以白藜蘆醇為結構單元的丹酚酸A類似物的合成及其體外抗氧化作用測定

陳妙佳， 馬思明， 李 洋， 賀 芬， 彭俊梅， 唐國濤， 曹 軒

(南華大學藥物藥理研究所 湖南省分子靶標新藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南省衡陽市421001)

丹酚酸A是從丹參中分離得到的酚酸類化合物，具有很強的抗氧化活性[1-2]。研究表明，丹酚酸A有望成為一種新的心腦血管保護劑[3-4]。但是丹酚酸A具備雙鍵、酯基、手性等復雜的結構，合成難度很大。由于丹酚酸A在丹參中的含量很小，如果直接從丹參中提取和純化，步驟復雜且產率很低。因此，丹酚酸A的原料來源有限且價格昂貴，限制了其進一步研究[5-6]。因此合成丹酚酸A的結構類似物對研究丹酚酸A類化合物的結構以及藥理活性具備重要的理論價值[7-8]。

本文擬設計全新的丹酚酸A的類似物，結構改造如下：①采用碳氮雙鍵或碳氮單鍵替代丹酚酸A中的酯鍵，提高化合物的穩(wěn)定性；②將其羧酸基團酯化，提高其脂溶性；③用廉價易得的卡比多巴取代丹酚酸A中的酚酸類結構片段；④用抗氧化能力更強的白藜蘆醇為結構單元取代丹酚酸A結構中的二苯乙烯片段[9-10]。通過1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)體外模型法對所合成的丹酚酸A類似物進行體外抗氧化活性的測定，為丹酚酸A類似物的研究提供合成思路和活性研究基礎。

1 材料和方法1.1 試劑與檢測

卡比多巴、白藜蘆醇及硼氫化鈉均購自阿拉丁試劑有限公司；DPPH購自百靈威試劑有限公司；其他有機溶劑均購自湖南匯虹試劑有限公司。除三氯氧磷在使用前進行重蒸外，其他試劑一般并未做進一步處理。1HNMR由湖南大學化學傳感國家重點實驗室檢測和提供。

1.2 白藜蘆醛的合成

將3.0 g白藜蘆醇加入三口燒瓶中，加入15 mL N,N-二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide，DMF)，磁力攪拌使其溶解。另加30 mL DMF于燒杯中，在通風櫥內緩慢滴入8 mL三氯氧磷(phosphorus oxychloride，POCl3)，小心攪拌，溶液由無色變成淡棕色。室溫下上述反應液放置于恒壓滴液漏斗中趁熱滴入三口燒瓶中，攪拌2～3 h直至整個溶液變成凝膠狀固體。冰浴下，將120 mL水逐滴加入三口燒瓶，必要時采用機械攪拌過夜。有大量黃色固體析出，產物收率92%。

1.3 卡比多巴的酯化

將4.0 g卡比多巴加入150 mL三口燒瓶中。加入50 mL甲醇溶液。通入干燥濃鹽酸并加熱攪拌，回流2.5～6.0 h。同時用薄層色譜(Thin Layer Chromatography，TLC)確定反應終點(水∶丙酮=1∶20)。反應結束后將液體倒進梨形燒瓶，減壓去除產物中的HCl氣體和溶劑，得到卡比多巴酯化粗產物。

1.4 丹酚酸A類似物a、b、c的合成

在燒瓶中加入500 mg白藜蘆醛和50 mL甲醇溶液，加入1 mL卡比多巴酯化產物，于65 ℃回流3 h。同時用監(jiān)測反應(乙酸乙酯∶石油醚=1∶3)。將溶劑蒸發(fā)后，硅膠柱純化產物(洗脫劑甲醇∶二氯甲烷=1∶30)，得到丹酚酸A類似物a、b、c。

產物a熔點：134～135 ℃，1HNMR(400 MHz,Methanol-d4)：δ8.50(s,1H),7.51-7.41(m,2H),7.31(d,J=16.0 Hz,1H),6.90(d,J=16.0 Hz,1H),6.82(dd,J=8.0 Hz,2H),6.71(d,J=8.0 Hz,1H),6.68-6.60(m,1H),6.57(d,J=2.4 Hz,1H),6.52(dd,J=8.0 Hz,1H),6.26(d,J=2.4 Hz,1H),3.72(d,J=2.4 Hz,3H),3.01(dd,J=16.0 Hz,2H),1.44(s,3H)，產物收率35.8%。

產物b熔點：134～136 ℃，1HNMR(400 MHz,Methanol-d4)：δ8.52(d,J=4.0 Hz,1H),7.51-7.42(m,2H),7.32(d,J=16.0 Hz,1H),6.91(d,J=16.0 Hz,1H),6.88-6.79(m,2H),6.74-6.69(m,1H),6.67(d,J=2.4 Hz,1H),6.58(d,J=2.4 Hz,1H),6.54(dd,J=8.0 Hz,1H),6.27(d,J=2.4 Hz,1H),4.18(q,J=8.0 Hz,2H),3.04-2.92(m,2H),1.44(s,3H),1.24(dd,J=8.0 Hz,3H)，產物收率18.0%。

產物c熔點：136～138 ℃，1HNMR(400 MHz,Methanol-d4)δ8.51(s,1H),7.50-7.42(m,2H),7.31(d,J=16.0 Hz,1H),6.90(d,J=16.0 Hz,1H),6.86-6.77(m,2H),6.71(d,J=8.0 Hz,1H),6.60-6.49(m,2H),6.25(d,J=2.4 Hz,1H),3.05-2.88(m,2H),1.42(s,3H),1.28-1.21(m,3H),1.18(d,J=8.0 Hz,3H)，產物收率13.8%。

1.5 丹酚酸A類似物d、e、f的合成

在燒瓶中加入甲醇20 mL和8.8 mg丹酚酸A類似物a～c，再加入約3倍的硼氫化鈉，攪拌大約20 min。加水20 mL并調節(jié)pH為微酸性(約為6)后用乙酸乙酯(30 mL×3)萃取。用無水硫酸鈉干燥,旋干所得液體。得到丹酚酸A類似物d、e、f。

產物d熔點：170～173 ℃，1HNMR(400 MHz,Methanol-d4)δ8.48(s,1H),7.45(d,J=8.0 Hz,2H),7.30(d,J=16.0 Hz,1H),6.89(d,J=16.0 Hz,1H),6.81(d,J=8.0 Hz,3H),6.24(s,1H),3.71(d,J=4.0 Hz,3H),2.98(dd,J=16.0 Hz,2H),1.44(d,J=12.0 Hz,3H)，產物收率92%。

產物e熔點：172～174 ℃，1HNMR(400 MHz,Methanol-d4)δ8.51(s,1H),7.46(d,J=8.0 Hz,2H),7.31(d,J=16.0 Hz,1H),6.90(d,J=16.0 Hz,1H),6.87-6.75(m,3H),6.75-6.62(m,2H),6.61-6.44(m,2H),6.25(d,J=2.4 Hz,1H),4.18(q,J=8.0 Hz,2H),3.35(p,J=2.4 Hz,3H),2.98(q,J=12.0 Hz,2H),1.43(s,3H)，產物收率89%。

產物f熔點：175～178 ℃，1HNMR(400 MHz,Methanol-d4)δ8.56(d,J=4.0 Hz,1H),7.51(d,J=8.0 Hz,2H),7.37(d,J=16.0 Hz,1H),6.96(d,J=16.0 Hz,1H),6.88(d,J=8.0 Hz,3H),6.75(dt,J=8.0 Hz,2H),6.6-6.53(m,3H),6.31(d,J=2.4 Hz,1H),4.19(q,J=8.0 Hz,1H),3.01(q,J=12.0 Hz,2H),2.10(d,J=4.0 Hz,1H),1.46(d,J=4.0 Hz,3H),1.29(d,J=8.0 Hz,3H),1.23(d,J=8.0 Hz,3H)，產物收率90%。

1.6 DPPH法測定抗氧化活性

DPPH儲備液的制備：稱取5 mg DPPH試劑，加少量的無水乙醇溶解，得到紫色液體，并且將其定量轉移至10 mL的容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度線；然后用移液管吸取2 mL試液置于100 mL容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度線，搖勻得到DPPH儲備液，放到4 ℃冰箱中冷藏備用。待測樣品的制備：稱取1 mg丹酚酸A類似物a～f，用少量的無水乙醇使其溶解，并定量轉移至10 mL容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度線。隨后用移液管在10 mL容量瓶中準確吸取1 mL試液置于100 mL容量瓶中，用無水乙醇定容，搖勻，得到待測樣品a。再用上述方法分別制得待測樣品b～f。對照品的制備：用移液管吸取4 mL DPPH標準液放入10 mL的容量瓶中，隨后加乙醇定容至刻度線。

1.7 DPPH清除率的測定

在10 mL容量瓶中，先加入4.0 mL的DPPH溶液，隨后加入4.0 mL的待測試液，再用無水乙醇定容至刻度線，搖勻。立即用待測液將1 cm比色皿潤洗，之后在517 nm波長處測其光密度值(OD1)，再在室溫避光保存30 min后測光密度值(OD2)。對照試驗為只加4.0 mL DPPH的乙醇溶液，測其光密度值(OD3)。同理，用上述方法分別測定其他待測樣品的光密度值(OD)。重復測定3次，取其平均值作為最后結果。將所測得的清除率與維生素C標準品的清除率比較。按下式計算自由基清除率K(%)=(實驗組OD1-實驗組OD2)/空白組OD3×100%。

2 結 果

2.1 丹酚酸A類似物的合成

丹酚酸A類似物的合成如圖1所示。在白藜蘆醇的結構中采用Vilsmeier-Haack反應引入醛基，再將卡比多巴的羧酸基團酯化。最后，將酯化產物與白藜蘆醛進行醛胺縮合即得丹酚酸A類似物a、b、c?？紤]到碳氮雙鍵有可能不穩(wěn)定，將碳氮雙鍵還原為碳氮單鍵，最終獲得丹酚酸A類似物d、e、f。

圖1 化合物a-f的合成路線

2.2 DPPH法測定丹酚酸A類似物的抗氧化活性

丹酚酸A類似物d、e、f均表現(xiàn)出了較強的抗氧化活性，而丹酚酸A類似物a、b、c抗氧化活性很差(圖2)，可能是由于在水中容易分解導致的。經過硼氫化鈉的還原后，碳氮雙鍵轉變?yōu)樘嫉獑捂I，提高了化合物的穩(wěn)定性，其抗氧化活性相差4倍以上。此外，丹酚酸A類似物d、e、f的抗氧化活性明顯強于對照品抗壞血酸以及丹酚酸A。

圖2 DPPH法測定丹酚酸A類似物的自由基清除率

3 討 論

丹酚酸A的結構可視為酚酸類化合物與二苯乙烯類化合物兩個結構單元的酯化反應產物。由于丹酚酸A的結構中具備不穩(wěn)定的酯鍵，在體內容易水解開環(huán)，而且由于其中含有羧酸基團，使得其分子的穿膜能力大大下降，使得其很難進入細胞內而發(fā)揮其藥理作用。如果采用酰肼鍵替代丹酚酸A中的酯鍵，可進一步穩(wěn)定其結構，此外若將其羧酸基團酯化，可提高其脂溶性，增加其穿膜能力，增強其藥效。丹酚酸A的結構中的二苯乙烯結構中為茋四酚結構，具有4個羥基，從而具備較好的清除自由基能力。但類似結構的白藜蘆醇具備茋三酚結構，其抗氧化能力更強。白藜蘆醇是一種天然多酚類物質，生理活性很多[11-13]，其抗氧化能力在多酚類中是較強的，可以用來預防冠心病，保護心血管[14-15]。研究表明，其抗氧化能力的重要基團是4′-羥基，使得其抗心血管氧化能力提升，類似的結構還有紫檀茋等，因此如果采用茋三酚的結構片段替代丹酚酸A結構片段中的茋四酚結構，有可能獲得更強抗氧化活性的丹酚酸A類似物[16]。

經過Vilsemier反應在其芳環(huán)上引入醛基，是目前在芳環(huán)上引入甲?；某Ｓ梅椒?。其反應機理為DMF與三氯氧磷反應，產生親電的N+，隨后N+進攻白藜蘆醇中含有兩個羥基的苯環(huán)的鄰位，即苯環(huán)上的2位碳，經水解、氧化得到目標產物白藜蘆醛。實驗采用DMF作溶劑的情況下，只需常溫就可以反應，不但產物收率較高，而且直接加水后產物析出呈現(xiàn)亮黃色，一般無需純化即可投入下一步使用。

卡比多巴的酯化過程需要在反應過程中通入濃鹽酸來催化反應，因為L-甲基多巴不溶于甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇，也有采用惰性溶劑中添加催化量的SOCl2等鹵化劑來催化反應，但實驗中發(fā)現(xiàn)添加SOCl2反應時間需要1～2天，反應時間長。本實驗中采用通入干燥的HCl氣體回流反應，3～5 h就可反應完全。

醛胺縮合反應可直接在醇溶液條件下加熱回流3 h。由于產物a、b、c的結構中碳氮雙鍵只連有一端芳香環(huán)，使得整個的N上負電共軛較差，從而導致縮合產物很容易水解，在柱層析時大部分會分解。在后續(xù)的實驗中，直接在反應后體系中加入硼氫化鈉進行還原，之后再進行柱層析，產物收率顯著提高。

綜上，本文所設計的丹酚酸A類似物d、e、f均具有很強的抗氧化活性，強于對照品抗壞血酸以及丹酚酸A。推測活性提升極有可能是由于采用了白藜蘆醇茋三酚的結構片段替代丹酚酸A結構片段中的茋四酚結構。這說明所設計的丹酚酸A類似物具備進一步研究和開發(fā)的潛力，為丹酚酸類化合物的結構設計與藥理作用提供基礎。