缺氧通過HIF-1α/PCSK9信號途徑誘導神經(jīng)細胞凋亡

劉錄山， 鄧懿銘， 李 清

(1.南華大學心血管疾病研究所 動脈硬化學湖南省重點實驗室 湖南省動脈硬化性疾病國際科技合作與創(chuàng)新聯(lián)合實驗室，湖南省衡陽市 421001；2.湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學院病理學教研室，湖南省衡陽市 421001)

缺血缺氧性腦損傷通常由腦組織出現(xiàn)急性或慢性的局部或完全缺氧所導致，臨床上以新生兒窒息引起的腦損傷多見[1]，是引起神經(jīng)系統(tǒng)損傷的主要原因，在此過程中神經(jīng)細胞凋亡起著重要角色[2]。

缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor,HIF-1α)是一類真核細胞轉(zhuǎn)錄因子，在細胞處于低氧狀態(tài)時其表達水平升高以應激性地對抗內(nèi)環(huán)境改變[3-4]。研究表明前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)與神經(jīng)細胞凋亡存在相關(guān)性[5]。本課題研究缺氧是否通過調(diào)節(jié)HIF-1α表達上調(diào)PCSK9水平引起神經(jīng)細胞凋亡，旨在為缺血缺氧性損傷的防治提供潛在的治療靶點。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

PC12細胞購自中科院上海細胞庫；氯化鈷(CoCl2)購于美國西格瑪公司；DMEM培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司；ECL化學發(fā)光檢測試劑盒購自湖南艾佳生物科技公司；胎牛血清購自天津市灝洋生物制品公司；Hoechst 33258染色劑購自江蘇碧云天生物有限公司；PCSK9、HIF-1α、Caspase-3、Caspase-9、β-actin兔抗人多克隆抗體均購自Proteintech公司；Lip 2000轉(zhuǎn)染試劑、臺盼藍染色液購自北京索萊寶公司；缺氧誘導因子抑制劑利非西呱(YC-1)、缺氧誘導因子激動劑二甲基乙二酰基甘氨酸(DMOG)購自美國Selleck公司；PCSK9小干擾RNA(PCSK9 small interfering RNA,PCSK9 siRNA)購自吉凱基因。倒置光學顯微鏡購自日本Olympus公司；倒置熒光顯微鏡購自日本尼康公司；化學發(fā)光成像系統(tǒng)購自上海天能公司；凝膠電泳系統(tǒng)購自美國BIO-RAD公司；Aria Ⅱ流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組

PC12細胞于含有10%胎牛血清及1%青/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。2～3天定期更換培養(yǎng)基，融合度70%～80%進行傳代。使用不同濃度CoCl2(0、125、250、500 μmol/L)孵育PC12細胞24 h并觀察CoCl2對PC12細胞的影響；使用不同濃度DMOG(0、250、500、1 000 μmol/L)與250 μmol/L CoCl2共孵育PC12細胞24 h并觀察DMOG對PC12細胞的影響；使用不同濃度YC-1(0、1、10、50 μmol/L)與250 μmol/L CoCl2共孵育PC12細胞24 h并觀察YC-1對PC12細胞的影響。細胞轉(zhuǎn)染實驗中，無義RNA組為siCtrl+250 μmol/L CoCl2，PCSK9 siRNA組為siPCSK9+250 μmol/L CoCl2。

1.3 蛋白印跡分析

對各個分組中的PC12細胞分別進行處理后提取總蛋白，在培養(yǎng)瓶中加入RIPA裂解液充分作用，采用BCA法進行蛋白含量測定，取含有30 μg蛋白的樣本進行蛋白印跡法檢測，電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫下作用2 h，4 ℃孵育1∶1 000稀釋的PCSK9、HIF-1α、Caspase-3、Caspase-9一抗或1∶5 000稀釋的β-actin一抗過夜，洗膜3次后室溫孵育1∶2 000稀釋的二抗1 h，ECL化學發(fā)光法得到條帶并計算蛋白相對表達水平。

1.4 Hoechst 33258核染色檢測細胞凋亡

PC12細胞分別進行處理后，以1×PBS潤洗細胞3次，4%多聚甲醛固定30 min，蒸餾水潤洗3次，10 min/次，每孔加入Hoechst 33258染液于避光條件下作用25 min，蒸餾水潤洗3次，10 min/次。甘油封片，于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 Annexin V-FITC/PI染色

處理各組PC12細胞后，0.25%的胰酶1 mL消化適度后終止，吹打混勻后離心1 000 r/min 10 min，收集細胞并以1×Binding Buffer重懸，離心2 000 r/min 5 min，洗滌。1×Binding Buffer再次重懸，離心2 000 r/min 5 min后再次加入緩沖液重懸混勻后繼續(xù)加5 μL Annexin V-FITC進行染色，于常溫下孵育15 min后再補入5 μL PI與200 μL緩沖液后使用流式細胞儀進行檢測并計數(shù)。

1.6 細胞轉(zhuǎn)染

PC12細胞接種于24孔板中待融合度達30%～50%后轉(zhuǎn)染，通過脂質(zhì)體Lip2000使無義siRNA與PCSK9 siRNA分別轉(zhuǎn)染PC12細胞，并分別標記為無義RNA組與PCSK9 siRNA組，37 ℃培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染48 h后檢測轉(zhuǎn)染效率。PCSK9 siRNA正義鏈為5′-GGAGGAUAGCCUGGUUGAUdTdT-3′，反義鏈為3′-d Td TCCUCCUAUCGGACCAACUA-5′；陰性對照siRNA由吉凱基因公司提供。

1.7 統(tǒng)計分析

2 結(jié) 果

2.1 CoCl2對PC12細胞中HIF-1α和PCSK9表達的影響

與0 μmol/L CoCl2組比較，其他CoCl2處理組HIF-1α和PCSK9表達升高且隨CoCl2濃度的增加呈遞增趨勢(圖1)。用250 μmol/L CoCl2處理PC12細胞0、6、12、24 h，隨著處理時間延長，HIF-1α和PCSK9表達呈遞增趨勢(圖1)。

圖1 不同濃度或不同時間CoCl2處理PC12細胞對HIF-1α及PCSK9表達影響

2.2 CoCl2呈濃度依賴性促進PC12細胞的凋亡

結(jié)果顯示隨著CoCl2濃度的增高，與核染劑Hoechst33258結(jié)合而呈致密濃染或呈碎塊狀致密濃染區(qū)域逐漸增多；流式細胞術(shù)檢測顯示凋亡率也隨之遞增(圖2)。

圖2 CoCl2呈濃度依賴性促進PC12細胞的凋亡

2.3 DMOG對PC12細胞HIF-1α、PCSK9表達以及凋亡的影響

各濃度組DMOG均能在CoCl2誘導的低氧狀態(tài)下上調(diào)PC12細胞中HIF-1α、PCSK9的表達并下調(diào)Caspase-3、Caspase-9的表達(圖3)。Hoechst33258染色結(jié)果及流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，DMOG呈濃度依賴性抑制CoCl2導致的PC12凋亡(圖4)。

圖3 DMOG對PC12細胞HIF-1α和PCSK9表達以及凋亡的影響

圖4 DMOG呈濃度依賴性降低PC12細胞凋亡水平

2.4 YC-1對PC12細胞PCSK9、HIF-1α表達以及PC12細胞凋亡的影響

各濃度組YC-1均能在CoCl2誘導的低氧狀態(tài)下下調(diào)PC12細胞中PCSK9、HIF-1α的表達并上調(diào)Caspase-3、Caspase-9的表達且表現(xiàn)出濃度依賴性(圖5)。Hoechst33258染色結(jié)果及流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，YC-1呈濃度依賴性促進PC12凋亡(圖6)。

圖5 不同濃度HIF-1α抑制劑YC-1對PC12細胞HIF-1α、PCSK9及凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

圖6 YC-1呈濃度依賴性增加PC12細胞凋亡水平

2.5 PCSK9 siRNA轉(zhuǎn)染結(jié)果鑒定

與空白組及無義RNA組比較，siPCSK9組基因表達顯著下調(diào)，證明轉(zhuǎn)染效率較高，轉(zhuǎn)染成功(圖7)。

圖7 PCSK9 siRNA有效降低了PC12細胞中PCSK9表達(n=3)

2.6 PCSK9 siRNA轉(zhuǎn)染對PC12細胞凋亡的影響

為進一步探究PCSK9在CoCl2誘導的PC12細胞凋亡中的作用，進行如下分組：空白對照組；250 μmol/L CoCl2組；250 μmol/L CoCl2+無義RNA組；250 μmol/L CoCl2+PCSK9 siRNA組。Western blot檢測顯示，與無義RNA組比較，250 μmol/L CoCl2+PCSK9 siRNA組PCSK9表達降低且Caspase-3、Caspase-9表達均減少(圖8)。Hoechst33258熒光染色及流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，干擾PCSK9表達可降低CoCl2導致的PC12凋亡(圖9)。

圖8 PCSK9 siRNA對CoCl2誘導的PC12細胞中PCSK9及凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

圖9 PCSK9 siRNA下調(diào)PC12細胞凋亡水平

3 討 論

心腦血管疾病等慢性病引起的慢性缺血缺氧仍是目前一大難題。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)oxLDL促使PC12細胞凋亡是PCSK9通過Bcl-2/Bax-Caspase-9/3信號通路所誘導[6]，提示PCSK9具有促神經(jīng)細胞凋亡的作用。

HIF-1是一類細胞缺氧相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，細胞低氧應激下其表達上調(diào)可激活多條相關(guān)通路，但其在缺氧損傷中的作用及機制仍具有爭議性[7-8]，細胞種屬特異性及濃度相關(guān)的雙向性調(diào)節(jié)可能是其原因。

缺血缺氧性腦損傷發(fā)病機制復雜，氧化應激、谷氨酸興奮性神經(jīng)毒性、炎癥、鈣超載等都是其中可能的分子機制，而神經(jīng)細胞凋亡或壞死是其最終結(jié)果[9]。細胞凋亡是一種多基因嚴格控制的細胞自主性、有序性的死亡，正常水平的凋亡在調(diào)節(jié)細胞周期、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)及個體發(fā)育中有著重要意義，而既往神經(jīng)學研究顯示神經(jīng)細胞的加速凋亡是神經(jīng)退行性變的重要原因。研究表明缺氧使神經(jīng)細胞凋亡增加[10]，且缺氧能使神經(jīng)細胞HIF-1α表達增加[8]。本研究中選用CoCl2作為細胞缺氧模擬劑對PC12進行缺氧干預[11]，進一步通過分級干預探究PCSK9與HIF-1α在神經(jīng)細胞凋亡中的作用機制。結(jié)果表明：CoCl2處理下PC12細胞中PCSK9、HIF-1α以及細胞凋亡水平較對照組升高，PCSK9 siRNA轉(zhuǎn)染后，CoCl2處理下PC12細胞凋亡水平較轉(zhuǎn)染對照組下降，表明低氧狀態(tài)下PC12細胞凋亡水平升高，而HIF-1α介導的PCSK9表達上調(diào)是其潛在的分子機制。

綜上所述，CoCl2誘導的細胞缺氧狀態(tài)能上調(diào)PC12細胞凋亡水平，HIF-1α介導的PCSK9表達上調(diào)是其潛在分子機制。這為缺血缺氧性腦損傷的防治提供了分子生物學依據(jù)，為缺血缺氧性腦損傷的靶向防治提供更多思路。