即不再產(chǎn)生Rees現(xiàn)象,說明伴隨著櫟癭酸濃度的升高,由于BSA構(gòu)象的改變,分子中色氨酸殘基處于了相對(duì)流動(dòng)的微環(huán)境當(dāng)中。

    4 結(jié)論

    本研究設(shè)計(jì)一種全面表征傳統(tǒng)藏藥中有效成分與功能蛋白相互作用與識(shí)別過程的實(shí)驗(yàn)方法。本研究以藏藥秦艽中有效成分櫟癭酸以及運(yùn)載蛋白為例,在不同溫度下利用本方法進(jìn)行了實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示:櫟癭酸與BSA二者之間發(fā)生的結(jié)合作用引起了BSA內(nèi)源熒光猝滅,造成的猝滅現(xiàn)象為形成了不發(fā)熒光絡(luò)合物的靜態(tài)猝滅過程。通過測(cè)量可獲得二者在不同溫度下結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)以及結(jié)合過程中相關(guān)熱力學(xué)參數(shù),并得知二者相互結(jié)合是以氫鍵和范德華力為主要作用力的自發(fā)、放熱反應(yīng)過程。同時(shí),二者結(jié)合過程中發(fā)生了非輻射能量轉(zhuǎn)移,且櫟癭酸結(jié)合于BSA分子中的Site Ⅱ位點(diǎn),平均結(jié)合距離為4.134 nm。另外,在二者識(shí)別過程中,BSA結(jié)構(gòu)的疏水性有輕微的增加,而且伴隨著櫟癭酸濃度的增加,BSA中色氨酸所處微環(huán)境疏水性有了輕微增加,微環(huán)境流動(dòng)性逐步增強(qiáng)。

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