缺氧預(yù)處理后BMSCs 來源外泌體對心肌缺血再灌注大鼠心肌損傷的影響及其機(jī)制

王玉梅，韓煒，李惠，張媛，郭艷丹，喬玲玲，許文平

中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院門診部，廣州510010

心肌缺血再灌注（I/R）可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡、心肌組織壞死甚至心臟驟停，從而影響心臟缺血性疾病的治療效果［1］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）具有多向分化潛能，可參與免疫調(diào)節(jié)、炎癥抑制、多種細(xì)胞生長因子的分泌和組織修復(fù)［2-3］。研究顯示，將BMSCs 移植到缺血心臟后，BMSCs 可以分化為內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞，甚至心肌樣細(xì)胞［4］。因此，BMSCs 在心臟組織修復(fù)和再生過程中具有良好的應(yīng)用前景。但是，BMSCs 移植治療缺血性心臟病存在移植細(xì)胞在缺血區(qū)存活率低和栓塞的問題［5］。外泌體是攜帶DNA、RNA 和蛋白質(zhì)的小膜泡，作為細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要途徑之一，其在細(xì)胞間交流和相互作用中具有重要作用。最新研究證實(shí)，BMSCs能夠分泌豐富的外泌體［6］。隨著對BMSCs在組織再生中作用的深入了解，越來越多的研究表明BMSCs的這種作用可能與其釋放的外泌體有關(guān)［7］。因此，BMSCs 來源外泌體可能成為治療缺血性心臟病的一種新的替代方法。干細(xì)胞低氧預(yù)處理能有效提高BMSCs 移植后的存活率，增強(qiáng)其對損傷組織的保護(hù)作用，因此低氧預(yù)處理可增強(qiáng)干細(xì)胞的生物學(xué)作用［8］。2020 年1—10 月，本研究觀察了缺氧預(yù)處理后的BMSC 來源外泌體對心肌I/R 大鼠氧化應(yīng)激和心肌損傷的影響，探討缺氧預(yù)處理對外泌體修復(fù)心臟組織功能的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：清潔級雄性SD 大鼠51 只，體質(zhì)量200 g 左右，8 周齡，購自南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院醫(yī)療保障中心實(shí)驗(yàn)動物室。主要試劑：LG-DMEM 完全培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco 公司，Exo Quick TC外泌體提取試劑盒購自美國SBI 公司；TIANscript RT Kit 購自天根生化科技（北京）有限公司，Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits（SYBR Green I）購自意大利BBI 公司，兔抗大鼠缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）一抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；1% TTC染色液購自南京建城生物工程研究所，大鼠超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，大鼠免疫組化總抗氧化力（T-AOC）檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物研究所。主要儀器：C21三氣細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國BioSpherix 公司，Prism?7300 型PCR 儀購自美國ABI 公司，Multi-ImageTM凝膠成相系統(tǒng)購自美國Alpha Innotech公司，IX-70型倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 BMSCs分離及缺氧預(yù)處理

1.2.1 BMSCs 分離、培養(yǎng) 選取雄性SD 大鼠1 只，采用3% 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，頸部脫臼處死后75% 乙醇浸泡10 min。無菌條件下截取大鼠股骨和脛骨的骨骺末端，PBS 反復(fù)沖洗骨骺末端骨髓腔，收集沖洗后的PBS。移液器反復(fù)吹打，篩網(wǎng)過濾，制成單細(xì)胞懸液，1 500 r/min 離心10 min，棄上清液。將細(xì)胞密度調(diào)整為（1～3）×106/mL，接種至含LG-DMEM 完全培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2、20% O2、95% 飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后棄去培養(yǎng)液，去除非貼壁細(xì)胞，加入等量LG-DMEM 完全培養(yǎng)液培養(yǎng)純化細(xì)胞，每3 d 更換1 次LG-DMEM 培養(yǎng)液。待細(xì)胞生長融合至80% 左右時，加入0.25% 胰蛋白酶，以1∶3 的比例進(jìn)行傳代。取第3代生長狀況良好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 BMSCs 鑒定 ①收集第3 代生長狀況良好且融合達(dá)80% 的BMSCs，采用0.25% 胰蛋白酶消化，制成細(xì)胞密度為1×106/mL 的單細(xì)胞懸液，分別加入熒光直標(biāo)的CD29、CD34、CD44、CD105 單克隆抗體；混和均勻后，冰上避光孵育30 min，PBS 洗3次，并為每組樣品設(shè)立單獨(dú)的陰性對照；采用流式細(xì)胞儀檢測抗體表達(dá)情況，結(jié)果顯示細(xì)胞表面抗原CD34 表達(dá)陰性，CD29、CD44、CD105 表達(dá)陽性。②取BMSCs 單細(xì)胞懸液，鏡下觀察分離培養(yǎng)的大鼠BMSCs 呈纖維形態(tài)或者不規(guī)則的梭形貼壁生長。③收集第3 代生長狀況良好且融合達(dá)80% 的BMSCs，棄去原培養(yǎng)基，分別添加成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，每3 d 換液1次，分化12 d；結(jié)果顯示，細(xì)胞成脂誘導(dǎo)后經(jīng)油紅O染色顯示含有紅色脂肪顆粒，細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后經(jīng)茜素紅染色顯示含有紅色的礦化結(jié)節(jié)。

1.3 BMSCs 缺氧與常氧預(yù)處理及其外泌體提取、鑒定

1.3.1 BMSCs 缺氧與常氧預(yù)處理 取第3 代生長狀況良好的BMSCs，待細(xì)胞生長融合至80% 左右時，分為兩部分；一部分進(jìn)行缺氧預(yù)處理，即更換無血清培養(yǎng)基，并置于C21 三氣細(xì)胞培養(yǎng)箱，37 ℃、5% CO2、1% O2、95%飽和濕度條件下培養(yǎng)48 h；另一部分進(jìn)行常氧預(yù)處理，即置于常氧培養(yǎng)箱中，37 ℃、5% CO2、20% O2、95%飽和濕度條件下培養(yǎng)48 h。

1.3.2 BMSCs 來源外泌體的提取、鑒定 取1.3.1中分別經(jīng)缺氧及常氧預(yù)處理48 h 的兩部分細(xì)胞，收集培養(yǎng)基上清液。 4 ℃條件下1 000 r/min 離心10 min、8 000 r/min 離心20 min，去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片形成的沉淀，將上清液置于新的EP 管中，每500 μL 上清液加入Exo Quiek TC 試劑50 μL；顛倒EP 管約20 次，置于4 ℃冰箱靜置約12 h。4 °C 條件下3 000 r/min 離心30 min，去除上清液，保留沉淀。使用移液槍取1×PBS 400 μL，反復(fù)均勻吹打離心沉淀物，將重懸液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL EP 管中。透射電子顯微鏡下觀察提取的外泌體形態(tài)，結(jié)果顯示其呈杯狀或圓形囊泡，直徑50～120 nm，見OSID 碼圖1。采用Western blotting 法檢測外泌體標(biāo)志物CD9、CD63 表達(dá)，結(jié)果顯示其高表達(dá)CD9、CD63。證實(shí)在BMSCs培養(yǎng)上清中成功分離出外泌體。

1.4 動物分組處理 取SD 大鼠50 只，稱重后采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、假手術(shù)組、I/R 組、缺氧干預(yù)組和常氧干預(yù)組，每組10只。I/R組、缺氧干預(yù)組和常氧干預(yù)組建立心肌I/R 大鼠模型：術(shù)前禁食12 h、禁水4 h，3% 戊巴比妥鈉30 mg/kg 腹腔注射麻醉，將麻醉后的大鼠取仰臥位固定，連接好心電監(jiān)護(hù)；常規(guī)手術(shù)區(qū)域備皮消毒，氣管插管后連接ALCV9A 動物呼吸機(jī)（參數(shù)設(shè)置為呼吸比2∶1、20～30 mL/kg、頻率70 次/min）；于三、四肋間打開胸腔充分暴露心臟，打開心包，充分暴露左冠狀動脈前降支；于左心耳根部下方肺動脈圓錐旁以6-0 無創(chuàng)縫合線結(jié)扎左冠狀動脈前降支以阻斷血流，待阻斷血流區(qū)域心肌顏色由紅轉(zhuǎn)白，且心電圖顯示ST段明顯抬高（≥0.15 mV），提示血管阻斷成功；結(jié)扎阻斷血管30 min 后解除阻斷，可見心肌顏色由白轉(zhuǎn)紅，ST段回落≥50%，提示完成缺血再灌注；逐層關(guān)閉胸腔，完全縫合前充分排空左側(cè)胸腔內(nèi)氣體，待大鼠蘇醒后拔出氣管插管。缺氧干預(yù)組和常氧干預(yù)組分別在血管結(jié)扎后給予缺氧、常氧預(yù)處理的BMSCs來源外泌體400 μg/g；假手術(shù)組開胸后僅打開心包而不結(jié)扎左冠狀動脈前降支，正常組常規(guī)飼養(yǎng)未接受任何干預(yù)。

1.5 心肌組織相關(guān)指標(biāo)觀察

1.5.1 心肌梗死面積比測定 采用氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法。各組大鼠干預(yù)1 周后經(jīng)尾靜脈注射伊文思藍(lán)（0.1 g/mL）1 mL，1 min后開胸取出心臟，-20 ℃保存20 min。沿縱軸在1.0～1.5 mm處切取4～5 個切片，每個切片用玻片壓片，1% TTC 避光染色30 min，10% 甲醛固定10 min，沖洗后采用Imageproplus6.0軟件測量梗死區(qū)（淺白色）和危險區(qū)（磚紅色）面積。梗死面積比（%）=梗死區(qū)面積/危險區(qū)面積×100%。

1.5.2 心肌組織病理觀察 取各組大鼠心肌組織，10% 多聚甲醛溶液固定24 h，經(jīng)梯度乙醇脫水、常規(guī)石蠟包埋、5 μm 厚度切片。HE 染色后顯微鏡下觀察心肌組織病理學(xué)改變情況。

1.5.3 心肌組織氧化應(yīng)激指標(biāo)表達(dá)檢測 采用ELISA 法。取各組大鼠心肌組織，冰生理鹽水反復(fù)漂洗后進(jìn)行組織勻漿，4 ℃條件下12 000 r/min 離心10 min，取上清。采用ELISA 法檢測上清液SOD、MDA、T-AOC表達(dá)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6 BMSCs 來源外泌體HIF-1α 表達(dá)檢測 取經(jīng)缺氧及常氧預(yù)處理48 h 的BMSCs，參照1.3.2 的方法提取外泌體。①采用實(shí)時熒光定量PCR 法。使用TRIzol試劑提取總RNA，cDNA第一鏈合成試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。HIF-1α 引物序列：上游引物5′-CTCCCATACAAGGCAGCAGAAAC-3′，下游引物5′-AGAAACGAAACCCCACAGACAAC-3′。 內(nèi) 參GAPDH 引 物 序 列：上 游 引 物5′-GGCCTTCCGTGTTCCTACC-3′，下 游 引 物5′-ACTCGACACCTGCCCTCA-3′。PCR 反應(yīng)體系20 μL：cDNA 1 μL，10 μmmol/L PCR上、下游引物各1 μL，SYBR?GREEN master mix 10 μL，Nucleasr-Free Water 7 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，40 個循環(huán)；58 ℃退火20s，72 ℃延伸30 s，4 ℃作用5 min。采用2-ΔΔC法計算HIF-1α mRNA 相對表達(dá)量。②采用Western blotting 法。 將缺氧與常氧預(yù)處理的BMSCs 來源外泌體進(jìn)行勻漿，使用RIPA 裂解緩沖液從樣本中提取總蛋白。采用BCA 法進(jìn)行蛋白定量檢測，取總蛋白40 μg 經(jīng)8% SDS-PAGE 檢測。電泳后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，室溫下用5% 脫脂奶粉封閉1 h；加入兔抗大鼠HIF-1α及內(nèi)參β-actin 一抗（稀釋比例均為1∶400），4 ℃孵育過夜；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶5 000），室溫下孵育1 h。ECL 法顯色，GIS 凝膠圖像分析系統(tǒng)照相，Image Studio 圖像分析軟件分析圖片，計算HIF-1α 蛋白相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，組間和組內(nèi)比較分別采用成組t檢驗(yàn)和配對t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌梗死面積比比較 正常組、假手術(shù)組、I/R 組、缺氧干預(yù)組、常氧干預(yù)組心肌梗死面積比分別為0、0.12% ± 0.01%、46.25% ± 5.74%、32.55% ± 3.69%、39.48% ± 4.47%；與正常組、假手術(shù)組比較，I/R 組、缺氧干預(yù)組、常氧干預(yù)組心肌梗死面積比均升高；與I/R 組比較，缺氧干預(yù)組、常氧干預(yù)組心肌梗死面積比均降低，且缺氧干預(yù)組降低更明顯（P均＜0.05）。

2.2 各組大鼠心肌組織病理結(jié)果比較 正常組和假手術(shù)組大鼠心肌纖維排列整齊，結(jié)構(gòu)清楚，細(xì)胞和間質(zhì)無明顯充血水腫及炎性細(xì)胞浸潤。I/R 組心肌纖維斷裂、排列紊亂，存在細(xì)胞間質(zhì)充血水腫及炎癥細(xì)胞浸潤。與I/R 組相比，缺氧干預(yù)組、常氧干預(yù)組大鼠心肌纖維斷裂、排列紊亂程度及細(xì)胞間質(zhì)充血水腫程度均有所減輕。見OSID碼圖2。

2.3 各組大鼠心肌組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)表達(dá)比較 與正常組、假手術(shù)組比較，I/R 組、缺氧干預(yù)組、常氧干預(yù)組心肌組織SOD、T-AOC表達(dá)均降低，MDA表達(dá)均升高；與I/R組比較，缺氧干預(yù)組、常氧干預(yù)組心肌組織SOD、T-AOC 表達(dá)均升高，MDA 表達(dá)均降低，且缺氧干預(yù)組變化更明顯（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠心肌組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)表達(dá)比較（xˉ± s）

2.4 缺氧與常氧預(yù)處理BMSCs 來源外泌體HIF-1α表達(dá)比較 缺氧預(yù)處理BMSCs 來源外泌體中HIF-1α mRNA 和蛋白相對表達(dá)量分別為6.84 ± 0.62、7.35 ± 0.86，均高于常氧預(yù)處理BMSCs 來源外泌體的4.27 ± 0.39、5.14 ± 4.76（P均＜0.05）。

3 討論

早期再灌注是抑制心肌缺血發(fā)生后進(jìn)一步組織損傷的惟一途徑。然而，缺血心肌組織恢復(fù)血流灌注時再灌注區(qū)會引起可逆和不可逆的組織損傷，稱為心肌I/R 損傷。嚴(yán)重的心肌I/R 損傷最終會導(dǎo)致心力衰竭，因此，減輕心肌I/R 損傷仍是目前治療心肌缺血性疾病的重點(diǎn)和難點(diǎn)。研究證實(shí)，BMSCs 對心肌I/R 具有保護(hù)作用，但是移植后的BMSCs 不僅存在存活率較低、遺傳不穩(wěn)定性、功能喪失、免疫抑制和惡性轉(zhuǎn)化等缺陷，且存在倫理學(xué)限制，因此嚴(yán)重影響了BMSCs 的治療效果和臨床應(yīng)用［9-10］。外泌體是細(xì)胞分泌的納米級囊泡，攜帶大量具有親本細(xì)胞特性的生物遺傳分子，并通過細(xì)胞間通訊轉(zhuǎn)移來影響受體細(xì)胞的功能。外泌體通過介導(dǎo)細(xì)胞間的通訊，參與調(diào)控包括免疫信號、血管生成、應(yīng)激反應(yīng)、衰老、增殖和細(xì)胞分化等多個生理病理過程。BMSCs 能分泌多種細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子，以促進(jìn)組織修復(fù)，而旁分泌是BMSCs發(fā)揮功能的主要機(jī)制［11］。BMSC 來源外泌體具有多種生物學(xué)功能，可以調(diào)節(jié)先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，抑制過度炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)。LIU 等［12］研究報道，靜脈注射間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）來源外泌體可以通過抑制TLR4/NF-κB 信號通路來減輕I/R 導(dǎo)致的急性肺損傷。YANG 等［13］誘導(dǎo)MSCs 分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞并提取其外泌體，經(jīng)尾靜脈注入后結(jié)果顯示能夠有效提高肝I/R 小鼠對缺血的耐受性，減少肝細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)自噬增強(qiáng)可能是外泌體保護(hù)肝臟免受I/R 損傷的相關(guān)機(jī)制。因此，BMSCs 來源外泌體可能是BMSCsC 移植治療的非細(xì)胞替代方案。

本研究從大鼠骨髓組織中分離培養(yǎng)BMSCs，并且采用Exo Quick TC 法從BMSCs培養(yǎng)基上清中分離外泌體，通過鏡下觀察形態(tài)特征以及Western blotting 法檢測特異性分子標(biāo)記，證實(shí)為BMSCs 來源外泌體。雖然既往有研究顯示，BMSCs 來源外泌體在改善器官組織I/R 方面具有良好效果［14］。但也有研究發(fā)現(xiàn)，在常氧（21% O2）條件下培養(yǎng)的MSCs 會導(dǎo)致細(xì)胞過早衰老和分化能力降低，但缺氧預(yù)處理可顯著提高M(jìn)SCs 在宿主環(huán)境中的生存能力和再生能力，從而增強(qiáng)其在各種疾病模型中的治療效果［15］。由于旁分泌是BMSCs 的主要作用機(jī)制，因此理論上缺氧預(yù)處理能夠?qū)е翨MSCs 來源外泌體成分發(fā)生變化，進(jìn)而影響其作用效能。ROTH 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，缺氧預(yù)處理BMSCs 的培養(yǎng)基能有效恢復(fù)大鼠視網(wǎng)膜缺血模型的視網(wǎng)膜功能，且其效果優(yōu)于常氧條件下的BMSCs 培養(yǎng)基。本研究結(jié)果顯示，采用缺氧和常氧預(yù)處理的BMSCs來源外泌體均能夠減輕I/R導(dǎo)致的大鼠心肌病理損傷、減小心肌梗死面積，且缺氧干預(yù)組減輕大鼠心肌I/R 損傷程度的作用優(yōu)于常氧干預(yù)組，說明缺氧預(yù)處理增強(qiáng)了BMSCs 來源外泌體對大鼠心肌I/R損傷的治療作用。

I/R 發(fā)生時缺血心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體產(chǎn)生的腺苷三磷酸（ATP）減少，導(dǎo)致Ca2+在線粒體內(nèi)積聚，破壞了線粒體基本功能，從而引起細(xì)胞呼吸鏈功能發(fā)生障礙；同時由于心肌細(xì)胞內(nèi)SOD 生成減少，使氧自由基生成積聚增多，最終導(dǎo)致ROS 不斷生成。高水平氧化應(yīng)激可通過氧化脂質(zhì)和改變DNA、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)來損傷細(xì)胞，抑制過度氧化應(yīng)激也是改善I/R 組織損傷的重要機(jī)制和途徑［17］。本研究結(jié)果顯示，缺氧干預(yù)組和常氧干預(yù)組均能升高I/R 大鼠心肌組織中SOD、T-AOC 表達(dá)，降低MDA 表達(dá)，且缺氧干預(yù)組變化更明顯；這提示缺氧預(yù)處理BMSCs 來源外泌體可更好地抑制I/R導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

HIF-1α 被認(rèn)為是在缺血事件期間調(diào)節(jié)組織細(xì)胞對缺氧反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄因子。在I/R 發(fā)生時，缺氧條件可誘導(dǎo)HIF-1α 活化，通過增加血管生成蛋白、抑制線粒體功能和將代謝從氧化途徑轉(zhuǎn)換為糖酵解途徑，進(jìn)而改善缺血區(qū)域組織的氧供應(yīng)［18］。研究證實(shí)，HIF-1α 對心肌I/R 損傷具有抑制作用［19］。本研究結(jié)果顯示，缺氧預(yù)處理BMSCs 來源外泌體HIF-1α mRNA 和蛋白表達(dá)均明顯高于常氧預(yù)處理BMSCs 來源外泌體；這提示缺氧預(yù)處理誘導(dǎo)BMSCs來源外泌體減輕I/R 導(dǎo)致心肌損傷的相關(guān)機(jī)制可能與其升高HIF-1α表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，BMSCs 來源外泌體可減輕I/R 大鼠的心肌損傷，且低氧預(yù)處理能增強(qiáng)其對心肌的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)BMSCs 來源外泌體HIF-1α表達(dá)上調(diào)、減輕心肌組織氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。因此，低氧預(yù)處理有可能成為增強(qiáng)BMSCs 來源外泌體功能的一個有效方法。