土荊芥精油對小菜蛾幼蟲表皮的滲透促進作用

趙建偉，陳藝欣，林 碩，陳 勇，田厚軍

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所/福建省作物有害生物監(jiān)測與治理重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部福州作物有害生物科學(xué)觀測實驗站/國家農(nóng)業(yè)生物安全科學(xué)中心華東分中心，福建 福州 350013）

0 引言

【研究意義】土荊芥Chenopodium ambrosiodesL.，黎科黎屬，又稱臭草、殺蟲芥，是一種一年生或多年生的芳香性草本入侵植物，莖葉和果實都有強烈氣味，原產(chǎn)美洲熱帶，極易擴散于農(nóng)田中，廣泛分布于世界熱帶及溫帶地區(qū)[1-3]。我國主要分布于福建、江西、浙江、江蘇、臺灣、廣東、廣西等省[4]。土荊芥作為一種入侵雜草，資源豐富，而土荊芥精油本身對害蟲具有趨避、毒殺作用[5]，對病原菌有抑制作用[6]，還可作為化感物質(zhì)影響細胞生長[7]，因此，如何將土荊芥變廢為寶，發(fā)揮其在病蟲害防治方面的作用具有重要的研究意義?！厩叭搜芯窟M展】有關(guān)土荊芥精油化學(xué)成分及生物活性[8-12]等方面已有一些研究報道。植物精油作為重要的殺蟲劑增效劑，其藥效一方面取決于它的毒性大小及有機體對他的解毒能力，另一方面則取決于穿透生物體表的難易[13]。昆蟲對殺蟲劑產(chǎn)生抗性一個重要原因就是農(nóng)藥對昆蟲表皮滲透率降低，而植物精油則是改變昆蟲表皮滲透率，從而影響其生長發(fā)育，相關(guān)研究已在家蠅（Musca domesticaL.）[14]、灰茶尺蠖（Ectropis GrisescensWarren）[15]、斜紋夜蛾（Spodoptera lituraFabricius）[16]、菜青蟲（Pieris rapae）[5]、棉鈴蟲（Helicoverpa armigeraHübner）[17]等多種昆蟲中報道。土荊芥精油的殺蟲活性還表現(xiàn)對幼蟲體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶呈明顯的抑制作用，對羧酸酯酶呈激活后抑制的作用[18]。小菜蛾（Plutella xylostellaL.）屬于鱗翅目菜蛾科，是世界上分布最廣、對十字花科蔬菜危害最嚴(yán)重的蔬菜害蟲。由于過度依賴化學(xué)藥劑防治，小菜蛾對多種殺蟲劑產(chǎn)生了嚴(yán)重抗藥性[19,20]。全世界用于小菜蛾的防控成本以及小菜蛾對蔬菜造成的損失已超過50 億美元[21]。目前土荊芥精油對小菜蛾幼蟲表皮的滲透作用以及對化學(xué)藥劑作用于昆蟲表皮的滲透效果尚不清楚。【本研究切入點】通過研究土荊芥精油對小菜蛾表皮滲透促進作用，可以更深入地了解土荊芥精油對殺蟲劑的滲透促進作用機理，并尋找小菜蛾表皮靶標(biāo)作用位點的有效藥劑，達到藥劑減量高效殺蟲的目的?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用掃描電鏡觀察土荊芥精油對小菜蛾表皮超微結(jié)構(gòu)的變化，以揭示其促滲機理；并利用氣質(zhì)聯(lián)用儀測定了土荊芥精油對殺蟲劑透皮吸收量的變化，為合理開發(fā)利用雜草資源及植物精油促進害蟲持續(xù)控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土荊芥精油

土荊芥Chenopodium ambrosiodesL.采自福建省福州市新店鎮(zhèn)埔垱村福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所實驗田（北緯26°07′30.74″，東經(jīng)119°18′23.98″，海拔 6.3 m），生育期為開花前期，提取部位為花、葉、莖、種子。參照國家藥典委員會[22]提取方法。

1.2 供試蟲源

小菜蛾飼養(yǎng)參照田厚軍等[23-24]的方法。小菜蛾蛹采自福建省福州市新店鎮(zhèn)埔垱村福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所實驗菜田（北緯26°07′30.74″，東經(jīng)119°18′23.98″，海拔 6.3 m），種群擴繁飼養(yǎng)于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所養(yǎng)蟲室，飼養(yǎng)過程中未接觸殺蟲劑，飼養(yǎng)代數(shù)至少30 代以上。幼蟲用甘藍（Brassica oleraceaL.var.capitata）葉片飼養(yǎng)，待化蛹后將其單頭分裝到指形管中，用10%蜜糖水對羽化后的成蟲進行養(yǎng)分補充，取生理狀態(tài)和蟲齡一致的試蟲進行測定。飼養(yǎng)溫度25 ℃±1.0 ℃，光照時間16 h·d-1，相對濕度（RH）65%～75%。

1.3 試劑與儀器

毒死蜱（Chlorpyrifos，純度92%，浙江新農(nóng)化工有限公司），氮酮（Aazone Laurocapram，純度95%，鄭州市新瑞化工有限公司），敵百蟲（Trichlorfon，純度90%，山東大成農(nóng)藥股份有限公司），氟蟲腈（Fipronil，純度96%，江西省宜春遠大化工有限公司），戊二醛（Glutaraldehyde，純度50%，國藥集團化學(xué)試劑有限公司），叔丁醇（Tert-butanol，純度99.5%，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）、0.1 mol·L-1pH=7.2磷酸緩沖液，KI（Potassium iodide，純度99%，國藥集團化學(xué)試劑有限公司），I2（Iodine，純度99.5%，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）、蔗糖（Sucrose，純度99.5%，國藥集團化學(xué)試劑有限公司），蒸餾水。JFC-型鍍儀鍍膜，JSM-5310LV 型掃描電鏡（上海凱悅電子科技有限公司）。氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀（Trace Gc ultra/DSQ，美國菲利根公司）。

1.4 掃描電鏡觀察

選取個體大小一致的小菜蛾3 齡幼蟲，每個處理10 頭，用尼龍紗籠將小菜蛾3 齡幼蟲分別浸入500、1 000 mg·L-1的土荊芥精油、氮酮以及丙酮和蒸餾水中5 s 后取出，吸去試蟲體上多余的藥液，置于培養(yǎng)皿（Ф=9 cm），用甘藍葉正常飼喂24 h[25]。

由于小菜蛾幼蟲身體較軟，為了使固定液滲入表面蠟質(zhì)，用少量去污劑與固定液結(jié)合。首先將小菜蛾用體積分?jǐn)?shù)為2.5% 的戊二醛（pH=7.2）固定24 h 后，用KI 組織導(dǎo)電液（2.0 g KI、0.2 g I2、100 mL雙蒸水、0.2 g 蔗糖）浸泡8～10 h，然后用蒸餾水清洗樣品，并用系列叔丁醇脫水，之后用叔丁醇浸沒，置冰箱（≤4 ℃）中10 min 后，放人真空干燥器中干燥40～60 min，將干燥好的樣品觀察面朝上粘臺，用JFC-1200 型鍍儀鍍膜，置于掃描電鏡（20 kV加速電壓）下觀察，拍照。掃描后對圖片的亮度、對比度稍作處理[26]。

1.5 幼蟲表皮滲透率測定

小菜蛾處理方法：參照魏方林等[27]的方法，選取室內(nèi)長期飼養(yǎng)、大小一致的小菜蛾3 齡幼蟲，各藥劑配置成丙酮液后，用點滴法（0.5 μL·頭-1）以LD50劑量處理試蟲。處理后置于墊有濾紙和放有新鮮甘藍葉的培養(yǎng)皿（Ф=9 cm）中，光照培養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)，在處理后1、2、6、12、24 h 分別取出10 頭試蟲，置于淋洗器內(nèi)，并用移液槍1 mL 丙酮，分10 次淋洗試蟲表皮，淋洗液收集于3 mL 的容量瓶中，用丙酮定容。另取10 頭未經(jīng)任何藥劑處理的3 齡幼蟲，同樣用1 mL 丙酮分10 次淋洗并定容至3 mL，作為對照。

菲尼根（Finngin）氣質(zhì)聯(lián)用儀；檢測器：離子肼質(zhì)譜、電子轟擊源（EI）；色譜柱：DB-5 MS 30 m×0.25 mm×0.25 μm；載氣：氦氣（99.999%）；柱流量：1.0 mL·min-1；進樣口溫度：220 ℃，離子源溫度250 ℃；色譜柱程序升溫：初始溫度80 ℃保持1 min，后以20 ℃·min-1升至280 ℃，保持11 min；標(biāo)樣進樣量：1 μL。

1.6 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析均采用DPS 軟件[28]。透皮吸收量和表皮滲透率數(shù)據(jù)均以采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（SE）”，采用單因素方差分析，鄧肯氏新復(fù)差檢驗法（Duncan’s Multiple Range Test，DMRT）進行多重比較其顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 土荊芥精油對小菜蛾幼蟲表皮蠟質(zhì)層超微結(jié)構(gòu)的影響

如圖1 所示，掃描電鏡觀察結(jié)果表明，蒸餾水處理組（圖1-A 和圖1-B）小菜蛾幼蟲體壁蠟質(zhì)層結(jié)構(gòu)緊密，有許多完整的刺狀突起，蠟花之間的空隙非常?。煌燎G芥處理組（圖1-C 與圖1-D）的蠟質(zhì)層結(jié)構(gòu)較為松散，蠟花間隙較大，可以看到明顯的結(jié)構(gòu)性損傷，刺狀突起變得比較平滑，刺狀突下面表皮產(chǎn)生褶皺或不規(guī)則變形，部分刺狀突起發(fā)生斷裂。

圖1 土荊芥精油對小菜蛾幼蟲表皮蠟質(zhì)層超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effect of WEO on cuticle wax layer of DBM larvae

丙酮處理組（圖1-E 和圖1-F）的蠟質(zhì)層結(jié)構(gòu)排列，蠟花間空隙小，但與蒸餾水處理組相比，部分刺狀突起不完整的，有些微破損；氮酮處理組（圖1-G 與圖1-H）蠟質(zhì)層結(jié)構(gòu)的刺狀突起排列較為松散，間隙較大，刺狀突起變得比較平滑，刺狀突下面表皮產(chǎn)生褶皺或不規(guī)則變形，與土荊芥精油處理組相當(dāng)。表明土荊芥精油與氮酮對小菜蛾幼蟲表皮具有相似的影響。

2.2 土荊芥精油對殺蟲劑的透皮吸收量的影響

表1 結(jié)果表明，處理后1 h，土荊芥精油處理組的敵百蟲在小菜蛾幼蟲表皮的滲透率達62.27%，而敵百蟲單劑處理組的滲透率僅為45.16%，氮酮處理組敵百蟲的表皮滲透率為64.51%。而處理后24 h，土荊芥精油處理組敵百蟲的滲透率為99.65%，氮酮處理組的為97.57%，表明土荊芥精油對敵百蟲的表皮滲透有更好的促進作用，而且比滲透促進劑氮酮對敵百蟲的表皮滲透促進作用更好。處理后1～2 h后，土荊芥精油與敵百蟲混配后在小菜蛾幼蟲表皮的累積透皮量與敵百蟲單劑比較，差異均顯著，達到氮酮水平。

表1 敵百蟲的累積透皮量及表皮滲透率Table 1 Accumulative quantity and rate of trichlorphon penetrated through DBM exoskeleton

表2 結(jié)果表明，土荊芥精油對氟蟲腈有顯著的滲透促進作用，隨著時間的增加，總體上氟蟲腈的累積透皮量和表皮滲透率都逐漸增加。處理12 h 后，土荊芥精油處理組的氟蟲腈表皮滲透率達99.08%，而氟蟲腈單劑處理組的表皮滲透率僅為24.52%，氮酮的表皮滲透率為60.88%；處理24 h 后土荊芥精油與氟蟲腈混配、氮酮的滲透率分別為99.34%和55.12%，由此表明土荊芥精油的促滲效果強于氮酮。處理后各個時間段，土荊芥精油與氟蟲腈混配的累積透皮量與氟蟲腈單劑比較，均有顯著差異，達到氮酮水平。

表2 氟蟲腈的累積透皮量及表皮滲透率Table 2 Accumulative quantity and rate of fipronil penetrated through DBM exoskeleton

表3 結(jié)果表明，土荊芥精油對毒死蜱的表皮滲透一定程度的促進作用，隨處理后時間的增加，毒死蜱的累積透皮量和表皮滲透率都逐漸增加。與毒死蜱單劑相比，處理后12 h 的表皮滲透率增幅較大，達92.05%，而毒死蜱單劑的滲透率僅為88.72%，滲透促進劑氮酮的滲透率也只有89.50%。在處理后各個時間段，土荊芥精油和毒死蜱混配的累積透皮量與毒死蜱單劑比較，差異不顯著，氮酮也是如此。

表3 毒死蜱的累積透皮量及表皮滲透率Table 3 Accumulative quantity and rate of chlorpyrifos penetrated through DBM exoskeleton

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，土荊芥精油處理后，小菜蛾的表皮可以看到明顯的結(jié)構(gòu)性損傷，蠟質(zhì)層結(jié)構(gòu)的刺狀突起排列變得比較松散，刺狀突起變得平滑，刺狀突下部變得褶皺或開裂，有助于化學(xué)藥劑透過表皮層進入昆蟲體內(nèi)。而土荊芥精油通過對灰茶尺蠖（Ectropis GrisescensWarren）和菜青蟲（Pieris rapae）幼蟲表皮的滲透作用進而影響其生長發(fā)育，主要表現(xiàn)在化蛹率、后代產(chǎn)卵量、蛹重等生長指標(biāo)均下降[5,15]；通過葉碟法測定薰衣草精油對斜紋夜蛾（Spodoptera lituraFabricius）的非選擇取食和生長抑制，結(jié)果表明，薰衣草精油在較低濃度時會促進3 齡幼蟲取食，在高濃度時會導(dǎo)致幼蟲表皮結(jié)構(gòu)破壞從而抑制其生長發(fā)育[16]；八角茴香果實精油對昆蟲表皮的損害性較強，不僅對棉鈴蟲（Helicoverpa armigeraHübner）的生長發(fā)育有顯著的抑制作用，而且大幅提高其3 齡幼蟲的死亡率[17]。綜上所述，植物精油對昆蟲的生物活性均表現(xiàn)在與昆蟲接觸后對其表皮結(jié)構(gòu)造成一定的損傷以提高其滲透速率。

促進藥物經(jīng)皮吸收有多種方法，其中促滲劑的利用最為廣泛，將藥物與促滲劑結(jié)合，利用促滲劑與皮膚類脂或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生相互作用而增加藥物滲透[29]。根據(jù)昆蟲抗性機理研究報道，影響藥劑滲透的主要因子是昆蟲的上表皮結(jié)構(gòu)，尤其是上表皮最外面的水泥層－蠟質(zhì)層的組成和厚度[30]。藥劑要首先溶入蠟質(zhì)層，然后再按照其分配系數(shù)滲透上表皮和原表皮[31]。從掃描電鏡觀察結(jié)果可知，土荊芥精油處理后，小菜蛾幼蟲表皮蠟質(zhì)層受到了一定程度的損傷或影響，刺狀突間隙增大，結(jié)構(gòu)排列比較松散，部分刺狀突發(fā)生斷裂現(xiàn)象，這與土荊芥精油作為滲透促進劑的作用機理，即改變角質(zhì)層的通透性，減低藥物經(jīng)皮滲透的阻力，提高藥物在皮膚角質(zhì)層的擴散系數(shù)是相一致的[32]。因此，把土荊芥精油作為一種滲透促進劑來研究開發(fā)是完全符合土荊芥精油本身特點。本研究結(jié)果也可為土荊芥精油應(yīng)用于其他有機磷、苯基吡唑類和硫代磷酸酯類殺蟲劑提供理論依據(jù)。

脂質(zhì)是昆蟲表皮的重要組成成分，其中體表脂質(zhì)是昆蟲維持正常生命活動的第一道防護屏障。對于化學(xué)藥劑來說，突破昆蟲表皮的防護屏障來殺死昆蟲至關(guān)重要，本研究初步探討土荊芥精油對小菜蛾表皮的滲透效果，并與幾種化學(xué)藥劑復(fù)配以驗證土荊芥精油對化學(xué)藥劑的增效作用，發(fā)現(xiàn)土荊芥精油的確具有提高農(nóng)藥殺蟲效果的潛力，后續(xù)我們將深入開展土荊芥精油對復(fù)合藥劑的增效作用研究以及對重要害蟲的表皮滲透促進作用，如采用透射電鏡掃描，進一步觀察土荊芥精油對小菜蛾表皮結(jié)構(gòu)及其皮下結(jié)構(gòu)的影響，更加深入地闡明土荊芥精油對小菜蛾表皮的滲透促進機制；同時，篩選土荊芥精油中重要的植物源活性物質(zhì)，作為農(nóng)藥助劑或者增效劑。田間藥效試驗是新藥劑評價和農(nóng)藥登記的必需步驟，在實驗室試驗研究的基礎(chǔ)上，進行田間藥效試驗，可為新藥劑的開發(fā)提供必要的科學(xué)依據(jù)；而植物精油是植物源殺蟲劑天然寶庫，如何加快植物精油殺蟲產(chǎn)品全面推向市場有待進一步探討。