秦盾祛痛風(fēng)膠囊的黃嘌呤氧化酶抑制活性研究

鐘劍鋒 謝宇寶 蔡匯明 何家豪 楊詠祺 陳曉珺 崔明筠 朱欽昌 付開聰 賀震旦*

1.深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，廣東省天然小分子創(chuàng)新藥物工程技術(shù)研究中心，深圳市新型天然保健品研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518071；2.云南省普洱市民族傳統(tǒng)醫(yī)藥研究所，云南 普洱 665000

痛風(fēng)是常見多發(fā)的代謝性風(fēng)濕病，我國痛風(fēng)發(fā)病率約為1%～3%[1]，痛風(fēng)臨床表現(xiàn)為高尿酸血癥，常與多種疾病伴發(fā)，嚴(yán)重者易導(dǎo)致腎衰竭危及生命[2]。尿酸由黃嘌呤氧化酶催化黃嘌呤生成[3]，尿酸催化生成過程中還會(huì)產(chǎn)生大量超氧陰離子和過氧化氫等自由基，與細(xì)胞損傷、炎癥等密切相關(guān)[4]。因此，抑制黃嘌呤氧化酶的活性是痛風(fēng)藥物研究的一個(gè)重要靶點(diǎn)。臨床常見的黃嘌呤氧化酶抑制劑主要有別嘌呤醇和非布索坦，但都伴有嚴(yán)重的副作用[5-6]，尋找毒副作用小的中藥活性成分具有重要的意義和研究前景。

秦盾祛痛風(fēng)膠囊(原名尿酸消膠囊)是哈尼族民間中藥制劑，主要含有秦皮、盾翅藤、虎杖、腎茶等成分，主治尿酸過高引起的痛風(fēng)[7]。當(dāng)?shù)鼗颊呤褂茂熜э@著、副作用低，在臨床樣本觀察中，痛風(fēng)早期患者服用該藥物兩月后基本恢復(fù)正常，部分痛風(fēng)晚期典型病例服用一或兩個(gè)療程后，尿酸值由800顯著降低至500左右。但由于臨床觀察樣本少，且具體的降尿酸作用和機(jī)制尚未闡明，無法打破該藥的地方局限性。本研究以黃嘌呤氧化酶為靶點(diǎn)，利用紫外分光光度法[8]，對秦盾祛痛風(fēng)膠囊的水提和醇提物進(jìn)行黃嘌呤氧化酶抑制活性和體外細(xì)胞毒性研究，并進(jìn)行HPLC分析，初步探討其降尿酸的作用和機(jī)制，為該民族藥的開發(fā)和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)支撐和依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品和試劑 秦盾祛痛風(fēng)膠囊(TFCAP)購自普洱市民族醫(yī)院，批號(hào)：滇藥制字(Z)20140010J；黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶購自北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司；別嘌呤醇和尿酸購自北京華威銳科化工有限公司；標(biāo)準(zhǔn)品秦皮甲素、虎杖苷、熊果酸購自云南西力生物技術(shù)股份有限公司；cck8試劑盒購自深圳萊伯生物科技有限公司。

1.2 儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀V-100(瑞士BUCHI公司)；真空冷凍干燥機(jī)LGJ-12S(北京松源華興生物技術(shù)有限公司)；酶標(biāo)儀Synergy H1(美國BioTek公司)；高效液相色譜儀LC-2030C(日本Shimadzu公司)

1.3 細(xì)胞株 人大腸癌細(xì)胞(HCT116)、人宮頸癌細(xì)胞(Hela)、人肌肉橫紋肌瘤細(xì)胞(RD)、和非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)主要來源于實(shí)驗(yàn)室課題組培養(yǎng)分離所得；人近端腎小管上皮細(xì)胞(HKC)購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

2 方法

2.1 提取物制備 將TFCAP去膠囊化，各取TFCAP粉末30 g置于兩個(gè)1 L圓底燒瓶，加入300 mL99.5%乙醇或300 mL蒸餾水進(jìn)行回流提取2 h，回收乙醇和水提取液，離心取上清液，使用濾紙濾過，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(45 ℃，100 mbar，60 rpm)進(jìn)行減壓蒸餾，濃縮除去乙醇和水，放置-80 ℃冷凍冰箱過夜后用真空冷凍干燥機(jī)干燥，得秦盾祛痛風(fēng)膠囊乙醇提取物粉末(TFCAP.E)和水提取物粉末(TFCAP.W)。

2.2 溶液配制

2.2.1 磷酸鹽緩沖液(PBS)配制[9]精密稱取Na2HPO4·12H2O(分析純)38.81 g和KH2PO4(分析純)2.72 g，加入蒸餾水配制成500 mL濃度為0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液，使用pH計(jì)將溶液pH值調(diào)至7.5。

2.2.2 黃嘌呤氧化酶(XO)溶液配制 精密稱取黃嘌呤氧化酶(9.8 U/mg)1.96 U，為 2mg，加入PBS(pH=7.5)稀釋至1.96 mL，即得 10U/mL的黃嘌呤氧化酶母液，將母液分裝至4管EP管中，放置-20 ℃冰箱保存。用時(shí)取一管，吸取0.1 mL黃嘌呤氧化酶液，加入PBS稀釋至5 mL，得0.2 U/mL的黃嘌呤氧化酶液。

2.2.3 黃嘌呤溶液配制 精密稱取氫氧化鈉0.006 g，加入0.8 mL蒸餾水溶解，得到氫氧化鈉溶液，再加入精密稱取的黃嘌呤0.0057 g，即為黃嘌呤氫氧化鈉溶解液(a液)。精密稱取磷酸二氫鉀0.027 g，用1 mL蒸餾水溶解，獲得磷酸二氫鉀液(b液)。將a液、b液混合后，加蒸餾水稀釋至4 mL，再用PBS(pH=7.5)稀釋至10 mL，得到3.75 mmol/L的黃嘌呤母液，然后放置4 ℃冰箱保存。使用時(shí)精密量取1 mL，加入PBS液(pH=7.5)稀釋至3.75 mL，即得到1 mmol/L的黃嘌呤液。

2.2.4 別嘌呤醇溶液配制 精密稱量2 mg別嘌呤醇，用PBS(pH=7.5)100 mL溶解，配制成濃度為20 μg/mL的別嘌呤醇母液備用，放置4 ℃冰箱保存。

2.2.5 TFCAP醇提物溶液配制 精密稱取TFCAP醇提物10 mg，加入5 mL PBS(pH=7.5)溶解，得2 mg/mL的樣品溶液，使用時(shí)梯度稀釋。

2.2.6 TFCAP水提物溶液配制 精密稱取TFCAP水提物10 mg，加入5 mL PBS(pH=7.5)溶解，得2 mg/mL的樣品溶液，使用時(shí)梯度稀釋。

2.2.7 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制 分別稱取2 mg虎杖苷、熊果酸和秦皮甲素，各加入1 mL DMSO溶液溶解，得濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品母液，使用時(shí)梯度稀釋。

2.3 黃嘌呤氧化酶抑制活性檢測 將PBS、黃嘌呤液、別嘌呤醇液、不同濃度的TFCAP醇提物溶液或水提物溶液或標(biāo)準(zhǔn)品、黃嘌呤氧化酶液依次加入96孔板中，每組設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，使用酶標(biāo)儀在292 nm[10]下連續(xù)檢測10 min，每分鐘讀數(shù)一次，測定吸收度A與時(shí)間的變化，作線性回歸處理，以(dA/dt)作為酶反應(yīng)速率，計(jì)算樣品對黃嘌呤氧化酶的半數(shù)抑制濃度IC50。

2.4 TFCAP醇提物細(xì)胞毒性檢測 使用cck8試劑盒對人大腸癌細(xì)胞(HCT116)、人宮頸癌細(xì)胞(Hela)、人肌肉橫紋肌瘤細(xì)胞(RD)、人近端腎小管上皮細(xì)胞(HKC)、非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)五類細(xì)胞進(jìn)行體外細(xì)胞毒性檢測，以藥物濃度作為橫坐標(biāo)，細(xì)胞抑制率作為縱坐標(biāo)進(jìn)行分析，并計(jì)算TFCAP醇提物對各細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度CC50。

2.5 TFCAP高效液相色譜分析

2.5.1 流動(dòng)相配置 甲醇使用 0.45 μm的一次性水系濾膜過濾，流動(dòng)相使用前進(jìn)行10～30 min超聲脫氣。

2.5.2 對照品溶液制備 精密稱取虎杖苷2 mg,置于10 mL量瓶中,加甲醇定容搖勻,配成 0.2 mg/mL 對照品溶液，超聲處理40 min，使用0.45 μm微孔濾膜過濾，得對照品溶液。

2.5.3 供試品溶液制備 精密稱取1mg TFCAP乙醇提取物，加入1 mL甲醇溶解，配成1 mg/mL供試品溶液，超聲處理40 min，使用0.45 μm微孔濾膜過濾，得供試品溶液。

2.5.4 色譜條件 色譜柱：Hypersil BOS C18(250 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相：A水，B甲醇；流速： 0.4 mL/min；分析時(shí)間：75 min；進(jìn)樣體積：20 μL；柱溫：30 ℃；梯度條件：0～15 min，B:5%～10%；15～45 min，B:10%～60%；45～55 min，B:60%～85%，55～65 min，B:85%～100%；65～75 min，B:100%；檢測波長：254 nm。

3 結(jié)果與分析

3.1 黃嘌呤氧化酶活性評(píng)價(jià)模型的建立和應(yīng)用

3.1.1 模型建立和驗(yàn)證 反應(yīng)體系中酶和底物的完全反應(yīng)濃度比值未知，因此需要對酶和底物的濃度進(jìn)行探索。固定酶的濃度(0.04 U/mol)，測定酶在不同濃度的底物條件下的反應(yīng)速率，選定合適的底物濃度，然后使用典型的黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌呤醇作為陽性藥物加入至模型中檢測酶活性評(píng)價(jià)是否真實(shí)有效。如圖1(A)所示，底物濃度在50～200 μg/mL范圍時(shí)，酶的反應(yīng)速率與底物濃度呈明顯的劑量依賴，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而底物濃度大于200 μg/mL后，酶反應(yīng)速率的提升趨于緩慢，說明底物趨于飽和，沒有發(fā)揮酶的最大效率，因此選擇200 μg/mL作為后續(xù)活性評(píng)價(jià)模型中的黃嘌呤底物濃度。圖1(B)結(jié)果顯示，酶的反應(yīng)速率代表酶的活性，隨別嘌呤醇濃度的增加活性顯著降低(P<0.05)，抑制曲線明顯，證明評(píng)價(jià)模型有效。

圖1 黃嘌呤濃度和別嘌呤醇濃度對酶反應(yīng)速率的影響

3.1.2 樣品檢測結(jié)果 用前述建立的黃嘌呤活性評(píng)價(jià)模型對TFCAP醇提物、TFCAP水提物、主要成分標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行活性檢測，結(jié)果如圖2所示，在TFCAP醇提物0、31.25 μg/mL、62.5 μg/mL、125 μg/mL、250 μg/mL、500 μg/mL6個(gè)濃度下，濃度大于 125 μg/mL 時(shí)，隨著濃度的增加，酶的反應(yīng)速率逐漸降低(P<0.05)，表現(xiàn)出對酶的抑制活性，有較好的量效關(guān)系，計(jì)算TFCAP醇提物對黃嘌呤氧化酶的半數(shù)抑制濃度IC50為(338.3±50.9)μg/mL。TFCAP水提物500 μg/mL濃度內(nèi)與不加藥對比未表現(xiàn)降尿酸作用(P<0.05)，因此采用醇提物進(jìn)行后續(xù)分析。同時(shí)對三種主要成分標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行活性檢測，結(jié)果表明，只有虎杖苷表現(xiàn)出黃嘌呤氧化酶抑制活性(P<0.05)，測定IC50為(5.8±0.3)μg/mL，因此推斷TFCAP醇提物中起酶抑制作用的主要活性成分可能為虎杖苷。

圖2 TFCAP.E、TFCAP.W和標(biāo)準(zhǔn)品濃度對酶活性的影響

3.2 體外細(xì)胞毒性檢測 體外條件下，使用抑制活性較高的TFCAP醇提物對HCT116、Hela、RD、Vero、HKC細(xì)胞進(jìn)行24 h梯度濃度藥物處理后使用cck-8試劑盒進(jìn)行毒性檢測，結(jié)果如圖4所示。TFCAP醇提物對五種細(xì)胞用0.5 mg/mL以下濃度處理時(shí)毒性沒有明顯差異(P>0.05)，在1～2 mg/mL 濃度范圍時(shí)毒性明顯增加，有顯著性差異(P<0.05)對細(xì)胞的殺傷作用與醇提物的濃度呈正相關(guān)。對HCT116、Hela、RD、Vero和HKC細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度和治療指數(shù)TI值見表1，計(jì)算結(jié)果表明TFCAP醇提物具有較好的安全性。

表1 TFCAP醇提物對各細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度CC50

3.3 TFCAP醇提物和虎杖苷對照品HPLC指紋圖譜 前文提及TFCAP醇提物中起酶抑制作用的主要活性成分可能為虎杖苷，故進(jìn)一步對TFCAP醇提物和虎杖苷標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行HPLC分析，建立TFCAP醇提物的HOLC指紋圖譜，色譜圖結(jié)果如圖4所示，相同色譜條件下，TFCAP醇提物和虎杖苷均在保留時(shí)間t=43.2 min，254 nm處有吸收峰，進(jìn)一步驗(yàn)證TFCAP醇提物中含有虎杖苷起抑制黃嘌呤氧化酶的作用，同時(shí)也為TFCAP的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

圖3 TFCAP醇提物對各細(xì)胞毒性作用

圖4 TFCAP醇提物和虎杖苷對照品HPLC分析色譜圖

4 討論

痛風(fēng)是常見多發(fā)的代謝性疾病，現(xiàn)有的西藥種類少，臨床使用副作用大，患者依從性差，而新藥的研發(fā)成本高、耗時(shí)長、風(fēng)險(xiǎn)大，相比之下中藥具有安全性高、來源廣、國內(nèi)患者易接受等優(yōu)勢。大量研究也證明很多中草藥含有的黃酮、皂苷、生物堿等活性成分有顯著的降尿酸作用[11]，常用中藥黃柏、金銀花、葛根、菊花、黃芪、土茯苓、車前子、虎杖、高良姜、吳茱萸、紅花、丹參、姜黃、木瓜、七葉蓮、甘草、大黃等某些提取成分能起到抑制黃嘌呤氧化酶活性的作用[12]。許多傳統(tǒng)民族藥方和地方中成藥具有良好的降尿酸療效而未被挖掘出來，因此尋找確有療效的中藥成分或民族藥方在痛風(fēng)治療上極具潛力和研究前景。

尿酸生成增多和排泄減少是尿酸含量增加的主要途徑。導(dǎo)致尿酸排泄減少的具體發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚，與多基因遺傳病相關(guān)，腎臟內(nèi)介導(dǎo)尿酸重吸收和分泌的尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是促尿酸排泄藥物的主要研究靶點(diǎn)，其中尿酸鹽陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(URAT1)是研究的熱門，萆薢總皂苷可以通過抑制高尿酸血癥大鼠腎臟URAT1表達(dá)而減少尿酸重吸收[13]。秦盾祛痛風(fēng)膠囊是否也存在URAT1抑制活性還需未來通過動(dòng)物模型進(jìn)行研究。

秦盾祛痛風(fēng)膠囊主要含有秦皮、盾翅藤、虎杖、腎茶等成分。侯建平等[14]研究證明虎杖提取物在大鼠高尿酸血癥模型中有降尿酸作用，能抑制黃嘌呤氧化酶活性。吳杲等[15]研究表示虎杖苷可抑制URAT1的mRNA表達(dá)，增加尿酸分泌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OAT1、OAT3的mRNA表達(dá)，增強(qiáng)腎臟對尿酸的排泄作用。

中藥提取一般采取乙醇或純水提取，本研究中秦盾祛痛風(fēng)膠囊水提物在500 μg/mL的高濃度下和未加藥組對比依舊未表現(xiàn)降低尿酸的作用，而是在低濃度促進(jìn)，高濃度再緩慢抑制尿酸生成，具體機(jī)制還待后續(xù)探討，因此本實(shí)驗(yàn)主要研究了醇提物的活性機(jī)制。此外黃嘌呤氧化酶活性檢測有紫外分光光度法、NBT/MTS-PMS比色法、電化學(xué)法、放射化學(xué)法和色譜法等[18]，本研究采用紫外分光光度法檢測292 nm下生成尿酸的吸光度值來建立黃嘌呤氧化酶活性評(píng)價(jià)模型，有報(bào)道稱許多天然藥物中含有在292 nm下有吸收的化合物[16]，采用終點(diǎn)法檢測會(huì)影響尿酸的吸光度，因此本實(shí)驗(yàn)使用連續(xù)動(dòng)力學(xué)測定，每分鐘檢測一次連續(xù)檢測10 min來消除藥物中原有的292 nm吸光度值影響。

秦盾祛痛風(fēng)膠囊醇提物在體外檢測中表現(xiàn)了較好的黃嘌呤氧化酶抑制活性，IC50為(338.3±50.9)μg/mL，虎杖苷標(biāo)準(zhǔn)品IC50為(5.8±0.3)μg/mL，結(jié)合HPLC色譜分析，推斷其主要活性成分為虎杖苷，具體的成分含量還有待后續(xù)HPLC方法學(xué)考察。同時(shí)使用該藥對多種細(xì)胞進(jìn)行了體外細(xì)胞毒性檢測，CC50/IC50在4.5～6.5之間，說明具有較好的安全性。但是活性和毒性檢測均在體外進(jìn)行，對其詳細(xì)的療效和安全性研究還需進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或臨床觀察進(jìn)行驗(yàn)證。