基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的滑膜炎膏治療膝骨性關(guān)節(jié)炎機(jī)制研究

張珅，張磊

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430014；2.武漢市中醫(yī)醫(yī)院骨傷科,湖北 武漢 430014)

0 引言

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎是臨床上最為常見的、以關(guān)節(jié)退變?yōu)榛A(chǔ)的疾病，特征為關(guān)節(jié)間隙變窄、滑膜增厚、軟骨退變、骨質(zhì)增生，導(dǎo)致出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)腫脹疼痛，活動(dòng)受限等癥狀[1]。目前，西醫(yī)治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的保守治療手段以口服消炎止痛藥、軟骨保護(hù)藥物、物理治療、關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物為主。雖有部分短期療效，但長時(shí)間口服抗炎止痛藥，可能會出現(xiàn)消化道潰瘍、出血、胃腸道穿孔、肝腎損傷等不良反應(yīng)[2]。中醫(yī)認(rèn)為本病應(yīng)屬“骨痹”之范疇。本病病因病機(jī)為肝腎虧虛，氣血虧虛或慢性的長期勞損導(dǎo)致筋脈失于濡養(yǎng)，風(fēng)、寒、濕等外界邪氣侵襲人體致使筋脈不通，氣血瘀滯而痛。以肝腎虧虛為本，氣滯血瘀、感受外邪為標(biāo)[3]。相比于西醫(yī)保守治療常規(guī)口服藥的局限性，中醫(yī)的外治法往往可以體現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢。

滑膜炎膏是由武漢市中醫(yī)醫(yī)院骨科自行研制，以制草烏，制川烏，制南星，甘松，山柰，玄胡，細(xì)辛打成細(xì)粉后，將藥粉用酒調(diào)和后外敷用的外用中藥膏劑。本研究采取網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法分析滑膜炎膏治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的分子作用機(jī)制，用數(shù)據(jù)庫篩選滑膜炎膏中包含的活性化合物及其作用靶點(diǎn)，并加以分析，構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，對信號通路進(jìn)行分析，從分子層面預(yù)測藥物的作用機(jī)制，為滑膜炎膏的臨床運(yùn)用和進(jìn)一步研究提供理論支撐。

1 方法

1.1 收集并篩選滑膜炎膏中的化合物

借助TCMSP數(shù)據(jù)庫分別以“川烏”“草烏”“天南星”“甘松”“山柰”“細(xì)辛”“玄胡”為關(guān)鍵詞檢索滑膜炎膏的化合物成分?；谝延形墨I(xiàn)研究，以類藥性≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)，對藥物成分進(jìn)行篩選，篩選出制草烏，制川烏，制南星，甘松，山柰，玄胡，細(xì)辛中符合標(biāo)準(zhǔn)的活性成分。

1.2 靶標(biāo)蛋白的篩選和活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將從滑膜炎膏中篩選所得到的活性成分在TCMSP數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，查找對應(yīng)靶標(biāo)蛋白，在Uniprot數(shù)據(jù)庫中查詢靶標(biāo)蛋白所對應(yīng)的基因名，將多余或重復(fù)的靶點(diǎn)刪除。利用Cytoscape3.7.2構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)并對其中的化合物和作用靶點(diǎn)加以分析。

1.3 預(yù)測滑膜炎膏治療膝骨性關(guān)節(jié)炎潛在作用靶點(diǎn)

在Genecards數(shù)據(jù)庫[4]中檢索與“Knee Osteoarthritis”相關(guān)的基因，獲得膝骨性關(guān)節(jié)炎相關(guān)疾病靶點(diǎn)。對1.1中的活性成分靶點(diǎn)與疾病基因靶點(diǎn)取交集，獲得的交集靶點(diǎn)即為滑膜炎膏治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并分析

用String數(shù)據(jù)庫[5]構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，將“1.3”獲得的潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫，設(shè)置物種“Homo Sapiens”，獲取蛋白之間的PPI網(wǎng)絡(luò)，以TSV格式保存，將TSV文件導(dǎo)入Cytoscape3.7.2，利用“Network Analyzer”功能分析后得到滑膜炎膏發(fā)揮藥理作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 靶點(diǎn)的通路分析

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，設(shè)置P<0.05，物種設(shè)置為“HomoSapiens”，將靶點(diǎn)基因的名稱修正為官方名稱(Official Gene Symbol)，分別進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析。GO富集分析選取生物過程(Biological Processes，BP)，細(xì) 胞 功 能 (Molecular Function，MF)，細(xì) 胞 組 分(Cell Composition，CC)，用Omic Share云平臺中的繪圖工具，按照富集的靶點(diǎn)數(shù)排序并選取主要條目，繪制氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 篩選滑膜炎膏中的活性化合物

通過 TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索得到滑膜炎膏中化合物共521個(gè)，其中12個(gè)來自川烏、27個(gè)來自草烏、123個(gè)來自天南星、57個(gè)來自甘松、33個(gè)來自山柰、192個(gè)來自細(xì)辛、77個(gè)來自玄胡。根據(jù)DL≥0.18的標(biāo)準(zhǔn)，篩選得到符合標(biāo)準(zhǔn)的化合物共156個(gè)，化合物中7個(gè)來自川烏、15個(gè)來自草烏、34個(gè)來自天南星、12個(gè)來自甘松、2個(gè)來自山柰、15個(gè)來自細(xì)辛、71個(gè)來自玄胡。表1是滑膜炎膏中部分活性化合物的基本信息。

表1 滑膜炎膏中部分活性化合物的基本信息

2.2 構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)并分析

利用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建如圖1所示的滑膜炎膏中活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)共包含節(jié)點(diǎn)311個(gè)，藥物節(jié)點(diǎn)7個(gè)，活性化合物節(jié)點(diǎn)156個(gè)，基因靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)148個(gè)，共3053條邊。圖中滑膜炎膏中的藥物用紅色圓形表示，篩選出滑膜炎膏中的活性化合物用藍(lán)色三角形表示，靶點(diǎn)基因用綠色菱形表示，每種藥物與活性化合物的包含關(guān)系、活性化合物與靶點(diǎn)基因之間存在相互作用關(guān)系用彼此間的連線表示。對活性成分和靶點(diǎn)的中心度值進(jìn)行分析并排序，排在前5的活性成分為Quercetin(槲皮素)、Kaempferol(山柰酚)、β-Sitosterol(β-谷甾醇)、Stigmasterol(豆甾醇)、Coumarin(香豆素)。靶點(diǎn)方面，排名前5的分別是ESR1、F2、AR、PTGS2、NOS2。

續(xù)表1

圖1 滑膜炎膏中活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.3 滑膜炎膏治療膝骨性關(guān)節(jié)炎潛在作用靶點(diǎn)的預(yù)測

在GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索后，得到1772個(gè)膝骨性關(guān)節(jié)炎的潛在靶點(diǎn)。運(yùn)用Venn在線平臺繪制Venn圖，將膝骨性關(guān)節(jié)炎的潛在靶點(diǎn)與滑膜炎膏中活性成分靶點(diǎn)映射并取交集，獲得68個(gè)滑膜炎膏治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的潛在作用靶點(diǎn)，見圖2。

圖2 滑膜炎膏治療膝骨性關(guān)節(jié)炎潛在靶點(diǎn)Venn圖

2.4 構(gòu)建滑膜炎膏的PPI網(wǎng)絡(luò)并分析

滑膜炎膏的PPI網(wǎng)絡(luò)見圖3，在STRING數(shù)據(jù)庫中，輸入滑膜炎膏治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的潛在靶點(diǎn)基因，構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中共包含68個(gè)節(jié)點(diǎn)，785條邊。其中超過平均節(jié)點(diǎn)度值(23.08)的靶蛋白有32個(gè)，利用Cytoscape3.7.2軟件篩選出這些關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，見圖4。

圖3 滑膜炎膏“蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)

2.5 靶點(diǎn)的GO富集分析及KEGG通路分析

通過DAVID數(shù)據(jù)庫對潛在靶點(diǎn)進(jìn)行分析，共得到GO富集條目437個(gè)(P<0.05)，其中包括317個(gè)生物過程、52種細(xì)胞功能和68類細(xì)胞組分。選取排名前20的GO條目制作氣泡圖。GO注釋多與BP和MF有關(guān)，如細(xì)胞代謝、增殖凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化還原酶活性、過氧化物酶活性等。

KEGG通路富集分析篩選后獲得80條 (P<0.05)信號通路，主要涉及HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、T細(xì)胞受體信號通路(T cell receptor signaling pathway)、血管內(nèi)皮生長因子信號通路(VEGF signaling pathway)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)、破骨細(xì)胞分化(Osteoclast differentiation)、鞘脂信號通路(Sphingolipid signaling pathway)、雌激素信號通路(Estrogen signaling pathway)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)等。選取富集基因前20條的通路繪制相應(yīng)氣泡圖，見圖8，X軸代表所占百分比，Y軸代表通路名稱，氣泡的面積大小代表通路富集基因數(shù)。

圖5 滑膜炎膏治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的BP富集氣泡圖

圖6 滑膜炎膏治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的MF富集氣泡圖

圖7 滑膜炎膏治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的CC富集氣泡圖

圖8 滑膜炎膏治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的KEGG富集氣泡圖

3 討論

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎作為一種臨床中常見骨科疾病，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)間隙變窄，軟骨磨損和破壞，骨質(zhì)增生及關(guān)節(jié)腔積液形成等。目前西醫(yī)的非手術(shù)治療首選口服止痛藥非甾體類抗炎藥，如果長時(shí)間口服抗炎止痛藥，存在消化性潰瘍、心血管危害、肝腎損傷等風(fēng)險(xiǎn)，且遠(yuǎn)期療效不理想[2]。中醫(yī)認(rèn)為，膝骨性關(guān)節(jié)炎在中醫(yī)學(xué)中屬“痹癥”范疇，本病多因肝腎虧虛，氣血虧虛或慢性的長期勞損導(dǎo)致筋脈失于濡養(yǎng)，風(fēng)、寒、濕等邪氣侵襲人體致使筋脈不通，氣血瘀滯。以肝腎虧虛為本，氣滯血瘀、感受外邪為標(biāo)。本院自制滑膜炎膏由臨床應(yīng)用多年的中藥驗(yàn)方改良而來，其中川烏草烏性辛熱、除風(fēng)濕，溫經(jīng)通絡(luò)，且止痛作用強(qiáng)；天南星辛溫燥烈，長于除經(jīng)絡(luò)中之風(fēng)痰濕濁，還可消腫散結(jié)；甘松外用可祛濕消腫；《嶺南采藥錄》記載：山柰，治跌打傷，又能消腫。玄胡苦辛性溫，行氣活血，擅長止痛；細(xì)辛辛香溫散，祛風(fēng)散寒，除濕止痛。以上諸藥以酒調(diào)制，取其辛散溫通之性以助藥勢，并可加強(qiáng)活血通絡(luò)之功，引諸藥直達(dá)病所。本方具有祛風(fēng)寒、除濕痹、消腫止痛之功，且為外用藥物，不會產(chǎn)生胃腸道不良反應(yīng)、加重肝腎負(fù)擔(dān)。

本研究采取網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法檢索并篩選，得到滑膜炎膏中包含化合物521個(gè)，156個(gè)活性成分，148個(gè)作用靶點(diǎn)，68個(gè)治療膝骨性關(guān)節(jié)炎潛在作用靶點(diǎn)，其中度值排在前5的有槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇、香豆素。槲皮素的藥理作用主要包括抗炎、保護(hù)骨關(guān)節(jié)、抗細(xì)胞凋亡、抑制破骨細(xì)胞吸收等[6]。賈慶運(yùn)等[7]發(fā)現(xiàn)槲皮素可明顯改善CIA小鼠的關(guān)節(jié)腫脹癥狀，且能有效減輕關(guān)節(jié)破壞、降低關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)而不產(chǎn)生肝損害。此外槲皮素可減輕細(xì)胞炎性因子表達(dá)，保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨[8]。WONG等[9]通過一項(xiàng)體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，山柰酚主要是通過抑制脂肪生成、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、破骨細(xì)胞自噬和成骨細(xì)胞凋亡等一系列方式達(dá)到骨保護(hù)作用。此外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，山柰酚能有效控制CIA小鼠模型滑膜炎癥[10]；β-谷甾醇可以發(fā)揮良好的抗氧化、抗炎和調(diào)節(jié)免疫作用[11]。曾莉萍[12]等研究發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇能夠有效地提高成骨細(xì)胞護(hù)骨素(OPG)與破骨細(xì)胞分化因子(ODF)的比值，可以起到調(diào)節(jié)骨代謝平衡作用。研究表明，豆甾醇具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化等作用[13]，Chen等[14]通過評估家兔的膝骨性關(guān)節(jié)炎模型發(fā)現(xiàn)，豆甾醇能明顯抑制軟骨降解和MMPs的表達(dá)，證明了豆甾醇在治療膝骨性關(guān)節(jié)炎方面的存在潛力。香豆素及其衍生物具有較好的藥理活性，如抗炎、抗菌、抗氧化、抗癌以及抑制酪氨酸酶等生物活性，除此之外，一部分香豆素類化合物還表現(xiàn)出了鎮(zhèn)痛的活性[15]。

通過對滑膜炎膏與膝骨性關(guān)節(jié)炎共同靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn)，滑膜炎膏治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的主要靶點(diǎn)包括IL-6、IL-1β、TNF、VEGFA、MAPK1等靶點(diǎn)。IL-6和IL-1β為重要炎性細(xì)胞因子，研究顯示TNF和IL-6參與調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)，是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中的主要介質(zhì)[16]。Neide[17]等在研究中發(fā)現(xiàn)，IL-6與關(guān)節(jié)液中膠原酶(破壞軟骨基質(zhì)的主要酶類)的濃度相關(guān)性較高。IL-6可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞分泌免疫球蛋白，進(jìn)一步使炎癥加重。除此之外，IL-6可以與IL-1協(xié)同，通過抑制軟骨細(xì)胞中蛋白聚糖的合成致使軟骨基質(zhì)缺失。由此可推斷，IL-6可加重關(guān)節(jié)軟骨的破壞以及關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)展。研究表明，VEGFA會促進(jìn)MMP-1和MMP-3表達(dá)，破壞關(guān)節(jié)軟骨[18]。VEGFA在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中參與了諸如滑膜增生、軟骨基質(zhì)降解、軟骨下骨硬化及骨贅生成等重要病理過程[19]。MAPK(絲裂原活化蛋白激酶)家族中包括了erk1/2、jnk1/2和p38。它們由雙磷酸化激活，參與了細(xì)胞增殖、分化、凋亡和炎癥反應(yīng)[20]。

從靶點(diǎn)的GO富集分析可看出，主要涉及到了細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)等生物過程，這些生物過程可能在滑膜炎膏對膝骨性關(guān)節(jié)炎的治療中起到了較關(guān)鍵的作用。KEGG通路富集分析顯示，滑膜炎膏治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的潛在作用靶點(diǎn)主要涉及HIF-1信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、血管內(nèi)皮生長因子信號通路、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、MAPK信號通路等。這些信號通路主要涉及MAPK和TNF。MAPK與PI3K-Akt同屬破骨細(xì)胞分化信號通路，該通路可以通過調(diào)節(jié)、控制成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞間的平衡，影響疾病發(fā)展[21]。MAPK信號通路能夠通過使成骨細(xì)胞中相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子抗體磷酸化來調(diào)控其基因表達(dá)，進(jìn)而影響成骨細(xì)胞的分化及凋亡[18]。PI3K-Akt信號通路可控制軟骨細(xì)胞的增殖分化，使軟骨細(xì)胞的丟失減少、關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨層的脫落減輕，進(jìn)而改善骨關(guān)節(jié)炎的癥狀[22]。腫瘤壞死因子信號通路中的TNF-α可刺激滑膜成纖維細(xì)胞增生，產(chǎn)生金屬蛋白酶，激活B細(xì)胞生成自身抗體，會加重關(guān)節(jié)軟骨的破壞[23]。

綜上，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析了自制滑膜炎膏治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的機(jī)制，從分子層面闡釋了該方的藥理機(jī)制可能是以多成分、多靶點(diǎn)、多通路的整體調(diào)節(jié)方式，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡、炎癥反應(yīng)以發(fā)揮治療作用，也為本方的臨床運(yùn)用和進(jìn)一步開發(fā)提供了理論支撐。但本研究仍存在局限性，首先，中藥膏劑的制作工藝尚未有嚴(yán)格的量化標(biāo)準(zhǔn)，藥物的純度測定等也有待完善。其次，由于所選數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)不一定完全，忽略了藥材中的成分含量、藥物成分之間的相互作用、藥物經(jīng)皮吸收率等影響因素，因此滑膜炎膏治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。