高特異性心肌肌鈣蛋白I適配體的ePCR技術(shù)篩選及其表征

岑 怡， 王仲萍， 柯培雄， 袁中文， 劉曉敏， 嚴(yán)鵬科

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院藥學(xué)部，廣東省廣州市510150； 2.廣州同鵬中旭醫(yī)藥科技有限公司，廣東省廣州市510000；3.廣州醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)系，廣東省廣州市511436)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的基礎(chǔ)上因斑塊破裂阻塞引起局部缺血而導(dǎo)致的心肌壞死，是全世界范圍內(nèi)死亡率最高的疾病之一[1]。目前，心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)因僅在心肌中產(chǎn)生，并且對(duì)心臟損傷顯示出高度特異性而成為了診斷AMI的金標(biāo)準(zhǔn)[2]。

適配體是一種單鏈DNA或RNA，因與靶標(biāo)物質(zhì)的親和力高且特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，正被廣泛用于疾病的診斷和治療研究中[3]。PCR作為一種體外擴(kuò)增DNA技術(shù)，已廣泛用于多種研究領(lǐng)域[4]。但普通PCR易使DNA模板污染且容易產(chǎn)生非特異性片段，因此需要建立一種乳液PCR(emulsion PCR,ePCR)以改善普通PCR的不足。目前臨床上檢測(cè)cTnI多依賴于抗體技術(shù)，但床旁檢測(cè)對(duì)時(shí)效性和精密度要求較高，而抗體在制備過(guò)程中容易產(chǎn)生批間差異導(dǎo)致檢測(cè)精密度降低。多克隆抗體容易產(chǎn)生非特異性，單克隆抗體又容易丟失結(jié)合靶位，因此希望通過(guò)適配體技術(shù)以彌補(bǔ)抗體在臨床檢測(cè)上的不足并提高檢測(cè)水平。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)基于ePCR的指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)，從隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)中篩選出與cTnI特異性結(jié)合的核酸適配體。對(duì)篩選得到的適配體進(jìn)行親和力檢測(cè)并與市售的cTnI抗體進(jìn)行比較，以期取代傳統(tǒng)的抗體檢測(cè)技術(shù)，為AMI的早期診斷提供一種新的手段。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

96 bp核酸序列及其引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；cTnI、心肌肌鈣蛋白C(cTnC)、心肌肌鈣蛋白T(cTnT)、人血清蛋白(HSA)(武漢云克隆公司)；鏈酶親和素磁珠(美國(guó)Promega公司)；DNA純化試劑盒(Plus DNA Clean/Extraction Kit DP034P)；96孔酶標(biāo)板(美國(guó)康寧公司)；肌鈣蛋白I抗體(重慶探生科技有限公司)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；TMB顯色液、ELISA終止液(北京索萊寶公司)；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。恒溫水浴箱(上海一恒科技有限公司)；PCR儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；垂直凝膠電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek公司)。

1.2 SELEX篩選過(guò)程

以cTnI為正篩蛋白，HSA為反篩蛋白，采用生物素-親和素系統(tǒng)將長(zhǎng)度為96 bp的隨機(jī)ssDNA(700 pmol)固定在磁珠上，然后加入250 μg cTnI與磁珠混合后于37 ℃恒溫水浴箱中振蕩孵育1 h；能與蛋白結(jié)合的DNA會(huì)被拖拽至溶液中，不與蛋白結(jié)合的DNA仍吸附在磁珠上。將正篩(或反篩)后留下的DNA用酚氯仿法提取后進(jìn)行ePCR擴(kuò)增，純化后ePCR產(chǎn)物與鏈酶親和素磁珠在37 ℃中孵育30 min，PBS洗滌3次后加入300 μL 100 mmol/L NaCl和50 mmol/L NaOH混合溶液，使雙鏈DNA變性解鏈獲得單鏈DNA后再進(jìn)行下一輪篩選，直到第9輪正/反篩后得到了與cTnI特異性結(jié)合的富集ssDNA[5]。SELEX篩選過(guò)程如圖1所示。

圖1 SELEX篩選過(guò)程流程圖

1.3 ePCR條件優(yōu)化

油相部分：礦物油5 mL，Span80 450 μL，Tween80 40 μL，TritonX-100 5 μL后加礦物油至10 mL，旋渦混勻。水相部分：2×TaqMix 500 μL，上游引物(5′-CGT ACG GTC GAC GCT AGC-3′)和下游引物(5′-Biotin-GGA TCC GAG CTC CAC GTG-3′)各20 μL，加純化水440 μL。取20 μL 1 μmol/L模板DNA加到水相中后緩慢滴入油相(水相∶油相為1∶2)，直至油相和水相混合成白色乳液狀后再進(jìn)行擴(kuò)增。普通PCR則無(wú)油相，僅將上述水相部分配制成反應(yīng)混合液后進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：在變性94 ℃，退火70/72 ℃，延伸70 ℃，總延伸時(shí)間為15 min的條件下，做25/30個(gè)循環(huán)。每輪對(duì)退火溫度和循環(huán)輪數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，用10%變性聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，直至擴(kuò)增條帶清晰單一，無(wú)非特異性擴(kuò)增為止。

1.4 ePCR產(chǎn)物的純化和克隆測(cè)序

將ePCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物9 000 r/min離心10 min，除去上層油相；加入2倍體積的乙醚混勻后9 000 r/min離心1 min(重復(fù)3次)，然后用2.5倍體積的無(wú)水乙醇和1/10體積的3 mol/L醋酸鈉沉淀DNA。使用DNA純化回收試劑盒沉淀得到的DNA進(jìn)行純化后測(cè)定其含量，短期內(nèi)4 ℃保存。

由深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行克隆與測(cè)序。

1.5 ELONA法測(cè)定適配體親和力

以市售抗體為陽(yáng)性對(duì)照，包被液(pH9.6 0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液)稀釋cTnI至5 mg/L，于96孔酶標(biāo)板100 μL/孔4 ℃孵育過(guò)夜；次日棄去孔內(nèi)液體，用封閉液(3%BSA)室溫封閉1 h，然后棄封閉液，用洗滌液(0.01%TBST)洗板3次；加入梯度濃度生物素標(biāo)記的適配體100 μL，37 ℃溫育1 h后洗滌3次；每孔加100 μL辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(1∶10 000)37 ℃溫育30 min后洗板5次；每孔加100 μL TMB顯色液避光反應(yīng)15 min后加入50 μL終止液終止反應(yīng)，在10 min內(nèi)采用全波長(zhǎng)熒光酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處光密度值。

1.6 ELONA法測(cè)定適配體特異性和敏感性

以市售抗體為陽(yáng)性對(duì)照，分別于96孔板中加入低(1 mg/L)、中(2 mg/L)、高(4 mg/L)3種質(zhì)量濃度的cTnI/cTnC/cTnT/HSA各100 μL，4 ℃孵育過(guò)夜；于96孔板中加入等量低(1 mg/L)、高(4 mg/L)質(zhì)量濃度的cTnI+cTnC/cTnT/HSA 100 μL混合溶液，4 ℃孵育過(guò)夜。第2天加100 μL 50 nmol/L適配體進(jìn)行結(jié)合孵育，其余操作步驟同1.5方法。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 SELEX篩選及ePCR條件的優(yōu)化

采用磁珠SELEX法將修飾生物素的DNA序列固定在鏈霉親和素磁珠上，加入的蛋白可將與之結(jié)合的DNA從磁珠上拉至溶液中，然后將DNA從溶液中分離出來(lái)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增獲得特異性產(chǎn)物是適配體篩選成功的關(guān)鍵，本實(shí)驗(yàn)采用的ePCR是PCR的一種新型變體，將每個(gè)寡核苷酸序列封裝到由疏水有機(jī)相包圍的單個(gè)PCR微滴中，可顯著降低PCR偏差并減少非特異性。實(shí)驗(yàn)中對(duì)每輪PCR擴(kuò)增的退火溫度、循環(huán)次數(shù)、模板量都進(jìn)行優(yōu)化，并用10%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳驗(yàn)證。如圖2所示，采用ePCR進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，當(dāng)變性溫度94 ℃，退火溫度70 ℃，延伸溫度70 ℃，總延伸時(shí)間為15 min時(shí)，做25個(gè)循環(huán)，條帶單一且無(wú)非特異性條帶；而普通PCR在同等條件下均出現(xiàn)了不同程度非特異性條帶。將PCR產(chǎn)物與標(biāo)記鏈霉親和素的磁珠結(jié)合后用NaOH裂解能得到穩(wěn)定的單鏈DNA次級(jí)文庫(kù)。隨著篩選輪數(shù)的增加，得到具有高特異性且有較強(qiáng)親和力的cTnI適配體。

圖2 PAGE觀察PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化

2.2 適配體親和力檢測(cè)

經(jīng)9輪SELEX篩選后再測(cè)序得到的適配體序列和對(duì)應(yīng)解離平衡常數(shù)見表1。解離常數(shù)Kd值越小，則代表親和力越高。結(jié)果顯示，篩選得到的3個(gè)適配體均對(duì)cTnI的親和力強(qiáng)度達(dá)到納摩爾級(jí)別。其中，Apt-1與其他適配體相比親和力最高[Kd為(2.04±0.11) nmol/L]，且優(yōu)于市售的抗體[Kd為(3.19±0.53) nmol/L]。Apt-1的量效曲線見圖3，用Mfold軟件對(duì)其進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)模擬分析結(jié)果見圖4。

表1 適配體序列及其與cTnI親和力

圖3 適配體Apt-1的量效曲線圖

圖4 適配體Apt-1二級(jí)結(jié)構(gòu)模擬圖

2.3 適配體特異性和敏感性檢測(cè)

在特異性考察中，以市售cTnI抗體(Ab)為陽(yáng)性對(duì)照，分別檢測(cè)適配體對(duì)低、中、高3種質(zhì)量濃度cTnI/cTnC/cTnT/HSA的結(jié)合能力，通過(guò)方差分析發(fā)現(xiàn)Apt-1僅對(duì)cTnI有特異性，與其他相關(guān)蛋白沒(méi)有結(jié)合(P<0.05；圖5A)。于低、高兩種質(zhì)量濃度的cTnI中加入等量的cTnC/cTnT/HSA制備混合溶液進(jìn)行檢測(cè)干擾，同樣發(fā)現(xiàn)相關(guān)物質(zhì)的加入并不影響Apt-1對(duì)cTnI的特異性識(shí)別(圖5B)。在相同質(zhì)量濃度下，Apt-1檢測(cè)cTnI的光密度值較市售抗體高，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)室篩選得到的適配體敏感性更高(圖5)。

圖5 適配體Apt-1與不同質(zhì)量濃度cTnI的特異性和敏感性比較

3 討 論

通過(guò)SELEX篩選技術(shù)得到的幾乎所有適配體均顯示對(duì)目標(biāo)分子的高親和力，其解離常數(shù)(Kd)在微摩爾至納摩爾范圍內(nèi)，因此適配體也有“化學(xué)抗體”之稱。到目前為止，已有數(shù)個(gè)適配體正參與臨床試驗(yàn)。輝瑞公司的哌加他尼鈉注射液(商品名Macugen)作為抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的RNA適配體已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療年齡相關(guān)的黃斑退化病，從而預(yù)防新血管生成[6]。除臨床治療外，適配體還用于許多其他應(yīng)用，例如檢測(cè)COVID-19病毒和細(xì)菌感染，檢測(cè)癌癥生物標(biāo)志物，檢測(cè)環(huán)境污染檢測(cè)和在生物傳感器上應(yīng)用[7-11]。SELEX篩選技術(shù)首次應(yīng)用以來(lái)至今已經(jīng)歷了無(wú)數(shù)的變化和改進(jìn)，其中改進(jìn)對(duì)每輪篩選得到的DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增的方法也是一個(gè)重要環(huán)節(jié)[3]。由于初始文庫(kù)中的每個(gè)序列具有不同的結(jié)構(gòu)特性，因此它們對(duì)DNA聚合酶、引物和PCR條件的適應(yīng)性可能會(huì)大不相同[12]。這導(dǎo)致了PCR副產(chǎn)物的產(chǎn)生并傾向于篩選出適應(yīng)該P(yáng)CR條件的適配體而不是與靶分子最具高親和力的適配體。本實(shí)驗(yàn)采用的ePCR將DNA序列包裹在有機(jī)相中形成一個(gè)個(gè)乳滴，構(gòu)成了數(shù)目龐大的獨(dú)立PCR反應(yīng)空間，使得DNA在擴(kuò)增過(guò)程中相對(duì)獨(dú)立而不被干擾。該方法的優(yōu)勢(shì)在于減少了非特異性產(chǎn)物的生成，產(chǎn)物量比普通PCR多，同時(shí)解決了普通PCR優(yōu)先擴(kuò)增短鏈DNA片段的問(wèn)題。這為篩選出高親和力和高特異性的適配體提供了極大優(yōu)勢(shì)。

目前臨床上多采用基于抗原抗體反應(yīng)設(shè)計(jì)的檢測(cè)試劑盒進(jìn)行cTnI的測(cè)定，但抗體在生產(chǎn)過(guò)程中難免產(chǎn)生批間差異，從而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不一致[13]。此外，抗原在不同個(gè)體中的免疫原性不同，導(dǎo)致在臨床檢測(cè)中擁有同樣表達(dá)水平的病人檢測(cè)結(jié)果不同。適配體作為一小段核苷酸序列，可以穩(wěn)定合成且不產(chǎn)生免疫原性。同時(shí)，適配體生產(chǎn)周期短，可在兩個(gè)月甚至兩周內(nèi)就可篩選出針對(duì)不同分子的特異性適配體；其制備原材料成本也比抗體更低，在經(jīng)濟(jì)學(xué)上更具時(shí)間成本效益。在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)ELONA法測(cè)定了適配體的親和力，最終得到了Kd值最小的適配體Apt-1。Kd值越小證明其親和力越高，代表著當(dāng)適配體質(zhì)量濃度較低時(shí)也能與靶分子形成穩(wěn)定復(fù)合物。將Apt-1與市售抗體相比，發(fā)現(xiàn)該適配體的親和力更強(qiáng)。進(jìn)一步測(cè)定適配體Apt-1的特異性和敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該適配體對(duì)cTnI具有極高的特異性，未發(fā)現(xiàn)與其他相關(guān)蛋白有非特異性結(jié)合；在檢測(cè)相同質(zhì)量濃度cTnI時(shí)，適配體的光密度值較抗體大，可認(rèn)為該適配體對(duì)靶蛋白的敏感性更強(qiáng)。故本實(shí)驗(yàn)中篩選出來(lái)的適配體能有效應(yīng)用于樣本中cTnI的檢測(cè)。以上結(jié)果均表明適配體在取代傳統(tǒng)抗體成為一種新的診斷AMI技術(shù)中具有極大優(yōu)勢(shì)。

如今，適配體作為傳統(tǒng)抗體的核酸類似物，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中扮演著重要的角色。適配體的潛在價(jià)值不可忽視，隨著相關(guān)研究的不斷深入，將會(huì)有更多的適配體問(wèn)世，未來(lái)必定在基礎(chǔ)研究和臨床診斷治療中擁有廣泛的應(yīng)用。