單因素試驗結(jié)合Box-Behnken設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化舒肝顆粒(廣西方)的醇提工藝

梁 芳 黃艷紅 龔志強 蒙田秀 呂 瀟 陳思宏 譚德慧

廣西中醫(yī)藥大學賽恩斯新醫(yī)藥學院，廣西 南寧 530222

舒肝顆粒(廣西方)由夏枯草、茵陳、虎杖等9味藥材加工而成，具有疏肝開郁、清熱解毒、化濕健脾之功效，是治療黃疸型及非黃疸型急性肝炎的良方。方中夏枯草為君藥，虎杖為臣藥，均有保肝作用。臨床研究表明，夏枯草所含的迷迭香酸通過減輕肝臟炎癥反應(yīng)，改善肝纖維化，緩解急性肝損傷來保護肝功能[1-2]；虎杖中的虎杖苷具有保護肝臟、抗炎、抗肝癌、降低脂肪肝的作用，大黃素能有效改善肝功能，降低血脂，減輕肝臟炎癥[3-4]。本研究采用Box-Behnken設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化舒肝顆粒(廣西方)的醇提工藝，為后續(xù)舒肝顆粒(廣西方)的工藝研究提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent1200(配置DAD/ELSD檢測器)高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；Agilent1200色譜工作站(美國安捷倫科技有限公司)；AE240十萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；JJ1000型電子天平(常熟市雙杰測試儀器廠)；HH-S6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 (金壇市醫(yī)療儀器廠)。

1.2 對照品與試劑 對照品均購于中國食品藥品檢定研究院，虎杖苷對照品(批號：111575-201603，純度87.3%)、迷迭香酸對照品(批號：111871-201706，純度90.5%)、大黃素對照品(批號：110756-201512，純度98.7%)；甲醇和乙腈(色譜純)購自美國Thermo Fisher公司，液相用水為娃哈哈純凈水。

1.3 藥材 夏枯草(批號：18102001)、虎杖(批號：18051501)、茵陳(批號：18022701)、北柴胡(批號：18102202)、蒲公英(批號：18082202)、蒼術(shù)(批號：18092504)、甘草(批號：18102801)均為廣西仙茱中藥飲片廠生產(chǎn)。馬蘭草、白茅根購自廣西玉林藥市，由廣西中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室田慧教授鑒定，馬蘭草為菊科植物馬蘭頭(KalimerisindicaL.)的干燥全草，白茅根為禾本科植物白茅(ImperatacylindricalBeauv.var.major(Nees)C.E.Hubb.)的干燥根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 有效成分的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：CAPCELL PAK C18(250 mm×4.6 mm，5μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫：0～12 min，20%A、12～20 min，20%→30%A、20～25 min，30%→70%A、25～35 min，70%→80%A、35～40 min，80%→90%A；流速：1.0 mL/min；檢測波長：306 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。取混合對照品溶液和供試品溶液進樣分析，結(jié)果表明混合對照品溶液和供試品溶液在HPLC色譜圖中相應(yīng)色譜峰的保留時間一致，各相鄰峰間分離度均大于1.5，理論板數(shù)按迷迭香酸峰計不低于6000。HPLC色譜圖如圖1所示。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.2 供試品溶液的制備 按處方量的1/20稱取藥材8.75 g，置250 mL圓底燒瓶中，加入12倍量60%乙醇，稱定重量，提取2次，每次回流提取80 min，放冷，用60%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液2 mL,置10 mL容量瓶中，加60%乙醇定容至刻度，搖勻，過微孔濾膜，即得。

2.1.3 混合對照品溶液的制備 精密稱定迷迭香酸對照品8.58 mg、虎杖苷對照品5.89 mg、大黃素對照品5.29 mg，置50 mL量瓶中，加60%乙醇適量，超聲使溶解，再加60%乙醇定容至刻度，搖勻，備用。

2.1.4 標準曲線的制備 取“2.1.3”項下的混合對照品溶液，精密量取0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，加60%乙醇定容至刻度，搖勻，過微孔濾膜，按“2.1.1”色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以對照品濃度作為x軸，峰面積作為Y軸進行回歸分析，得到虎杖苷、迷迭香酸、大黃素的回歸方程分別為：Y=31.193X-11.752，(r=0.9997)、Y=11.445X-4.6137(r=0.9998)、Y=7.0932X+10.846(r=0.9995)。結(jié)果表明虎杖苷在5.14～51.40 μg、迷迭香酸在7.76～77.60 μg、大黃素在5.22～52.20 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度考察 精密吸取“2.1.4”混合對照品溶液5#，按“2.1.1”色譜條件連續(xù)進樣6次，測定虎杖苷、迷迭香酸、大黃素的峰面積并計算RSD值，結(jié)果虎杖苷平均峰面積為1223.98，RSD=0.07%,迷迭香酸平均峰面積為691.97，RSD=0.05%，大黃素平均峰面積為481.15，RSD=0.17%，表明儀器的精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性考察 取“2.1.2”項下的同一供試品溶液，在同一色譜條件下分別于0、2、4、8、12、24 h進樣分析，計算虎杖苷、迷迭香酸、大黃素峰面積的RSD值，結(jié)果分別為0.43%、0.63%、1.45%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性考察 按“2.1.2”項下的方法制備6份供試品溶液，按“2.1.1”色譜條件進樣測定。測得虎杖苷平均含量為2.5585 mg/g,RSD=0.87%；迷迭香酸平均含量為1.8457 mg/g,RSD=0.86%；大黃素平均含量為1.8362 mg/g,RSD=1.74%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收考察 分別在已知含量的6份供試品溶液中加入一定量的虎杖苷、迷迭香酸、大黃素對照品，按“2.1.1”色譜條件進樣分析，計算平均回收率和RSD值，結(jié)果見表1，虎杖苷平均回收率為98.36%，RSD=1.52%；迷迭香酸平均回收率為99.15%，RSD=1.58%；大黃素平均回收率為99.81%，RSD=1.75%，表明該方法準確度良好。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇體積分數(shù)考察 按處方量的1/20稱取藥材6份，每份8.75 g，置250 mL圓底燒瓶中，固定提取次數(shù)1次，加熱回流提取60 min，分別精密加入40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇各100 mL, 按“2.1.2”項下的方法制備成供試品溶液，進樣分析，測定虎杖苷、迷迭香酸、大黃素的總含量，結(jié)果如圖2A所示。結(jié)果表明，50%、60%、70%乙醇提取的總含量高，故選擇乙醇體積分數(shù)為50%～70%進行Box-Behnken設(shè)計試驗。

2.2.2 提取溶劑加入量考察 按處方量的1/20稱取藥材8.75 g，共6份，置250 mL圓底燒瓶中，固定提取次數(shù)1次，加熱回流提取60 min，分別精密加入8倍、10倍、12倍、14倍、16倍、18倍的50%乙醇各100 mL，同上法制備成供試品溶液，進樣分析，測定虎杖苷、迷迭香酸、大黃素的總含量，結(jié)果如圖2B所示。結(jié)果表明，加入量在8～12倍時測得的總含量呈上升趨勢，在12倍量時達最高點，提取效果最好，在12～16倍時測得的總含量呈下降趨勢，16～18倍時總含量平穩(wěn)，故選擇10～14倍進行Box-Behnken設(shè)計試驗。

2.2.3 提取時間考察 按處方量的1/20稱取藥材6份，每份8.75 g，置250 mL圓底燒瓶中，固定加入12倍量50%乙醇，提取次數(shù)1次，分別加熱回流30、60、90、120、150、180 min， 同上法制備成供試品溶液，測定虎杖苷、迷迭香酸、大黃素的總含量，結(jié)果如圖2C所示。結(jié)果表明，加熱回流60 min時測得的總含量最高，提取時間為120～180 min時雖然提取率有所提高，但考慮到生產(chǎn)實際，為節(jié)省生產(chǎn)時間，選擇30～90 min進行Box-Behnken設(shè)計試驗。

2.2.4 提取次數(shù)考察 按1/20處方量稱取藥材8.75g，共3份，置250 mL圓底燒瓶中，固定加入12倍量50%乙醇，分別提取1、2、3次，每次 60 min，同上法制備成供試品溶液，測定虎杖苷、迷迭香酸、大黃素的總含量，結(jié)果如圖2D所示。結(jié)果表明提取2次時測得的總含量最高，提取效果最好。

圖2 單因素試驗考察結(jié)果

2.3 浸膏得率的測定 精密吸取各乙醇提取液 20 mL，照《中國藥典》2015年版四部醇溶性浸出物測定法(通則2201)測定，計算浸膏得率Rt (%)。

計算公式：Rt (%)=(M2-M1)/W×V/20×100%

2.4 Box-Behnken設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化醇提工藝

2.4.1 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果 在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，依據(jù)Box-Behnken中心試驗設(shè)計原理，設(shè)計三因素三水平17個實驗點的響應(yīng)面法分析模型，以乙醇的體積分數(shù)(A，%)、提取溶劑加入量(B，倍)、提取時間(C，min)為自變量，固定提取次數(shù)為2次，以總含量和浸膏得率的綜合評分(R)作為本次實驗的響應(yīng)值，因素與水平詳見表2，Box-Behnken設(shè)計與結(jié)果見表3。

表2 因素與水平

2.4.2 模型的建立及顯著性檢驗 通過Design-Expert 8.0.6軟件對表3的數(shù)據(jù)進行回歸分析，以乙醇體積分數(shù)(A)、提取溶劑加入量(B)、實驗提取的時間(C)三個因素對綜合評分進行響應(yīng)面分析，采用多元線性回歸以及二次多項式方程對各個數(shù)據(jù)進行擬合，得回歸方程為Y=-295.35850+6.80485A+3.77413B+0.038017C-3.30000×10-3AB+3.50000×10-3AC+6.24444×10-3BC-0.058405A2-0.019758B2-5.44500×10-3C2，方差分析結(jié)果見表4。

表3 Box-Behnken設(shè)計與結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

續(xù)表4 表4 方差分析結(jié)果

由表4可知，該模型P=0.0015<0.05，表明擬合模型具有顯著性差異。失擬項P=0.1197>0.05差異不顯著，表明該模型的回歸方程具有較好的擬合度和可信度，實驗誤差相對較小。模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9418，表明該模型可解釋3個因素94.18%的變異性，模型可用于醇提工藝中綜合評分的預(yù)測。該回歸模型的顯著性檢驗結(jié)果如表3所示，模型的一次項A、C顯著(P<0.05)，二次項A2、B2、C2對綜合評分的影響非常顯著(P<0.01)，BC對綜合評分的影響顯著(P<0.05)，其他項均不顯著。3個因素的主次順序為：乙醇體積分數(shù)>提取時間>提取溶劑加入量，交互項對總含量的影響力強弱順序為：BC>AC>AB。

2.4.3 響應(yīng)面分析 利用 Box-Behnken得出的回歸模型作出兩兩因素對綜合評分的交互作用響應(yīng)面曲線圖及等高線圖，從響應(yīng)面曲線圖可以直觀看出各因素的交互作用顯著程度以及變化趨勢，曲面的傾斜程度反映兩因素交互作用的顯著程度，等高線的密度反映該因素對綜合評分的影響強弱。由圖3可知，提取溶劑加入量和提取時間兩個因素的交互影響作用最強，故曲線陡峭，等高線呈橢圓形，對綜合評分影響顯著；乙醇體積分數(shù)和提取時間的交互影響較小，等高線接近圓形；而乙醇體積分數(shù)和提取溶劑加入量的交互影響最小，作用不顯著，等高線呈圓形。各因素對綜合評分的影響交互項強弱順序為：BC>AC>AB，與表3回歸系數(shù)的顯著性檢驗結(jié)果一致。

圖3 各因素對綜合評分影響的響應(yīng)面曲線圖和等高線圖

2.4.4 驗證試驗 采用Design-Expert8.0.6軟件預(yù)測最佳醇提工藝參數(shù)：乙醇體積分數(shù)57.78%，提取溶劑加入量11.84倍，提取時間81.43 min?？紤]到生產(chǎn)過程中實施工藝參數(shù)的可行性，將最佳醇提工藝條件調(diào)整如下：乙醇體積分數(shù)為60%，提取溶劑加入量為12倍，提取時間80 min。在此條件下平行進行3次驗證試驗，結(jié)果見表5，測得綜合評分99.54%(RSD=0.40%，n=3)，與模型預(yù)測值98.16%的相對平均偏差為0.40%，表明該醇提工藝條件穩(wěn)定、可靠，同時也說明建立的回歸模型合理。

表5 驗證試驗結(jié)果

3 討論

夏枯草的活性成分熊果酸也具有保肝功效，且含量比迷迭香酸高[5-7]。故原計劃將熊果酸作為含量測定指標之一，但熊果酸的紫外吸收波長在210 nm左右，且熊果酸和齊墩果酸系同分異構(gòu)體，化學結(jié)構(gòu)接近，只有一個甲基位置的差異，HPLC法較難把熊果酸峰和齊墩果酸峰分離[8]，只能選擇夏枯草另一種活性成分迷迭香峰作為含量測定指標。

本研究以君藥夏枯草的迷迭香酸[9]280和臣藥虎杖的虎杖苷和大黃素[9]208-209作為含量測定指標，在波長選擇時發(fā)現(xiàn)虎杖苷峰和迷迭香酸峰在254 nm波長測定時呈現(xiàn)倒峰，大黃素峰在330 nm波長測定時呈現(xiàn)倒峰，只有在306 nm波長測定時3個成分均呈現(xiàn)良好的峰形，且分離度佳，故選擇306 nm作為HPLC法的檢測波長。

響應(yīng)面法適宜于解決非線性數(shù)據(jù)處理的相關(guān)問題，它是以多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過回歸方程優(yōu)化工藝參數(shù)的綜合實驗設(shè)計方法，廣泛應(yīng)用于中藥材及復(fù)方制劑的提取工藝條件優(yōu)化。這種方法突破了正交設(shè)計和均勻設(shè)計等線性模型，并且在此基礎(chǔ)上進行了改進，精密度有了提高，而且可以自動識別自變量以及非自變量之間的規(guī)律[10]。本次提取工藝研究是在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，結(jié)果表明，最佳醇提工藝為加入60%乙醇12倍，加熱回流2次，每次80 min。經(jīng)驗證，本次實驗得到的實驗數(shù)值與預(yù)測數(shù)值的偏差為0.46%，表明該醇提工藝條件合理可行，可用于后續(xù)舒肝顆粒(廣西方)制劑生產(chǎn)的醇提工藝提取。