不同炮制方法對菟絲子醇提物中總黃酮、總多糖及7種成分的影響

趙唯年，潘新波，趙麗娟，王艷紅，劉玉婷，賈忠，.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070；.蘭州市第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730046

菟絲子為旋花科植物南方菟絲子Cuscuta australisR.Br.或菟絲子Cuscuta ChinensisLam.的干燥成熟種子，味辛、甘，性平，歸肝、腎經(jīng)，具有補益肝腎、固精縮尿、安胎、明目、止瀉功效，用于肝腎不足、陽痿遺精、遺尿尿頻等[1-2]。菟絲子質堅實，不易粉碎，有效成分不易溶出，臨床多用其炮制品。歷代菟絲子炮制方法較多，如鹽炙、酒炙、清炒、制餅等。2020年版《中華人民共和國藥典》收載的菟絲子炮制品為鹽菟絲子。菟絲子主要含有酚酸、黃酮、多糖、生物堿、甾醇、氨基酸及微量元素等[3-5]，其中黃酮類和酚酸類化合物是其主要有效成分[6-7]。黃酮類和多糖是菟絲子中研究較多的化學成分，其中金絲桃苷、紫云英苷、槲皮素、異鼠李素等具有多種藥理活性，菟絲子總黃酮具有改善實驗性心肌缺血、調節(jié)機體免疫、刺激內分泌等多種功能[7-8]，菟絲子多糖具有降血糖、保護腦組織及抗衰老等作用，是發(fā)揮補益作用的重要物質基礎[8-9]。目前相關研究主要集中在質量控制、不同炮制品中有效成分含量測定、提取工藝及藥理作用的利用與開發(fā)[10-14]，而不同炮制方法對菟絲子炮制品整體質量評價及炮制前后化學成分差異變化研究報道較少。本試驗測定菟絲子不同炮制品醇提物中總黃酮、總多糖及7種主要藥效成分綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素的含量，建立菟絲子生品及炮制品（清炒品、酒炙品、鹽炙品、制餅品）HPLC指紋圖譜，結合化學計量學，分析菟絲子炮制前后化學成分的變化規(guī)律及差異性，為菟絲子及炮制品的質量控制評價及炮制機理研究提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent 1260 高效液相色譜儀（G1311C 四元泵，G1329B自動進樣器，G1316A柱溫箱，G1315D DAD檢測器），美國Agilent公司；Agilent openLAB control panel化學工作站，美國Agilent公司；752Pro紫外可見分光光度計，上海棱光技術有限公司；RE-52A旋轉蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；XPE105十萬分之一電子天平，瑞士METTLER TOLEDO 公司；TH-600BQG數(shù)控超聲波清洗機，濟寧天華超聲電子儀器有限公司。

對照品綠原酸（批號B20782）、蘆?。ㄅ朆20771）、金絲桃苷（批號B20631）、紫云英苷（批號B21704）、槲皮素（批號B20527）、山柰酚（批號B21126）、異鼠李素（批號B21554），上海源葉生物科技有限公司，質量分數(shù)≥98%。菟絲子藥材，蘭州安泰堂中藥飲片有限公司，符合2020年版《中華人民共和國藥典》（一部）規(guī)定；乙腈、甲醇均為色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 樣品制備

2.1.1 樣品預處理

取菟絲子原藥材，除雜，干凈干燥，菟絲子藥材分為5組，每組約100.0 g，密閉備用。

2.1.2 生品

稱取凈制菟絲子藥材，密閉保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 清炒品

稱取凈制菟絲子藥材，置炒制容器內，用文火加熱，炒至表面微黃，有爆裂聲，取出放涼，密閉保存?zhèn)溆肹15]。

2.1.4 鹽炙品

稱取凈制菟絲子藥材，加鹽水拌勻，悶潤2 h，待鹽水吸盡后，置炒制容器內，用文火加熱，炒至略鼓起，微有爆裂聲，香氣溢出時，取出放涼，密閉備用[15]。

2.1.5 酒炙品

稱取凈制菟絲子藥材，加黃酒拌勻，悶透2 h，待黃酒吸盡后，置炒制容器內，用文火加熱，炒至表面微變黃，取出放涼，密閉備用[15]。

2.1.6 制餅品

稱取凈制菟絲子藥材，加適量水（6倍量）煮至開裂，不斷攪拌，待水吸盡后，全部呈黏絲稠粥狀時，取出，放置過夜，壓餅，干燥，密閉備用。

2.1.7 樣品提取

分別精密稱取上述菟絲子生品及炮制品各約50.0 g，加60%乙醇500 mL，水浴回流提取2次，第1次45 min，第2次30 min，抽濾，合并，濃縮蒸干，得浸膏備用，分別計算各樣品的醇提浸膏得率。結果顯示，菟絲子生品、鹽炙品、清炒品、酒炙品、制餅品醇提浸膏得率分別為7.82%、10.12%、9.30%、9.32%、10.77%，表明炮制方法對菟絲子醇提物中化學成分的溶出具有促進作用。

2.2 總黃酮含量測定

2.2.1 對照品溶液制備

精密稱定蘆丁對照品適量，加60%乙醇制成濃度為0.981 mg/mL的對照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液制備

精密稱取各菟絲子生品及炮制品干燥浸膏約0.1 g，置100 mL錐形瓶中，精確加入60%乙醇50 mL完全溶解，稱定質量，超聲提取（功率250 W，頻率30 kHz）1 h，冷卻至室溫，用60%乙醇補足減失的質量，即得。

2.2.3 線性關系考察

精密吸取“2.2.1”項下蘆丁對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于10 mL具塞試管中，加入5%NaNO2溶液0.5 mL，混勻靜置，加入5%Al(NO3)3溶液0.5 mL，混勻靜置6 min，加入4%NaOH溶液4.0 mL，用60%乙醇定容至10 mL，放置15 min，于波長510 nm處測定吸光度值。以蘆丁質量（mg）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y=1.017 3X-0.007 2（r=0.999 6），結果顯示，蘆丁對照品在0.098 1～0.981 mg范圍內與吸光度值線性關系良好。

2.2.4 精密度試驗

精密吸取1.0 mL菟絲子生品供試品溶液6份，按“2.2.3”項下方法測定，結果顯示吸光度RSD=0.84%，表明該方法精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗

精密吸取1.0 mL 菟絲子生品供試品溶液，按“2.2.3”項下方法，分別于0、10、20、40、60、90 min測定，結果顯示吸光度RSD=2.54%，表明供試品溶液在90 min內穩(wěn)定性良好。

2.2.6 重復性試驗

分別精確稱取菟絲子生品各6份，按“2.1.7”項下方法提取，所得干燥浸膏按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項下方法進行測定，結果顯示吸光度RSD=2.55%，表明該方法重復性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗

分別精確稱取6份菟絲子生品醇提物浸膏適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別吸取1.0 mL已知含量供試品溶液置具塞試管中，分別加入0.3 mL蘆丁對照品溶液，按“2.2.3”項下方法測定，結果顯示，平均回收率為97.62%，RSD=2.01%。

2.2.8 樣品測定

精密吸取“2.2.2”項下各供試品溶液1.0 mL，按“2.2.3”項下方法測定吸光度，平行3次，計算總黃酮含量。結果菟絲子生品、鹽炙品、清炒品、酒炙品、制餅品的總黃酮含量分別為0.828 6%、0.869 0%、1.110 9%、1.330 5%、1.174 1%。與生品比較，各炮制品中總黃酮含量明顯較高，依次為酒炙品>制餅品>清炒品>鹽炙品>生品，酒炙品總黃酮含量約為生品的1.6倍。表明各炮制方法對菟絲子醇提物中總黃酮的溶出具有促進作用。

2.3 總多糖含量測定

2.3.1 對照品溶液制備

精密稱定無水葡萄糖對照品適量，加蒸餾水制成濃度為0.001 049 g/mL對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液配制

精密稱取菟絲子生品及炮制品干燥浸膏約1.0 g，置于250 mL錐形瓶，使含醇量達80%。靜置過夜，離心后將沉淀用蒸餾水溶解，按Sevage法（氯仿∶正丁醇=4∶1）除蛋白，重復以上操作3次。離心后將沉淀用20 mL蒸餾水溶解，吸取1 mL溶液定容至50 mL容量瓶中，即得。

2.3.3 線性關系考察

分別吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL對照品溶液，用蒸餾水補足至1.0 mL，置具塞試管中，加入5%苯酚溶液0.5 mL，混勻后迅速加入2.5 mL濃硫酸振蕩，充分混合后將試管置于沸水浴中反應15 min。于波長490 nm處測吸光度，以無水葡萄糖質量（g）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y=1 420.6X-0.013 2（r=0.999 5），結果顯示，無水葡萄糖在0.000 104 9～0.001 049 g范圍內與吸光度值線性關系良好。

2.3.4 精密度試驗

精密吸取1.0 mL菟絲子生品供試品溶液6份，按“2.3.3”項下方法測定，結果顯示吸光度RSD=1.22%，表明該方法精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗

精密吸取1.0 mL 菟絲子生品供試品溶液，按“2.3.3”項下方法，分別于0、10、20、40、60、90 min測定，結果顯示吸光度RSD=1.98%，表明供試品溶液在90 min內穩(wěn)定性良好。

2.3.6 重復性試驗

分別精確稱取菟絲子生品各6份，按“2.1.7”項下提取，所得干燥浸膏按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項下方法測定，結果顯示吸光度RSD=2.02%，表明該方法重復性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗

分別精確稱取6份菟絲子生品醇提物浸膏適量，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，分別吸取1.0 mL已知含量供試品溶液置具塞試管中，分別加入0.1 mL無水葡萄糖對照品溶液，按“2.3.3”項下方法測定，結果顯示，平均回收率為103.33%，RSD=2.56%。

2.3.8 樣品測定

精密吸取“2.3.2”項下各供試品溶液1.0 mL，按“2.3.3”項下方法測定吸光度，平行3次，計算總多糖含量。結果菟絲子生品、鹽炙品、清炒品、酒炙品、制餅品的總多糖含量分別為1.160 1%、3.296 1%、2.343 6%、2.515 6%、3.589 3%。與生品比較，各炮制品中總多糖含量明顯較高，依次為制餅品>鹽炙品>酒炙品>清炒品>生品，制餅品總多糖含量約為生品的3.1倍。表明各炮制方法對菟絲子醇提物中總多糖的溶出具有促進作用。

2.4 7種成分含量測定

2.4.1 對照品溶液制備

分別精密稱取綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚、異鼠李素對照品適量，用甲醇配制成濃度分別為0.013 845、0.039 3、0.251 2、0.001 94、0.030 3、0.000 49、0.000 195 mg/mL的混合對照品溶液，搖勻，即得，4 ℃保存，備用。

2.4.2 供試品溶液制備

精密稱取“2.1”項下制備的菟絲子清炒品醇提浸膏約0.1 g，置100 mL錐形瓶中，加入50%甲醇50 mL溶解，超聲（250 W，30 kHz）提取20 min，冷卻至室溫，用50%甲醇補足減失的質量，即得，4 ℃保存。

2.4.3 色譜條件

采用Phenonmenex Luna C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水（B），梯度洗脫（0～20 min，17%～23%A；20～40 min，23%～40%A；40～60 min，40%～60%A），柱溫30 ℃，流速1 mL/min，進樣量10.0μL，檢測波長360 nm，理論塔板數(shù)5 000。色譜圖見圖1。

圖1 菟絲子清炒品醇提物HPLC圖

2.4.4 線性關系考察

取混合對照品溶液，依次進樣0.5、5、10、15、25、35 μL，以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素的回歸方程及線性范圍，見表1。

表1 7種成分線性關系考察結果

2.4.5 精密度試驗

吸取混合對照品溶液適量，按“2.4.3”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，測定各對照品峰面積和保留時間。結果顯示，綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素峰面積RSD分別為0.08%、0.13%、0.16%、0.20%、0.09%、0.14%、0.10%，保留時間RSD 分別為0.11%、0.15%、0.10%、0.10%、0.08%、0.13%、0.07%，表明儀器精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗

吸取“2.4.2”項下菟絲子清炒品溶液，按“2.4.3”項下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24、48 h測定峰面積并計算。結果顯示，供試品溶液中綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素的峰面積RSD 分別為2.16%、1.77%、1.01%、1.88%、0.73%、0.69%、0.94%，表明供試品溶液在48 h內穩(wěn)定性良好。

2.4.7 重復性試驗

分別精確稱取菟絲子清炒品醇提物各0.1 g，平行6份，按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.3”項下色譜條件測定。結果顯示，6份菟絲子清炒品醇提物供試品溶液中綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素峰面積RSD分別為1.66%、2.05%、1.77%、1.54%、2.02%、1.88%、1.03%，表明該方法重復性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗

按“2.1”項下方法制備6份菟絲子清炒品醇提物，精密稱取0.1 g置100 mL錐形瓶，分別按各成分100%濃度加入綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素對照品溶液，按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.3”項下色譜條件進樣測定，計算回收率。結果顯示，綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素的平均回收率分別為97.20%、99.05%、103.55%、100.11%、98.82%、104.41%、 99.09%，RSD 分別為 1.01%、1.82%、1.42%、1.36%、2.34%、0.75%、1.05%。

2.4.9 樣品含量測定

精密稱取菟絲子生品及各炮制品醇提物各約0.1 g，按“2.4.2”項下方法制備各供試品溶液，按“2.4.3”項下色譜條件進樣測定，結果見表2。各炮制品中綠原酸、蘆丁、金絲桃苷和槲皮素含量與菟絲子生品差異明顯，各炮制品中綠原酸、槲皮素及山柰酚含量均較生品有所增加；清炒品中蘆丁含量明顯降低，但槲皮素含量明顯高于生品，這一現(xiàn)象可能與清炒過程中蘆丁隨溫度升高分解成槲皮素有關。鹽炙品、酒炙品和制餅品中除紫云英苷外，綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素、山柰酚含量均高于生品。鹽炙品和酒炙品中上述7種成分的含量高于其他炮制品，表明二者具有促進有效成分溶出的作用。

表2 菟絲子生品及不同炮制品醇提物中7種成分含量（mg/g，n=3）

2.5 指紋圖譜建立與分析

2.5.1 共有峰標定及相似度計算

按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.3”項下色譜條件測定，將圖譜導入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012A版）進行分析，選取重復性和穩(wěn)定性好、分離度高的色譜峰進行匹配，共標定17個共有峰，見圖2。經(jīng)與對照品譜圖比對，指認1～7號峰分別為綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素。指紋圖譜相似度評價結果見表3。菟絲子生品與炮制品相似度均不小于0.9，表明不同炮制品化學組成一致性較好。

圖2 菟絲子生品及不同炮制品醇提物HPLC指紋圖譜

表3 菟絲子生品及炮制品醇提物指紋圖譜相似度分析（r）

2.5.2 化學計量學分析

2.5.2.1 主成分分析

采用SPSS20.0軟件對指紋圖譜17個共有峰峰面積進行標準化處理后，進行主成分分析（PCA），主成分特征值、累計貢獻率見表4。共提取2個特征值>1的主成分，累計方差貢獻率為92.074%，表明前2個主成分可代表指紋圖譜共有峰中大部分化學成分信息和差異信息。主成分載荷矩陣見表5，第1主成分主要反映了10、9、8、11、14、17、15、13、紫云英苷、金絲桃苷、蘆丁的峰信息，第2主成分中12、異鼠李素、16、蘆丁、13、金絲桃苷、17、15號峰的載荷因子較高。因子得分系數(shù)矩陣見表6，紫云英苷和異鼠李素分別在第1、2主成分中因子得分系數(shù)最高。將上述標準化處理后的17個共有峰峰面積數(shù)據(jù)導入SIMCA14.1軟件，PCA得分散點圖和載荷圖見圖3?？梢钥闯?，菟絲子不同炮制品區(qū)分度較為明顯，表明不同炮制方法對菟絲子中化學成分影響較大，且PCA結果與指紋圖譜分析結果較為一致。

圖3 菟絲子指紋圖譜共有峰PCA得分散點圖和載荷圖

表4 菟絲子指紋圖譜共有峰主成分特征值及方差貢獻率

表5 菟絲子指紋圖譜共有峰主成分載荷矩陣

表6 菟絲子指紋圖譜共有峰主成分因子得分系數(shù)矩陣

2.5.2.2 正交偏最小二乘-判別分析

將17個共有峰峰面積數(shù)據(jù)導入SIMCA14.1軟件，進行正交偏最小二乘-判別分析（OPLS-DA），得分散點圖及載荷圖見圖4。結果顯示各炮制品差異明顯，區(qū)分度高。變量重要性投影（VIP）見圖5。以VIP>1.0為條件，篩選出7個差異標志物，依次為山柰酚>異鼠李素>綠原酸>12號峰>16號峰>金絲桃苷>紫云英苷，上述化合物對區(qū)分菟絲子不同炮制品影響較大。OPLSDA結果與PCA及指紋圖譜具有較高一致性。

圖4 菟絲子指紋圖譜共有峰OPLS-DA得分散點圖和載荷圖

圖5 菟絲子不同炮制品醇提物共有峰OPLS-DA VIP圖

3 討論

目前菟絲子主要炮制加工方法有鹽炙、清炒、酒炙及制餅等。近年來研究表明，菟絲子生品與其炮制品中的化學成分有較大差異[8，13-14]。本研究結合前期預試驗，從整體性角度出發(fā)，測定菟絲子發(fā)揮藥理作用的總黃酮、總多糖含量，并以7種主要藥效物質分析評價不同炮制方法的影響，結果顯示菟絲子炮制后可提高醇提物浸膏得率，總黃酮和總多糖含量均高于生品。各炮制品中綠原酸、蘆丁、金絲桃苷和槲皮素含量變化與菟絲子生品差異明顯，鹽炙和酒炙對菟絲子中7種成分的溶出具有促進作用。

預試驗比較了水和乙醇（40%、60%、80%）作為提取溶劑對菟絲子總黃酮、總多糖及特征性成分含量測定的影響，結果表明60%乙醇的總提取效率最高，故選擇60%乙醇作為提取溶劑。

菟絲子主要含有黃酮和酚酸類化合物，依據(jù)其性質，本研究分別考察了不同流動相體系、流速、檢測波長、柱溫條件下，對色譜峰峰形、分離度的影響，結果以乙腈-0.1%磷酸水為流動相，檢測波長360 nm，流速1 mL/min，柱溫30 ℃，進行梯度洗脫，色譜圖基線平穩(wěn)，色譜峰吸收值較大，干擾最少，分離度高。

與生品比較，菟絲子清炒品中蘆丁含量明顯降低，槲皮素含量明顯升高，可能與炒制過程中使蘆丁、金絲桃苷等黃酮類分解有關；炮制品中綠原酸含量明顯升高，鹽炙、清炒、酒炙和制餅過程中，溫度在短時間內快速升高，從而使綠原酸相對穩(wěn)定，增大了在醇溶液中的溶解度；鹽炙品和酒炙品中黃酮類成分含量均升高，且酒炙品黃酮類成分含量稍高于鹽炙品，上述含量分析結果與肖嵐等[16]研究結果具有一致性，可為相關研究提供印證參考。

通過對菟絲子生品及炮制品HPLC指紋圖譜分析，共識別標定17個共有峰，鑒別指認7種化合物。相似度分析結果表明，菟絲子炮制前后整體化學成分具有較好的一致性，但藥效化學成分含量有顯著差異。PCA和OPLS-DA表明，不同炮制方法對菟絲子中山柰酚、異鼠李素、綠原酸、12號峰、16號峰、金絲桃苷、紫云英苷7個差異標志物影響較大。

本研究建立了菟絲子不同炮制品醇提物中多成分含量測定方法，通過分析菟絲子不同炮制品HPLC指紋圖譜，可為菟絲子及炮制品的質量評價和探討菟絲子炮制前后化學成分的變化規(guī)律提供參考。