野生假芝的馴化栽培與抗氧化活性研究

賴麗紅 葉麗云 吳小平 謝寶貴

野生假芝的馴化栽培與抗氧化活性研究

賴麗紅 葉麗云 吳小平*謝寶貴

(福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心，福州 350002)

假芝的民間藥用歷史悠久，有消炎、利尿、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)調(diào)節(jié)等功效，開發(fā)價(jià)值大，對(duì)福建青芝山上采集到的一株野生假芝進(jìn)行分離，并利用形態(tài)學(xué)方法和ITS測(cè)序手段鑒定，確定其為假芝（）。對(duì)該野生假芝的生物學(xué)特性、馴化栽培以及子實(shí)體多糖清除DPPH自由基的抗氧化活性進(jìn)行探究的結(jié)果：菌絲生長的適宜碳源為蔗糖，適宜氮源為大豆蛋白胨，最適溫度范圍為25～30 ℃，最適pH范圍為8～9；采用仿野生短段木林下覆土栽培，兩年可產(chǎn)4潮子實(shí)體，生物轉(zhuǎn)化率達(dá)6.52%；其子實(shí)體多糖成分的抗氧化活性高于赤芝、紫芝。

野生假芝；鑒定；生物學(xué)特性；馴化栽培；抗氧化

假芝（）為靈芝科假芝屬真菌，別名烏芝，一般生長在林中地上或埋于地下的腐木上，是一種傳統(tǒng)的民間中草藥，具有重要的藥用價(jià)值[1-2]。由于野生假芝生長緩慢、產(chǎn)量低，供不應(yīng)求，價(jià)格昂貴，因而對(duì)野生假芝予以馴化栽培十分必要[3]。短段木林下覆土栽培，是一種將“林”和“菌”結(jié)合在一起的仿野生栽培模式，常用于靈芝的馴化栽培[4-5]。

赤芝、紫芝是靈芝科中分布和開發(fā)利用較為廣泛的種類，現(xiàn)代研究表明其多糖成分具有抗氧化、清除自由基的功效，但目前對(duì)假芝多糖抗氧化活性的研究報(bào)道尚少[6-7]。

DPPH自由基清除率檢測(cè)法，是一種簡單、快速、準(zhǔn)確、靈敏地篩選和評(píng)價(jià)天然抗氧化劑的檢測(cè)手段，可用于假芝多糖抗氧化活性的檢測(cè)[8-10]。青芝山是福建省五大名山之一，具有豐富的野生靈芝資源。本試驗(yàn)對(duì)一株采自青芝山上的野生假芝進(jìn)行分離鑒定，并研究其生物學(xué)特性、馴化栽培模式和多糖的抗氧化活性，以為野生假芝資源進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

假芝：采自福建省青芝山，經(jīng)組織分離獲得的純培養(yǎng)菌絲，編號(hào)為QZSJZ。赤芝J-7/AL-2、紫芝ZW-03均為子實(shí)體分離培養(yǎng)后獲得的菌種，由福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心提供。

1.2 培養(yǎng)基

PDA固體培養(yǎng)基：土豆200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 L，pH 7.0。

母種培養(yǎng)基：土豆200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g、大豆蛋白胨2 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、維生素B10.01 g、蒸餾水1 L，pH 8.0。

原種培養(yǎng)基：麥粒98.5%、石膏1.5%。

栽培種培養(yǎng)基：木屑78%、麩皮20%、石膏1%、石灰1%。

碳源實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基：瓊脂粉20 g、大豆蛋白胨2 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、維生素B10.01 g、蒸餾水1 L，pH 7.0。

氮源實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基：瓊脂粉20 g、葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、維生素B10.01 g、蒸餾水1 L，pH 7.0。

溫度實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：土豆200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g、大豆蛋白胨2 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、維生素B10.01 g、蒸餾水1 L，pH 7.0。

pH實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基：土豆200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g、大豆蛋白胨2 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、維生素B10.01 g、蒸餾水1 L。

1.3 野生假芝的形態(tài)學(xué)鑒定

測(cè)量野生假芝的菌蓋直徑和厚度、菌柄直徑和長度等，并觀察表面形態(tài)，記錄其表觀特征；在體式顯微鏡下觀察野生假芝的縱切面結(jié)構(gòu)；組織分離獲得純菌絲體，25 ℃避光培養(yǎng)，再次擴(kuò)接于平板上，觀察和記錄菌落生長初期和后期的形態(tài)，并在顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)；在顯微鏡下觀察野生假芝的孢子形態(tài)。

1.4 野生假芝的ITS序列鑒定

假芝DNA提取的方法參考傅俊生的方法[11],以假芝DNA為模板，以ITS1（5’-TCCGTAGGT GAACCTGCGG -3’）、ITS4（5’-TCCTCCGCTTATT GATATGC -3’）為引物，在PCR儀上進(jìn)行ITS序列擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物交由鉑尚生物技術(shù)有限公司完成測(cè)序工作。將測(cè)序的結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Nucleotide BLAST比對(duì)，再與GenBank中已有的ITS序列進(jìn)行同源性比較，利用MEGA5.05中的鄰位相連法（Neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析親緣關(guān)系，驗(yàn)證其形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果。

1.5 野生假芝的生物學(xué)特性研究

（1）最適碳源。在碳源實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別添加20 g/L的葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖和淀粉，以碳源實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對(duì)照，培養(yǎng)假芝菌絲。每處理設(shè)5個(gè)重復(fù)。

（2）最適氮源。在氮源實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別加入2 g/L的大豆蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸

膏等有機(jī)氮，硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等無機(jī)氮作為氮源，以氮源實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對(duì)照，培養(yǎng)假芝菌絲。每處理設(shè)5個(gè)重復(fù)。

（3）最適溫度。設(shè)置6個(gè)溫度梯度：10、15、20、25、30、35 ℃。每處理設(shè)5個(gè)重復(fù)。

（4）最適pH。設(shè)置7個(gè)pH梯度：5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0。每處理設(shè)5個(gè)重復(fù)。

（5）菌絲生長速度的測(cè)定。參照葉麗云的方法[12]測(cè)量菌絲的生長速度，并記錄菌絲長勢(shì)。

1.6 野生假芝的馴化栽培

本實(shí)驗(yàn)菌種的生產(chǎn)分為三級(jí)：母種、原種、栽培種，野生假芝馴化栽培的模式采用短段木林下覆土栽培，短段木選用闊葉林原木，截?cái)嘀?5 cm左右，具體工藝參照林下靈芝覆土栽培技術(shù)[13]。記錄主要商品性狀及栽培性狀，計(jì)算生物轉(zhuǎn)化率。

1.7 多糖提取與抗氧化活性測(cè)定

參考胡斌杰等[14]的方法，采用熱水浸提法提取假芝、赤芝、紫芝多糖，每樣品設(shè)5個(gè)重復(fù)，再利用苯酚—硫酸法檢測(cè)多糖的含量。參考曹正[15]的方法，采用DPPH法測(cè)定三種多糖的抗氧化活性，設(shè)5個(gè)多糖濃度梯度：0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/ L，以相應(yīng)濃度的維生素C水溶液作為陽性對(duì)照。按下列公式計(jì)算清除率：

清除率%=[（0-i+j）/A0]×100%。

式中：i為2 mL樣品溶液+2 mL DPPH溶液的吸光度；j為2 mL樣品溶液+2 mL無水乙醇的吸光度；0為2 mL DPPH溶液+2 mL蒸餾水的吸光度。

1.8 數(shù)據(jù)處理

利用Excel和SPSS軟件對(duì)獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生假芝的形態(tài)學(xué)鑒定

（1）外觀性狀（圖1）。假芝為木栓質(zhì)，菌蓋近腎形或半圓形，灰褐色至暗褐色，直徑4～8 cm，厚約1.0 cm，有顯著的同心環(huán)帶，無亮漆狀光澤，有細(xì)微絨毛，邊緣呈波浪狀。菌背初期為白色，傷變血紅色，成熟后為灰褐色，傷變不變色。菌柄近乎實(shí)心，側(cè)生或偏生，長5～12 cm，粗0.5～1.2 cm，近圓柱形或稍扁平，具短絨毛，與菌蓋顏色相同或稍深。這與黃年來《中國大型真菌原色圖鑒》[16]中描述的假芝（）外觀性狀一致。

在體視顯微鏡下，可觀察到假芝子實(shí)體的結(jié)構(gòu)主要由6個(gè)部分組成，從上到下分別為菌蓋表面、菌皮、皮層、菌肉、菌管和菌柄。皮層是菌皮和菌肉的過渡層，顏色較淡，從近菌柄端到菌蓋邊緣不斷變薄直至消失；菌皮、菌肉的排列較疏松，結(jié)構(gòu)柔軟；而菌管排列緊密，由管狀結(jié)構(gòu)組成，菌管口呈近圓形或多邊形。

圖1 野生假芝的子實(shí)體形態(tài)

（2）菌絲及孢子的形態(tài)特征（圖2）。假芝菌落生長初期為白色，菌絲生長旺盛，致密，邊緣整齊；隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，菌落開始產(chǎn)生褐色分泌物，從接種塊往外逐漸變成褐色。在顯微鏡400倍下觀察，菌絲細(xì)長，壁薄，具隔膜、分枝和粉孢子。孢子近球形，淡黃褐色，與黃年來《中國大型真菌原色圖鑒》[16]中描述的假芝孢子形態(tài)特征一致。

圖2 假芝菌絲及孢子的形態(tài)

2.2 野生假芝的ITS序列鑒定

將采集的野生假芝樣本的DNA測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Nucleotide BLAST比對(duì)，結(jié)果與登錄號(hào)為KU219986.1的假芝（）的相似度高達(dá)98%。將GenBank中已知的假芝屬真菌片段序列與QZSJA菌株以鄰位相連的方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3），可以看出QZSJZ菌株與假芝的親緣關(guān)系最近，支持率達(dá)100%，進(jìn)一步驗(yàn)證了形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果。

2.3 假芝的生物學(xué)特性

（1）最適碳源。假芝菌絲在不同碳源培養(yǎng)基中均能生長（表1），其中以在蔗糖培養(yǎng)基中生長表現(xiàn)佳，菌絲潔白致密，邊緣整齊，日均生長速度快，達(dá)0.78 cm，其次是麥芽糖、淀粉、果糖、葡萄糖。以乳糖為碳源時(shí)，菌絲生長速度慢，各重復(fù)處理的一致性較差。

（2）最適氮源。假芝菌絲在3種有機(jī)氮源培養(yǎng)基中均能正常生長（表1），其中以大豆蛋白胨為氮源時(shí)，生長表現(xiàn)佳：菌絲潔白濃密，重復(fù)處理的一致性好，日均生長速度快，達(dá)0.79 cm。其次為酵母浸膏。以牛肉浸膏為氮源時(shí)，菌絲生長較慢，各重復(fù)處理的一致性較差。三種有機(jī)氮源之間均具有極顯著的差異。

而在以無機(jī)氮源（硫酸銨、硝酸銨、氯化銨）為氮源時(shí)，假芝菌絲與對(duì)照表現(xiàn)相同，均不生長（表1），說明假芝菌絲無法利用無機(jī)氮源。

綜上，假芝菌絲的最適氮源為大豆蛋白胨。

表1 不同碳源和氮源條件下QZSJZ菌株菌絲的生長速度

注：+++、++和+分別表示菌絲生長致密、較致密和稀疏，－表示菌絲不生長；同列數(shù)據(jù)后大小寫字母不同表示差異極顯著（<0.01）和顯著（<0.05)。表2同。

（3）最適溫度。假芝菌絲在10 ℃、15 ℃、35 ℃時(shí)基本不生長，在20～30 ℃下可正常生長（表2），其中以30 ℃時(shí)，菌絲潔白、致密，邊緣平整，長勢(shì)好，日均生長速度快，達(dá)0.96 cm。其次為25 ℃時(shí)，菌絲長勢(shì)較好，生長速度較快。在20 ℃時(shí)，菌絲長勢(shì)稀疏，邊緣較不規(guī)則。綜上，假芝菌絲的最適溫度范圍25～30 ℃。

（4）最適pH。假芝菌絲在pH 5.0～10.0均能正常生長（表2）。以pH為8.0時(shí)，菌絲潔白濃密，邊緣平整，重復(fù)處理的一致性好，日均生長速度快，達(dá)0.80±0.04 cm；其次是pH 9.0，日均長速為0.76±0.11 cm。pH為6.0時(shí)，雖然菌絲生長較快，但不致密。綜上，假芝菌絲最適pH為8.0～9.0。

圖3 QZSJZ菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹

表2 不同溫度和pH條件下QZSJZ菌株菌絲的生長速度

2.4 假芝的馴化栽培

試驗(yàn)結(jié)果表明，假芝可以采用短段木林下覆土模式進(jìn)行栽培，栽培獲得的子實(shí)體菌蓋為灰褐色，直徑7.03±0.47 cm，厚度1.07±0.13 cm；菌背幼芝時(shí)為白色，成熟后為灰褐色；菌柄長10.50±2.53 cm；單生，出菇整齊（圖4）。該栽培模式下，兩年可產(chǎn)4潮子實(shí)體，子實(shí)體大量發(fā)生在第二年，兩年總產(chǎn)量為75 kg/m3（鮮重），生物轉(zhuǎn)化率達(dá)6.52%。

2.5 抗氧化活性的比較分析

通過DPPH法測(cè)定子實(shí)體多糖的抗氧化活性，結(jié)果表明，假芝、赤芝、紫芝的多糖成分對(duì)DPPH自由基均表現(xiàn)出一定的清除能力，并且在一定范圍內(nèi)，隨多糖濃度的提高，清除能力增強(qiáng)（圖5）。其中，以多糖濃度為1.0 mg/mL時(shí)，假芝（人工栽培）清除DPPH自由基的能力強(qiáng)，清除率為70.04%；紫芝次之，為62.28%；赤芝最低，為50.07%。表明假芝是一種優(yōu)質(zhì)的天然抗氧化劑，對(duì)DPPH自由基清除作用優(yōu)于赤芝和紫芝，非常值得開發(fā)利用。

圖4 馴化假芝的子實(shí)體形態(tài)

3 小 結(jié)

假芝屬（）是靈芝科中的重要亞屬之一，主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，其模式產(chǎn)地在薩摩亞。目前我國已報(bào)道的假芝共有22種，包括鄒蓋假芝（）、福建假芝（）、廈門假芝（）、假芝（）、漆黑假芝（）等[17]。假芝的民間藥用歷史悠久，有消炎、利尿、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)調(diào)節(jié)等功效，開發(fā)價(jià)值高。但目前仍未見假芝的正式開發(fā)利用和成果轉(zhuǎn)化的報(bào)道，這可能是同科內(nèi)的赤芝、紫芝為大眾所認(rèn)知，具有壓倒性的優(yōu)勢(shì)所致。因此，對(duì)假芝進(jìn)行深入研究和開發(fā)利用很有必要[18]。

圖5 3種不同子實(shí)體多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力

本研究利用形態(tài)學(xué)方法和ITS測(cè)序手段對(duì)一株野生菌進(jìn)行鑒定，確定其為假芝（），并探索其適宜的培養(yǎng)條件，結(jié)果：最適碳源為蔗糖，最適氮源為大豆蛋白胨，最適溫度25～30 ℃，最適pH為8.0～9.0。采用仿野生短段木林下覆土栽培獲得成功，生物轉(zhuǎn)化率達(dá)6.52%。對(duì)其抗氧化活性的測(cè)定結(jié)果顯示，假芝多糖的抗氧化能力高于赤芝和紫芝。后續(xù)將探究假芝多糖的結(jié)構(gòu)、抗氧化作用機(jī)理以及其他活性成分的功效，為其進(jìn)一步開發(fā)利用和成果轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

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Study on biological characteristics and antioxidant activity of a wild

Lai Lihong Ye Liyun Wu Xiaoping*Xie Baogui

（Mycological Research Center of Fujian Agricultural and Forestry University, Fuzhou 350002, China）

In this study, a wildwas collected in Qingzhi Mountain, Fujian Province, pure mycelium was obtained by separation. Using morphological method and ITS sequencing analysis, the strain was identified as. Biological characteristics, domesticated methods and antioxidant activity of free radicals scavenging DPPH polysaccharides were investigated. The results showed that the optimal carbon source of the wildmycelium was sucrose; The optimum nitrogen source was peptone; the optimum temperature range for 25～30 ℃; the optimum pH range is 8～9. Its artificial cultivation is feasible, the biological conversion rate is 6.52%, and the antioxidant activity of subentity polysaccharide was higher than that of theand.

wild; identification; biological characteristics; domesticated; antioxidant

S646.2

B

2095-0934（2021）04-328-06

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究”重點(diǎn)專項(xiàng)——閩產(chǎn)高品質(zhì)道地中藥材靈芝、太子參規(guī)范化種植及精準(zhǔn)扶貧示范研究（2019YFC1710500）

賴麗紅（1993－），女，理學(xué)學(xué)士，主要研究方向?yàn)槭秤镁z傳育種。E-mail：953254839@qq.com。

吳小平（1965－），男，博士，教授，從事食用菌教學(xué)與科研。E-mail：fjwxp@126.com。