薯蕷皂苷元對脊髓缺血再灌注損傷大鼠模型的保護作用

王婧雯，李昌澤，徐瑋臻，華葉婧，王桐桐，谷婉瑩，鄭薈，隋宏書*

(1.山東第一醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，山東 泰安 271000；2.山東第一醫(yī)科大學組織學與胚胎學教研室，山東 泰安 271000)

0 引言

脊髓缺血后再灌注損傷(Spinal Cord Ischemia Injury，SCII)的病理過程是脊髓修復和功能重建的瓶頸，由于目前尚無有效治療手段，常導致不可逆性肢體功能障礙，影響患者的身心健康。引起脊髓缺血再灌注損傷的病理因素是復雜的，脂質(zhì)過氧化、鈣離子蓄積、細胞凋亡以及炎癥反應等因素均可導致SCII的發(fā)生[1]。薯蕷皂苷元(diosgenin)是一種從茄屬植物和薯蕷屬植物中獲得天然留體皂苷配基，具有抗氧自由基、對抗鈣超載和抑制細胞凋亡的作用[2]，目前臨床多利用其抗炎作用生產(chǎn)甾體激素類藥物如氫化可的松、地塞米松等[3]。但是，關(guān)于薯蕷皂苷元在大鼠的脊髓缺血再灌注損傷模型中的保護作用尚未見報道。鑒于此，本項目擬通過手術(shù)建立大鼠SCII模型，探究薯蕷皂苷元對脊髓組織氧化損傷的保護程度。同時通過分子生物學等技術(shù)探究該保護作用的具體分子機制，為臨床上治療SCII提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品與儀器

丙二醛檢測試劑盒購自深圳子科生物科技有限公司，超氧化物歧化酶的檢測試劑盒購自上海瑞番生物研究所，薯蕷皂苷元購自成都化夏化學試劑有限公司。UV1000紫外/可見分光光度計(濟南千司生物有限公司)；恒溫水浴鍋(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司)。

1.2 實驗動物

30只5 周齡雄性SD大鼠(250～280g)，購自濟南朋悅實驗動物繁育及生物技術(shù)研究所。動物房通過控光實現(xiàn)12h光照-黑暗循環(huán)，保持良好通風及適宜室溫(23～26℃)。本實驗所用動物的飼養(yǎng)程序均符合國家《實驗動物管理條例》的各項標準和山東第一醫(yī)科大學動物管理委員會倫理指南。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠SCII模型的建立

30只5 周齡雄性SD大鼠隨機分為三組：假手術(shù)組、SCII組、干預組。采用10%水合氯醛，2mL/kg進行腹腔注射，將大鼠側(cè)臥固定，備皮后使用75%酒精消毒，在大鼠左側(cè)肋弓下緣中線做切口，沿左腎和左腎動脈尋找腹主動脈，假手術(shù)組只暴露并游離腹主動脈，SCII 組及干預組于腎動脈以下用動脈夾持續(xù)夾閉45min。完全阻斷腹主動脈血流的標志是感受不到股動脈搏動及大鼠雙后肢出現(xiàn)發(fā)紺冰涼現(xiàn)象。實驗中需使用烤燈維持大鼠體溫，并用生理鹽水濕敷?？p合創(chuàng)口后肌注青霉素以預防感染。

1.3.2 給藥及取材方法

大鼠SCII模型建立30min后，干預組予以100mg/kg薯蕷皂苷元灌胃，假手術(shù)組和SCII組腹腔灌胃等體積0.9%的生理鹽水。于血液再灌注24h后觀察清醒大鼠的后肢運動情況并評分，處死大鼠并取腰段脊髓稱重檢測。切取脊髓組織時大鼠取俯臥位，于腰背正中做切口，由淺入深經(jīng)皮膚、筋膜至大鼠脊椎，由脊椎棘突分離附近肌肉，使用咬骨鉗等工具盡量完整取出L1-4的脊髓待測。

1.4 檢測指標

1.4.1 大鼠脊髓組織病理學改變

取腰段脊髓做HE染色切片，由非本實驗成員且熟悉脊髓切片的觀察者于顯微鏡下觀察，比較評估各組脊髓組織病理學結(jié)構(gòu)特征及差異。正常神經(jīng)元判斷標準：細胞外形輪廓清晰、細胞核及尼氏體染色均勻。

1.4.2 大鼠后肢運動功能評分

術(shù)后24h根據(jù)脊髓損傷評分標準(BBB)對各組大鼠后肢的運動功能進行比較，重點觀察大鼠后肢各關(guān)節(jié)運動情況和行走步態(tài)。0～7分：評價大鼠后肢的關(guān)節(jié)運動功能；8～13分：評價大鼠整體協(xié)調(diào)運動及行走步態(tài)；14～21分：評價大鼠爪子的精細運動情況。評分采用雙盲制，即每次分別由經(jīng)過學習培訓后的兩人獨立完成，最終數(shù)據(jù)取兩人平均值。

1.4.3 氧化應激指標檢測

取腰段脊髓加入9倍體積的鹽水制成10%的勻漿，3000r/min離心10min，取上清液，采用分光光度法測定脊髓組織勻漿中 SOD的活性和MDA的含量，根據(jù)氮藍四唑(nitro-blue tetrazolium，NBT)光還原法測定SOD活性；根據(jù)硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)法測定MDA含量。其余詳細測定步驟參考兩者試劑盒內(nèi)的說明書。

1.5 統(tǒng)計方法

處理實驗數(shù)據(jù)時使用SPSS 17.0軟件，按照(mean±SEM)的格式記錄數(shù)據(jù)。兩組間數(shù)據(jù)比較時用獨立樣本t檢驗；多樣本間數(shù)據(jù)比較時用單因素方差分析，當涉及多重數(shù)據(jù)比較時用LSD方法。如果所得實驗數(shù)據(jù)不符合應用單因素方差分析的條件，則應用秩和檢驗法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 大鼠脊髓組織病理學變化

假手術(shù)組鏡下細胞外形正常，核仁、尼氏體可見，組織中未見出血、水腫。SCII組可見大量神經(jīng)元細胞固縮、壞死，膠質(zhì)細胞增生，灰質(zhì)出血以及中性粒細胞浸潤。干預組可見神經(jīng)元細胞結(jié)構(gòu)清晰，部分細胞核仁可見，空泡形成相對較少，未見明顯出血。

圖1 三組大鼠脊髓組織HE染色切片

2.2 大鼠后肢運動功能評分

由BBB評分法比較各組大鼠后肢的運動功能，重點記錄大鼠后肢各關(guān)節(jié)運動情況和行走步態(tài)(詳見表1)。

表1 手術(shù)后24h大鼠后肢運動功能評分(n=10, mean±SEM)

數(shù)據(jù)顯示假手術(shù)組大鼠后肢未出現(xiàn)癱瘓。SCII組和干預組大鼠的后肢均出現(xiàn)不同程度的癱瘓。與假手術(shù)組相比，SCII組BBB評分顯著降低(19.33 vs 6.00，P<0.05)，提示造模成功。干預組的BBB分值相比假手術(shù)組也相應降低(13.33 vs 19.33，P<0.05)，但明顯優(yōu)于SCII組(13.33 vs 6.00，P<0.05)，提示使用薯蕷皂苷元干預可明顯改善大鼠后肢運動情況。

2.3 大鼠脊髓氧化應激指標

圖2所示，與假手術(shù)組相比，SCII組和干預組大鼠脊髓組織中SOD水平均降低(6.34 vs 2.73，4.12，P<0.05)，MDA水平均升高(3.90 vs 9.80，6.63，P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義，提示造模成功。與SCII組相比較，干預組大鼠脊髓組織中SOD水平顯著升高(2.73 vs 4.12，P<0.05)，MDA水平顯著降低(9.80 vs 6.63，P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義，提示使用薯蕷皂苷元干預可以改善脊髓組織氧化應激造成的損傷。

圖2 手術(shù)后24hSOD和MDA活力水平

3 討論

脊髓損傷作為一種嚴重的外科疾病，對人們生活質(zhì)量造成嚴重威脅，其中缺血再灌注造成的損傷致殘率、且致死率較高。前期研究發(fā)現(xiàn)脊髓組織較其他組織中含有較多不飽和脂肪酸，因此對氧自由基介導的脂質(zhì)過氧化較為敏感，也更易受到自由基破壞。因此國內(nèi)學者普遍認為氧化應激是引起脊髓缺血再灌注損傷的重要病理機制之一，研究利用具有抗氧化作用的藥品拮抗氧自由基已成為研究的熱點，比如右美托咪定[4]等。

本研究通過手術(shù)持續(xù)夾閉大鼠腹主動脈45min，構(gòu)建脊髓缺血再灌注模型，并用100mg/kg的薯蕷皂苷元進行干預治療。實驗以超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平作為檢驗脊髓組織氧化損傷程度的指標，探究薯蕷皂苷元的抗氧化功能在脊髓損傷中的保護作用。脊髓組織病理切片顯示，SCII組神經(jīng)元細胞固縮、壞死，可見大量空泡。根據(jù)脊髓損傷評分標準評分，SCII組和干預組大鼠均出現(xiàn)后肢功能障礙，表明大鼠SCII模型構(gòu)建成功。實驗數(shù)據(jù)說明，與假手術(shù)組相比，SCII組和干預組的SOD活性均降低，MDA水平均升高，這與葉勁濤等[5]的研究一致，考慮其原因可能為：血液再灌注時，氧自由基增多抑制超氧化物歧化酶等多種內(nèi)源性抗氧化酶活性，使其失去對氧自由基的清除能力；氧自由基增多還可引起脂質(zhì)過氧化反應，丙二醛作為脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物相應增加，破壞細胞膜和線粒體的功能。與SCII組相比，使用薯蕷皂苷元干預后，大鼠脊髓組織中SOD活性提高，MDA水平降低。通過處理BBB評分，證明干預組大鼠后肢運動功能顯著改善，以上均提示薯蕷皂苷元具有減輕脊髓損傷的作用。

綜上所述，薯蕷皂苷元對脊髓缺血再灌注損傷具有一定的保護作用，機制可能為薯蕷皂苷元通過抗氧化作用，減輕缺血再灌注所致的脊髓組織氧化應激損傷。薯蕷皂苷元的來源較廣，具有一定的臨床應用價值，但有關(guān)薯蕷皂苷元改善脊髓損傷功能的具體細胞信號轉(zhuǎn)導機制還需進一步探討。