Apelin-13對肝細胞癌HepG2細胞增殖的影響

何寶鳳， 雷俊悅， 曾 奎， 陳雄英， 黃秋林

(南華大學附屬第一醫(yī)院胃腸外科，湖南省衡陽市 421001)

原發(fā)性肝癌是全球發(fā)病率第六位及癌癥相關死亡率第四位的癌癥[1]。Apelin在體內(nèi)分布廣泛，在右心房、左心室、腦、肺、肝和腎上腺中均可檢測到Apelin的表達，尤其在血管內(nèi)皮細胞中高表達[2]。Apelin可通過旁分泌的形式介導腫瘤新生血管的生成，Picault等[3]報道了Apelin信號通過激活自分泌參與結(jié)腸腺癌的生長。 Apelin家族包括多種亞型，焦谷氨酸修飾形式的Apelin-13是其中生物活性最強的一種。Apelin-13與部分腫瘤的生長侵襲轉(zhuǎn)移密切相關[4-5]。Apelin在肝癌中表達上調(diào)，以自分泌的形式通過PI3K/Akt通路促進肝癌的進展[6]。本研究以不同濃度Apelin-13處理肝細胞癌HepG2細胞不同時間，觀察其對HepG2細胞增殖的影響，以研究其在肝癌發(fā)展中的影響及作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

人肝癌細胞HepG2購自中科院上海細胞研究所；Aeplin-13購自Santa公司；抗-CyclinD1抗體、抗-Caspase-3抗體購自ABZOOM公司；MTT試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠試劑盒購自博士德生物科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

人肝癌HepG2細胞37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，顯微鏡下觀察到約90%細胞覆蓋培養(yǎng)板后，用胰酶消化并吹打成懸液。接種于96孔板中，約5×103/孔。待細胞覆蓋率約50%時，予細胞換液，加入不含10%FBS的培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)12 h備用。

1.3 細胞分組

根據(jù)本課題組前期的研究[7]，按不同濃度的Aeplin-13分為5組：10%FBS(對照組)、0.000 1、0.001、0.01、0.1 μmol/L組，處理時間為24 h；每組設3個復孔。再根據(jù)初步的實驗結(jié)果，選用差異最大的Apelin-13濃度(0.1 μmol/L)處理不同時間：0 h(對照組)、6、12、18、24 h組。具體方法：將上述處理后的各組細胞加入0.1 mL含10%FBS的培養(yǎng)基，24 h組加入0.1 μmol/L Apelin-13，開始計時，6 h后18 h組加入0.1 μmol/L Apelin-13，以此類推，對照組不加入Apelin-13，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.4 MTT檢測HepG2細胞增殖

細胞分組后，每個孔各加入20 μL 0.5%MTT(5 g/L)，培養(yǎng)箱內(nèi)放置4 h，然后吸取丟棄原培養(yǎng)液加入150 μL DMSO，振蕩10 min后在酶聯(lián)免疫檢測儀上測量各孔在490 nm處的吸光值。每組設5個復孔。

1.5 Western blot法檢測蛋白表達

各組細胞裂解30 min，4 ℃離心8 min(12 000 r/min)，收集上清液。采用BCA試劑盒進行HepG2細胞蛋白定量，將蛋白量調(diào)制等量后，加入上樣緩沖液，加熱至99 ℃ 10 min，冷卻至4 ℃ 4 min，然后置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。將制備好?.0 mm厚度的10%SDS-PAGE凝膠置于電泳緩沖液中上樣(每孔20 μL蛋白樣品)，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜后使用5%封閉液封閉2 h。封閉結(jié)束后，加入稀釋號的一抗孵育過夜(抗體效價為1∶250)，TBST洗膜3次，10 min/次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(抗體效價為1∶1 000)，搖床上孵育60 min，TBST洗膜3次，10 min/次。將增強劑、穩(wěn)定劑、背景抑制劑按照20∶20∶1的比例混合，加至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，孵育5 min后顯影。Mias圖像分析系統(tǒng)測定各條帶灰度值,與β微管蛋白(β-Tubulin)條帶光密度值之比反映蛋白的表達。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度Apelin-13在不同時間對HepG2細胞增殖的影響

與對照組比較，0.000 1、0.001、0.01、0.1 μmol/L組的OD值增加(P<0.05；圖1)，且OD值隨著Apelin-13濃度增加而增加，Apelin-13呈濃度依賴性促進細胞增殖。用0.1 μmol/L Apelin-13處理HepG2細胞不同時間后，OD值隨著Apelin-13處理時間的增加而增加(P<0.05；圖2)，Apelin-13呈時間依賴性促進細胞增殖。

圖1 不同濃度Apelin-13對HepG2細胞增殖的影響

圖2 0.1 μmol/L的Apelin-13處理不同時間對HepG2細胞增殖的影響

2.2 不同濃度Apelin-13及不同時間對HepG2細胞中CyclinD1表達的影響

與對照組比較，0.000 1、0.001、0.01、0.1 μmol/L組的CyclinD1表達升高，且隨濃度升高呈遞增趨勢(P<0.05；圖3)。用0.1 μmol/L的Apelin-13處理HepG2細胞不同時間后，CyclinD1表達隨Apelin-13處理時間延長呈遞增趨勢(P<0.05；圖4)。

圖3 不同濃度Apelin-13對HepG2細胞中CyclinD1表達的影響

圖4 0.1 μmol/L Apelin-13處理不同時間對HepG2細胞中CyclinD1表達的影響

2.3 不同濃度Apelin-13及不同時間對HepG2細胞中Caspase-3表達的影響

與對照組比較，0.000 1、0.001、0.01、0.1 μmol/L組的Caspase-3表達降低，且Caspase-3表達隨濃度的增高而降低(P<0.05；圖5)。用0.1 μmol/L Apelin-13處理HepG2細胞不同時間后，Caspase-3的表達隨處理時間延長而降低(P<0.05；圖6)。

圖5 不同濃度Apelin-13對HepG2細胞中Caspase-3表達的影響

圖6 0.1 μmol/L Apelin-13處理不同時間對HepG2細胞中Caspase-3表達的影響

3 討 論

Apelin是從牛胃分泌物中提取的孤兒G蛋白偶聯(lián)受體的天然配體。Apelin/APJ在體內(nèi)分布廣泛，作為血管活性肽的Apelin以內(nèi)分泌、旁/自分泌等方式在調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)方面的生物學效應成為了研究熱點[8]。Apelin-13作為具有最高的生物學活性的Apelin亞型，參與了多種重要的生物學過程。Peng等[5]發(fā)現(xiàn)Apelin-13可通過ERK1/2/AIB1信號通路促進乳腺癌MCF-7細胞增殖和侵襲。Apelin-13能促進肺腺癌細胞增殖，同時通過PAK1-cofilin磷酸化機制介導了Apelin-13促進肺腺癌細胞遷移[4]。

筆者通過體外培養(yǎng)肝癌HepG2細胞，研究不同濃度及不同作用時間的Apelin-13對HepG2細胞增殖的影響。結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)隨著Apelin-13濃度增加和處理時間的延長，HepG2細胞增殖能力增加，證實外源性Apelin-13可促進HepG2細胞增殖，這與Chen等[9]在結(jié)腸癌中Apelin-13對結(jié)腸癌細胞作用結(jié)果一致。同時本文利用Western blot檢測Apelin-13作用下HepG2細胞增殖相關蛋白CyclinD1的表達水平。細胞在正常生理狀態(tài)下由G1期進入S期后，細胞內(nèi)的CyclinD1會迅速分解，一旦CyclinD1持續(xù)高表達，就會使細胞的G1期縮短，使細胞周期變化，提前進入S期，導致細胞增殖失控，這也是腫瘤的發(fā)生機制之一。本研究結(jié)果顯示，隨著Apelin-13濃度升高和作用時間延長，CyclinD1表達也隨之增高。Caspase-3是包括凋亡在內(nèi)的多種生物學過程中的關鍵酶。本研究結(jié)果顯示，隨著Apelin-13濃度的增高和處理時間的延長，Caspase-3的表達也隨之降低，提示Apelin-13可呈濃度和時間依賴性抑制HepG2細胞Caspase-3的表達，從蛋白水平進一步證實其能抑制HepG2細胞凋亡。有研究表明，Caspase-3在肝癌組織中表達增高，并與肝癌細胞凋亡有關[10]。結(jié)合本研究結(jié)果，Apelin-13可能通過抑制肝癌細胞的凋亡而促進腫瘤進展。Lu等[11]發(fā)現(xiàn)Apelin-13可通過相應的機制來促進視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞的增殖，并能抑制其凋亡。前期研究發(fā)現(xiàn)Apelin-13可通過激活ERK1/2信號通路，上調(diào)HepG2細胞Beclin1的表達促進細胞自噬[7]，該機制是否與增殖和凋亡有關有待進一步證實。

本實驗研究表明，Apelin-13是參與肝癌細胞增殖的新分子，且可抑制Caspase-3蛋白的表達，對探尋肝癌發(fā)生發(fā)展機制具有重要意義，有望成為肝癌一個新的分子治療靶點。