滿(mǎn)江紅內(nèi)生細(xì)菌的培養(yǎng)及其抗生素抗性基因的檢測(cè)

陳 堅(jiān)，鄭益平，陳 彬，鄭斯平，鄭偉文

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，福建 福州 350003）

0 引言

【研究意義】發(fā)明抗生素類(lèi)藥物治療疾病是人類(lèi)在20 世紀(jì)取得的最重要成就之一。但是由于微生物的變異迅速，引入抗生素后不久它們就會(huì)出現(xiàn)抗性基因ARGs（Antibiotic resistance genes），使治療藥物失效。并且在任何一種新的抗菌藥物引入后，都可能產(chǎn)生新的抗性基因，從而造成對(duì)抗生素的耐藥性[1]。2017 年，Razavi 等[2]報(bào)道，ARGs 可以通過(guò)可移動(dòng)遺傳原件（Genetic mobile elements）的機(jī)制在細(xì)菌中傳播，造成ARGs 在環(huán)境中擴(kuò)散，從而對(duì)公共健康構(gòu)成威脅。由于在水產(chǎn)養(yǎng)殖的實(shí)踐中，抗生素不僅具有防治水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病的效能，還能起到促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物生長(zhǎng)的作用，因此在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的使用極為廣泛[3-4]。濫用抗生素導(dǎo)致抗生素抗性基因在水源環(huán)境中迅速傳播，不僅對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展造成直接危害，也對(duì)人類(lèi)健康產(chǎn)生重要影響[5-7]。因此，監(jiān)測(cè)和鑒定抗生素抗性基因在水源環(huán)境中的動(dòng)態(tài)成為重要的課題?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在水源環(huán)境中廣泛存在的水生蕨類(lèi)植物滿(mǎn)江紅（Azolla）俗稱(chēng)紅萍、綠萍，因富含氮素和蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，在亞洲農(nóng)村被用作綠肥和飼料已有數(shù)百年歷史[8-9]。這種細(xì)小的植物繁殖快，生物量高，歸因于其葉腔中棲息著一種固氮藍(lán)藻。該藍(lán)藻形態(tài)酷似念珠藻（Nostoc），一般稱(chēng)為滿(mǎn)江紅念珠藻（Nostocazollae），是由多個(gè)細(xì)胞串聯(lián)成的絲狀體，含有營(yíng)光合作用的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和專(zhuān)司固氮的異形胞。異形胞含有編碼固氮酶的nif基因,可將大氣氮轉(zhuǎn)化為植物可利用的結(jié)合態(tài)氮，以NH4的形態(tài)滿(mǎn)足宿主生長(zhǎng)對(duì)氮素的需求。宿主則以蔗糖為主的碳源作為回報(bào)[10-11]。但近30 年來(lái)，人們先后從滿(mǎn)江紅的葉腔發(fā)現(xiàn)并分離培養(yǎng)出其第三個(gè)共生伙伴——細(xì)菌。它們與固氮藍(lán)藻一起構(gòu)成了滿(mǎn)江紅葉腔內(nèi)的微生態(tài)系統(tǒng)。研究者們報(bào)道以自然界的滿(mǎn)江紅作為研究滿(mǎn)江紅內(nèi)生細(xì)菌的材料，采用傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法，從4 個(gè)生物種的滿(mǎn)江紅中分離鑒定出9 個(gè)屬15 個(gè)種的內(nèi)生細(xì)菌[12-13]。進(jìn)入21 世紀(jì)后，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，美國(guó)Raensallae 大學(xué)的Lechno 等[14]用rDNA-PCR 等方法從卡洲滿(mǎn)江紅的葉腔中鑒定出根癌農(nóng)桿菌、根瘤菌等4 種細(xì)菌。鄭斯平等[15]用PCRDGGE 和電鏡技術(shù)對(duì)滿(mǎn)江紅的葉腔和孢子果內(nèi)的細(xì)菌進(jìn)行了檢測(cè)和觀察,揭示了小葉滿(mǎn)江紅葉腔以變形菌門(mén)為主的多種可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的細(xì)菌,把對(duì)滿(mǎn)江紅內(nèi)生菌的表型多樣性的研究推進(jìn)了一步。隨后，鄭斯平等[16]將小葉滿(mǎn)江紅的內(nèi)生菌經(jīng)16S rDNA-PCR擴(kuò)增后用T-RFLP 技術(shù)和PAT 軟件分析，通過(guò)比對(duì)確定這些內(nèi)生菌屬于10 科42 屬?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】鑒于滿(mǎn)江紅是一種在淡水環(huán)境中生長(zhǎng)的古老植物，內(nèi)生有豐富的微生物群落。鑒定與檢測(cè)滿(mǎn)江紅內(nèi)生菌的抗生素相關(guān)基因，可以從一個(gè)側(cè)面了解ARGs在水環(huán)境中傳播的狀況?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】常用于檢測(cè)環(huán)境中抗生素抗性基因ARGs 的技術(shù)是PCR和微陣列技術(shù)，但近年來(lái)宏基因組學(xué)（Metagenomics）是新發(fā)展的一種基因組學(xué)技術(shù)，它通過(guò)從環(huán)境樣品中提取全部微生物的DNA，構(gòu)建基因組文庫(kù)，利用基因組學(xué)的方法研究環(huán)境中所包含的全部微生物的基因組信息，以探究微生物的群落結(jié)構(gòu)和基因功能。隨著新一代測(cè)序技術(shù)的完善，以及測(cè)序成本的逐年快速下降，基于宏基因組學(xué)的抗生素抗性基因ARGs 的鑒定逐漸成為主流技術(shù)[17-18]，本研究擬用3 種不同的培養(yǎng)基對(duì)小葉滿(mǎn)江紅內(nèi)生菌進(jìn)行培養(yǎng)，利用宏基因組學(xué)技術(shù)對(duì)培養(yǎng)的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)及抗生素抗性基因的分析和檢測(cè)，為進(jìn)一步研究滿(mǎn)江紅內(nèi)生細(xì)菌的存在狀態(tài)，以及利用內(nèi)生細(xì)菌中抗生素抗性基因的檢測(cè)，了解植物與生長(zhǎng)環(huán)境的互作關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 滿(mǎn)江紅植物材料來(lái)源與制備

供試材料為小葉滿(mǎn)江紅（Azolla microphyllaKaulfus），早先從國(guó)際水稻研究所（International Rice Research Institute）引進(jìn)，原編號(hào)為IRRI 4018。試驗(yàn)前在網(wǎng)室中于自然氣候條件下長(zhǎng)期培養(yǎng)保存，培養(yǎng)所用基質(zhì)為水土培養(yǎng)基，由取自田間的自然土高壓滅菌后加自來(lái)水配制而成。試驗(yàn)時(shí)為了排除外源細(xì)菌等微生物的干擾，參照白克智等[19]的莖尖培養(yǎng)法，略為修改進(jìn)行材料預(yù)處理，具體如下：取100 g（鮮重）在自然條件下生長(zhǎng)的萍體，用自來(lái)水清洗，去掉黏附的土壤等雜物，剪去根系。后選取健康的萍體再用無(wú)菌水清洗。撈取洗凈的健康萍體，置于滅菌的燒杯中，加入適量的0.1%升汞溶液,將萍體浸沒(méi),用滅菌的鑷子連續(xù)攪拌3.5 min，使?jié)M江紅的葉、莖和幼根充分與溶液接觸，以確保滅菌效果。隨后傾盡升汞溶液，迅速用無(wú)菌水清洗經(jīng)滅菌的萍體，至少清洗4 次，每次3 min，盡量洗去殘留在萍體上的升汞。在立體解剖鏡下用無(wú)菌的細(xì)針挑取并棄去包被莖尖的葉片，僅保留莖尖分生組織和1～2 個(gè)葉原基，后投入滅菌的IRRI培養(yǎng)液的三角瓶?jī)?nèi)。IRRI培養(yǎng)液的配方為（mg·L-1）：NaH2PO4·H2O 89，K2SO489.1，CaCl2·2H2O 147，MgSO4·7H2O 405.3，MnCl2·4H2O 1.8，Na2Mo2·2H2O 0.38，H3BO31.14，ZnSO4·7H2O 0.04，CuSO4· 5H2O 0.04，CoCl2· 6H2O 0.04，EDTA-Fe（FeSO4· 7H2O 0.249，EDTA 0.261，KOH 0.157，pH 6.5。

以上操作均在組培實(shí)驗(yàn)室的無(wú)菌環(huán)境下（蘇凈SW-CJ-2F 型）完成。

培養(yǎng)條件為：26 ℃/18 ℃（日/夜），光強(qiáng)15 000 lx。10～15 d 更新培養(yǎng)液。待繁殖足量后分別稱(chēng)取樣品用于下一步試驗(yàn)。

1.2 培養(yǎng)組微生物樣品的制備

稱(chēng)取培養(yǎng)的滿(mǎn)江紅鮮重材料2.5 g，加入6 mL 的ddH2O 研磨至勻漿，而后取1.5 mL 的滿(mǎn)江紅萍體勻漿液，接種到不同的微生物液體培養(yǎng)基中進(jìn)行震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25 ℃，震蕩轉(zhuǎn)速為60 r·min-1，培養(yǎng)時(shí)間為7～14 d。本研究選擇最通用的2 種細(xì)菌培養(yǎng)基R2A[20]及TRN[12]對(duì)滿(mǎn)江紅的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，并設(shè)置以培養(yǎng)滿(mǎn)江紅無(wú)藻萍的Nickell[19]培養(yǎng)基為對(duì)照。滿(mǎn)江紅內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)組的培養(yǎng)基具體配方見(jiàn)表1。

表1 滿(mǎn)江紅內(nèi)生菌的培養(yǎng)基Table 1 Culture media for endophytic bacteria of Azolla

1.3 培養(yǎng)組樣品DNA 提取與檢測(cè)

培養(yǎng)1～2 周后的培養(yǎng)組微生物樣品，經(jīng)離心收集菌體，用于全基因組DNA 的提取。本研究采用Ezup柱式細(xì)菌基因組 DNA 抽提試劑盒（上海生工），并按說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行。提取的DNA 需經(jīng)過(guò)質(zhì)檢，構(gòu)建IlluminaPE 文庫(kù)的DNA 含量≥2 ng·μL-1，DNA 質(zhì)量 ≥0.25 μg。檢測(cè)前將樣品在冰上融化后，充分混勻并離心，取適量樣品進(jìn)行檢測(cè)。分別用NanoDrop2000 檢測(cè) DNA 純度，QuantusFluorometer（Picogreen）檢測(cè)DNA 含量以及用1% 瓊脂糖凝膠電泳對(duì)檢測(cè)所提取DNA 的完整性（電壓：120 V，時(shí)間：20 min）。

1.4 宏基因組測(cè)序與生物信息學(xué)分析

樣品的宏基因組測(cè)序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司在其Illumina 第二代測(cè)序平臺(tái)MiSeq 上進(jìn)行，數(shù)據(jù)分析從下機(jī)原始序列開(kāi)始，首先對(duì)原始序列進(jìn)行拆分、質(zhì)量剪切以及去除污染等優(yōu)化處理。然后使用優(yōu)化序列進(jìn)行拼接組裝和基因預(yù)測(cè)，對(duì)得到的基因比對(duì)物種數(shù)據(jù)庫(kù)NR，以及抗生素相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫(kù)ARDB 和CARD，進(jìn)行抗生素抗性基因功能上的注釋以及分類(lèi)。宏基因組的數(shù)據(jù)分析在美吉生物科技有限公司的生物云平臺(tái)（i-sanger）上完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 宏基因組測(cè)序結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)滿(mǎn)江紅內(nèi)生細(xì)菌3 個(gè)培養(yǎng)組的宏基因組測(cè)序的有關(guān)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。每個(gè)序列的讀長(zhǎng)為150 bp，獲得的原始讀數(shù)為101.34～114.87 M；原始的堿基數(shù)為15.30～17.35 G。使用軟件fastp 對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，剪切掉數(shù)據(jù)中的低質(zhì)量及含N 的reads，從而得到高質(zhì)量的質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)（clean data）。獲得質(zhì)控后的讀數(shù)為99.91～113.81 M，質(zhì)控的堿基數(shù)為15.08～17.18 G，本次宏基因組測(cè)序共產(chǎn)生高質(zhì)量的數(shù)據(jù)量為48.66 G，質(zhì)控后堿基覆蓋原始?jí)A基數(shù)的98.52%以上。

表2 宏基因組測(cè)序數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)Table 2 Summary of metagenomic sequencing data

在獲得質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，對(duì)序列進(jìn)行組裝和基因預(yù)測(cè)，處理結(jié)果見(jiàn)表3。將3 個(gè)培養(yǎng)組樣本所獲得的質(zhì)控讀長(zhǎng)通過(guò)Megahit 進(jìn)行迭代拼接（overlap），拼接片段（contigs）最短要求為300 bp，各樣本得到1 711～13 482 個(gè)拼接片段（contigs）。使用MetaGene進(jìn)行ORF 預(yù)測(cè)。選擇核酸長(zhǎng)度大于等于100 bp 的基因，并將其翻譯為氨基酸序列。不同樣本測(cè)得11 813～27 163 個(gè)基因，每個(gè)樣品基因的平均長(zhǎng)度623.17～903.83 bp，覆蓋數(shù)據(jù)量為9.16～16.93 M。將預(yù)測(cè)出來(lái)的總共54 180 個(gè)基因（ORFs）序列使用CD-HIT 軟件進(jìn)行聚類(lèi)（參數(shù)為：90% 相似度、90% 覆蓋度）構(gòu)建非冗余基因集（Catalog gene），用于生物信息學(xué)分析。

表3 拼接片段與預(yù)測(cè)的功能基因數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)Table 3 Summary of contigs and predicted genes

2.2 培養(yǎng)的內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)分析

使用 BLASTP 將非冗余基因集與NR 數(shù)據(jù)庫(kù)（RefSeq 非冗余蛋白質(zhì)的氨基酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/about/nonredundantproteins/）進(jìn)行比對(duì)（BLAST 比對(duì)參數(shù)設(shè)置期望值 e-value 為1e-5），并通過(guò) NR 庫(kù)對(duì)應(yīng)的分類(lèi)學(xué)信息數(shù)據(jù)庫(kù)獲得物種注釋結(jié)果。從所采集的培養(yǎng)樣品中，共注釋出1 712 種微生物物種，使用物種對(duì)應(yīng)的基因豐度總和計(jì)算該物種的豐度，在各個(gè)分類(lèi)學(xué)水平上可以統(tǒng)計(jì)出物種在各個(gè)樣品中的豐度。將注釋到的樣品微生物類(lèi)別在總門(mén)水平和總屬水平上進(jìn)行分類(lèi)所得到物種及其豐度見(jiàn)表4，在云平臺(tái)分析僅顯示豐度大于0.01閾值的物種名稱(chēng)時(shí)，盡管在總門(mén)水平共有38 個(gè)門(mén)的物種被命名，但通過(guò)統(tǒng)計(jì)物種豐度發(fā)現(xiàn)：在所有培養(yǎng)樣品中僅變形菌門(mén)（Proteobacteria）占比在99.14%以上，其余門(mén)占比極低，總豐度僅有0.64%～0.86%?？梢?jiàn)滿(mǎn)江紅內(nèi)生菌在所選用的3 種培養(yǎng)基中均培養(yǎng)出以變形菌（Proteobacteria）為優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌。

表4 不同樣本的微生物在門(mén)與屬分類(lèi)水平上的物種豐度Table 4 Microbial community abundance of cultured samples at phylum and genus levels （單位：%）

由表4 可見(jiàn)：3 個(gè)樣品中雖然可檢測(cè)出712 個(gè)物種屬，但其中草螺菌屬（Herbaspirillum）的豐度為91.11%～92.15% ；其次為伯克霍爾德菌屬（Burkholderia），在各樣本中的占比可達(dá)1.2%左右。其余屬的單屬占比均小于1%，合并總量?jī)H占到7%左右。可見(jiàn)在總屬水平，3 種所選培養(yǎng)基中滿(mǎn)江紅內(nèi)生菌均繁殖出以草螺菌屬（Herbaspirillum）為優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌。

2.3 抗生素抗性基因數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)分析

抗生素抗性基因數(shù)據(jù)庫(kù)[21]（ARDB，http://ardb.cbcb.umd.edu/）收集了不同環(huán)境來(lái)源（如生活廢水、河流等）的細(xì)菌抗藥性基因及其抗性譜、作用機(jī)制等注釋信息，為研究藥物作用、環(huán)境治理提供研究依據(jù)。使用 BLASTP 將非冗余基因集與 ARDB 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)（比對(duì)參數(shù)設(shè)置期望值 e-value 為 1e-5），3 個(gè)樣品共注釋到10 個(gè)與抗生素有關(guān)的ARG 基因，歸為baca、bcra、bl2a_iii及ceob四大類(lèi)型（type），涉及桿菌肽（bacitracin）氯霉素（chloramphenicol），和青霉素（penicillin）等3 種抗生素，將樣品中的抗性基因的數(shù)量與相應(yīng)的抗生素類(lèi)型總結(jié)于表5。由表5中可見(jiàn)：滿(mǎn)江紅內(nèi)生細(xì)菌攜帶的大量抗性基因主要針對(duì)2 種抗菌素，一種為桿菌肽，另一種為氯霉素。

表5 樣本中抗生素抗性基因的類(lèi)型與序列讀長(zhǎng)數(shù)Table 5 Types and read amounts of ARGs in cultured samples

綜合抗生素抗性基因數(shù)據(jù)庫(kù)CARD[22]（http://arpcard.Mcmaster.ca，Version 1.1.3）廣泛包含了來(lái)自各種生物體、基因組、質(zhì)粒的抗生素抗性相關(guān)的參考基因，可用于指導(dǎo)環(huán)境、人體、動(dòng)物菌群耐藥組和抗生素抗性機(jī)制研究。使用 BLASTP 軟件，把非冗余基因集與 CARD 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)參數(shù)設(shè)置為“嚴(yán)格（strict）”比對(duì)。將目標(biāo)物種的基因與其耐藥功能注釋信息結(jié)合，3 個(gè)樣本中總共注釋得到212 個(gè)抗生素相關(guān)基因ARO（Antibiotic resistance ontology）。這些抗性基因再依據(jù)CARD 對(duì)基因抗性機(jī)制的基本分類(lèi)，主要對(duì)應(yīng)于3 個(gè)類(lèi)別（Class）水平：第一類(lèi)為AR（Antibiotic Resistance）類(lèi)抗生素抗性基因，它們能直接抵抗抗生素的作用，消除抗生素對(duì)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的影響。3 個(gè)樣本中這類(lèi)抗性基因的豐度均占88%以上；第二類(lèi)為AS（Antibiotic Sensitive）類(lèi)抗性基因，它們通過(guò)發(fā)生突變、敲除等方式，而賦予菌株抗生素抗性。這類(lèi)抗性基因在樣本中豐度為7%左右；第三類(lèi)為AT（Antibiotic Target）類(lèi)抗性基因，它們是與抗生素作用靶點(diǎn)結(jié)合后，能實(shí)現(xiàn)抵抗抗生素的作用，這類(lèi)抗性基因在樣本中占4%左右；將CARD 注釋的各樣本中的抗性基因ARO 的數(shù)量和抗性機(jī)制類(lèi)別（Class）的豐度總結(jié)于表6 中，由表6可見(jiàn)：3 個(gè)樣本檢測(cè)到的抗生素抗性基因的機(jī)制類(lèi)別是基本相同的。不僅如此，其中豐度最高的10 個(gè)ARO也基本相同，由表7 可見(jiàn)：3 個(gè)樣本中豐度最高的ARO 依次為：macB、sav1866、mdtB、PmrB、mexT、PmrA、evgS、adeH、mdtD、rosB。其中PmrA，PmrB為多粘菌素類(lèi)抗性基因，通過(guò)改變細(xì)胞壁的負(fù)荷抵消抗生素作用，其余8 個(gè)都是與通過(guò)泵的機(jī)制將抗生素外排作用有關(guān)的基因。這10 個(gè)ARO 均屬于AR類(lèi)抗性基因。由此可見(jiàn)：本研究檢測(cè)到的滿(mǎn)江紅內(nèi)生細(xì)菌主要是以直接抵抗的機(jī)制以消除抗生素的作用。

表6 不同樣本中檢測(cè)的ARO 抗生素抗性基因的數(shù)量及在抗性機(jī)制類(lèi)別水平的比例Table 6 Amount and classified percentage of detected AROs in cultured samples （單位：%）

表7 不同樣本中前10 位ARO 抗生素抗性基因的序列讀長(zhǎng)數(shù)Table 7 Read amounts of top 10 AROs in cultured samples

3 討論與結(jié)論

本研究以培養(yǎng)無(wú)共生藻的宿主植物滿(mǎn)江紅的培養(yǎng)基Nickell[19]為對(duì)照，利用2 種通用的細(xì)菌培養(yǎng)基R2A,TRN 對(duì)小葉滿(mǎn)江紅的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了分離培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)3 種營(yíng)養(yǎng)成分各異的培養(yǎng)組所培養(yǎng)形成的微生物物種基本是一致的。從門(mén)水平上而言，變形菌門(mén)（Proteobacteria）的細(xì)菌是其優(yōu)勢(shì)種群，推測(cè)這些種群的內(nèi)生細(xì)菌很可能在滿(mǎn)江紅共生關(guān)系的營(yíng)養(yǎng)代謝中起很大的作用。而通常在顯微鏡觀測(cè)下占優(yōu)勢(shì)的藍(lán)細(xì)菌門(mén)微生物在本培養(yǎng)中形成不了優(yōu)勢(shì)。從屬水平而言，滿(mǎn)江紅內(nèi)生細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)度則更為的明顯。結(jié)果證明，草螺菌屬（Herbspirillum）可占到全部細(xì)菌菌屬的90%以上，說(shuō)明它是滿(mǎn)江紅內(nèi)生菌中的一種優(yōu)勢(shì)菌種。已知草螺菌屬（Herbaspirillum）是一種常見(jiàn)的植物內(nèi)生菌，多分布于根莖部，且多具合成植物生長(zhǎng)素、聯(lián)合固氮等植物促生功能[23]。在富營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基中成為滿(mǎn)江紅一種優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)的內(nèi)生菌，其機(jī)制值得研究。

近年來(lái)宏基因組分析技術(shù)在抗生素抗性基因的發(fā)現(xiàn)、傳播機(jī)制、進(jìn)化分析等方面均起到了至關(guān)重要的作用。這得益于兩個(gè)方面：一方面，由于高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，整合工作流程至產(chǎn)生結(jié)果所花費(fèi)的時(shí)間大大減少，能夠在前所未有的短時(shí)間內(nèi)對(duì)大群體的微生物進(jìn)行比較，通過(guò)基因組測(cè)序，科研工作者可以快速了解目標(biāo)微生物攜帶的耐藥基因和可移動(dòng)元件等[24]；另一方面是由于抗性基因的生物信息學(xué)分析手段的進(jìn)步，各類(lèi)基因分析工具的開(kāi)發(fā)和抗生素抗性基因數(shù)據(jù)庫(kù)的建立[25]。ARDB 是一個(gè)人工搜索和校對(duì)的方法建立起來(lái)的微生物耐藥基因數(shù)據(jù)庫(kù)[21]。許多研究采用了ARDB 鑒定抗生素抗性基因[26-27]。本研究通過(guò)ARDB 比對(duì)，可以檢測(cè)到小葉滿(mǎn)江紅內(nèi)生細(xì)菌的特征耐藥基因是baca與ceob。而CARD 是一個(gè)基于志愿者貢獻(xiàn)數(shù)據(jù)的共享平臺(tái)[22]，每月更新一次以確保數(shù)據(jù)的時(shí)效性。本研究通過(guò)CARD 比對(duì)，注釋了212 抗生素相關(guān)基因ARO。根據(jù)耐藥機(jī)理[28-29]，CARD 將每個(gè)ARO 以：產(chǎn)生滅活酶或鈍化酶（antibiotic inactivation enzyme）破壞抗生素的活性；改變細(xì)胞壁或膜的滲透作用（altering cell wall charge）進(jìn)而阻礙抗菌藥物的進(jìn)入；加快細(xì)菌主動(dòng)外排作用（efflux pump），排出菌體內(nèi)的抗生素；改變抗生素作用靶位（antibiotic target modifying enzyme）等方面進(jìn)行具體功能描述，但在類(lèi)別（Class）水平主要分為直接抵抗AR，敏感抵抗AS 和靶點(diǎn)結(jié)合AT 等類(lèi)別。本研究發(fā)現(xiàn)的滿(mǎn)江紅內(nèi)生細(xì)菌抗生素相關(guān)基因ARO包含了AR，AS 和AT 等3 個(gè)類(lèi)別，且絕大多數(shù)是直接作用的AR 類(lèi)抗性基因。

本研究通過(guò)對(duì)小葉滿(mǎn)江紅內(nèi)生細(xì)菌的培養(yǎng)，首次結(jié)合宏基因組測(cè)序分析，在3 種不同營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基中注釋到了38 門(mén)712 屬的物種。這說(shuō)明宏基因組技術(shù)在對(duì)滿(mǎn)江紅內(nèi)生微生物物種基因檢測(cè)的廣度和精度方面與前人比都有極大的提升[12-16]，因?yàn)橹灰軝z測(cè)到某物種的1 條序列讀長(zhǎng)（read），就可以加以注釋。但考慮到基因豐度時(shí)，3 種樣本均出現(xiàn)生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的特定微生物群落—變形菌門(mén)草螺菌屬。鑒于本研究的宿主材料小葉滿(mǎn)江紅的來(lái)源單一，又長(zhǎng)期在一種環(huán)境下進(jìn)行種質(zhì)資源保護(hù)式的繁殖生長(zhǎng)，使得其內(nèi)生細(xì)菌保持較純的原生狀態(tài)。推測(cè)草螺菌本是小葉滿(mǎn)江紅的內(nèi)生的原生態(tài)菌之一，且適應(yīng)性及繁殖能力極強(qiáng)，在3 種培養(yǎng)基中均含氮、碳等營(yíng)養(yǎng)成分時(shí)，就可迅速繁殖成優(yōu)勢(shì)菌。而其他細(xì)菌，如易在顯微鏡下觀察到的藍(lán)細(xì)菌門(mén)的細(xì)菌雖然體型較大，但在培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富時(shí)，競(jìng)爭(zhēng)不過(guò)草螺菌而成為劣勢(shì)菌群。對(duì)其中抗生素抗性基因的檢測(cè)可以進(jìn)一步推測(cè)：正是由于這些單一優(yōu)勢(shì)菌群的出現(xiàn)，僅能檢測(cè)到滿(mǎn)江紅可攜帶為數(shù)不多的特定的抗生素抗性基因。本研究建立了水生植物滿(mǎn)江紅內(nèi)生細(xì)菌的培養(yǎng)程序，并應(yīng)用宏基因組技術(shù)對(duì)細(xì)菌的群落組成和所攜帶的抗生素抗性基因進(jìn)行檢測(cè)，為今后利用滿(mǎn)江紅對(duì)淡水環(huán)境中的抗生素抗性基因的動(dòng)態(tài)狀況進(jìn)行監(jiān)測(cè)提供了方法。通過(guò)對(duì)滿(mǎn)江紅內(nèi)生微生物的特異基因的檢測(cè)，也為篩查ARGs 在環(huán)境中依靠水生植物內(nèi)生菌的擴(kuò)散提供了新的思路。