含銀離子羥基磷灰石表面涂層的鈦板對6種牙周致病菌的體外抑菌作用

楊 磊 丹 丹 馬 蘭 賈 慧 王玉杰

（邯鄲市口腔醫(yī)院，邯鄲 056001）

慢性牙周炎和慢性根尖周炎已經(jīng)成為成人牙列缺失的主要病因。如今口腔種植技術(shù)逐漸成為解決牙體缺損和牙列缺失病例的首選治療方案[1]。但是，由于慢性牙周炎和慢性根尖周炎患者自身存在對牙周致病菌的易感因素，以及口腔固有菌群失衡、根尖區(qū)術(shù)中致病菌清理困難、常規(guī)種植體表面處理不具有抗菌性能等原因，增加了常規(guī)種植或即刻種植病例的種植體周圍炎的發(fā)生率[2，3]。因此，提升種植體抗菌能力逐漸成為口腔種植材料學(xué)的必要發(fā)展方向[4]。

銀離子具有獨(dú)特的理化性質(zhì)和特殊的生物學(xué)效應(yīng)，納米銀離子能夠殺滅多種細(xì)菌，在一定的計(jì)量范圍內(nèi)無細(xì)胞毒性。目前已經(jīng)有很多銀離子醫(yī)療產(chǎn)品用于臨床的預(yù)防、診斷、治療，并取得了較好的療效。在動(dòng)物感染模型中發(fā)現(xiàn)，將銀離子加入骨水泥，并用于兔全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)，能夠有效抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成，防止人工關(guān)節(jié)假體周圍感染的發(fā)生[5]。 本研究的目的是比較普通羥基磷灰石表面鈦板與含銀離子羥基磷灰石表面鈦板的體外抗菌能力，為今后口腔臨床選擇合適的種植體材料提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要設(shè)備 厭氧培養(yǎng)箱 （DYⅡ型，浙江義烏冷動(dòng)機(jī)總廠），比濁儀（BIORED公司，美國），牛心腦浸液血瓊脂平板（BHI-S培養(yǎng)基），牛心腦浸液瓊脂平板（BHI-培養(yǎng)基），巰基乙醇酸鹽轉(zhuǎn)送液（TD液）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)菌株 由四川大學(xué)口腔生物醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供以下6種菌株（A～F）：

A.牙 齦 卟 啉 單 胞 菌（ATCC，33277）P.gingivalisATCC，33277；B.牙齦卟啉單胞菌381P.gingivalis381；C.牙髓卟啉單胞菌P. endodentalis（ATCC，34506）；D.中間普雷沃菌P. intermedia（ATCC，25611）；E.產(chǎn) 黑 色 素 普 雷 沃 菌P.meninogenica（ATCC，19040）；F.具核梭桿菌E.nuclealum（ATCC，10953）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)材料 普通羥基磷灰石表面涂層的鈦板與含銀離子羥基磷灰石表面涂層的鈦板由我院口腔科實(shí)驗(yàn)室制備，方法如下：電解液中Ag+濃度0.5 mmol/L。溶液溫度40℃，pH值=4.0，脈沖電位-2 V，沉積時(shí)間2 h，熱處理溫度700 ℃。使用CHl660D電化學(xué)工作站，以鈦片作為工作電極，鉑盒板作為對電極．飽和甘汞電極作為參比電極進(jìn)行電化學(xué)沉積。取100 mL電解液于燒杯中，將燒杯置于集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中，設(shè)定溫度為40℃，緩慢攪拌。初始電位為3次開路電位測定的平均值，高電位0.30 V，低電位-2 V，階躍次數(shù)72，脈沖寬度100/s。采樣間隔1/s，靜置時(shí)間0.5/s。完成電沉積后，將制得的樣品放入馬弗爐中，在空氣中進(jìn)行高溫處理。升溫速度為5℃/min，熱處理溫度設(shè)定為700 ℃，達(dá)到處理溫度后保溫2 h[6]。

1.2 體外抑菌研究

采用CLSI推薦的平板菌落計(jì)數(shù)法：將樣品制備成1 cm×1 cm的正方形，正反兩面紫外燈各照射30 min消毒，備用。取12個(gè)10 mL的 EP管（編號1～12），每管分別加入5 mL的 LB 液體培養(yǎng)基和100 μL活化后的6種細(xì)菌（濃度約為1×106CFU/mL），再分別加入不同的樣品，放在37 ℃，200 r/min 的搖床中共培養(yǎng) 12 h。然后將混合液搖勻，取100 μL，稀釋到一定的倍數(shù)后，再取 50 μL稀釋混合液均勻涂于固體培養(yǎng)基上，在37 ℃培養(yǎng)24 h，記錄每個(gè)平板中形成的菌落數(shù)量。每個(gè)實(shí)驗(yàn)平行操作3次，依據(jù)稀釋倍數(shù)，計(jì)算出原始樣品中所含細(xì)菌菌落總數(shù)。抗菌率的計(jì)算公式：抗菌率=（對照樣品苗落數(shù)-被測樣品菌落數(shù)）/對照樣品菌落數(shù)×100%。

1.3 掃描電鏡標(biāo)本制備

將樣品制備成1 cm×1 cm的正方形，正反兩面紫外燈各照射30 min消毒，備用。取2個(gè)10 mL的 EP 管，分別編號1～2，每管依次加入 5 mL的 LB 液體培養(yǎng)基和100 μL活化后的P.gingivalis菌液（濃度約為 1×106CFU/mL），分別加入不同的樣品，放在37 ℃，200 r/min 的搖床中共培養(yǎng)12 h。樣品用3%戊二醛固定，PBS洗滌3次，用OsO4固定30 min，PBS洗滌3次，脫水：50%Alc，75%Alc，100%Alc（5 min/次），37℃干燥1 min，離子濺射儀噴金120 s，用掃描電子顯微鏡（S-3400N型，西門子公司，德國）觀察材料表面。

1.4 材料表面細(xì)菌生物膜形成的評估

采用結(jié)晶紫（crystal violet，CV）染色的方法評估2種材料表面細(xì)菌生物膜形成[7]。實(shí)驗(yàn)方法同1.2，不同之處是樣品與菌液的共培養(yǎng)時(shí)間是4 h。然后PBS洗滌材料2次，65 ℃干燥20 min，0.3%結(jié)晶紫（Sigma-Aldrich公司，美國），室溫下孵育15 min，PBS洗滌3次，自然干燥后，采用96%EtOH洗脫CV，GloMax Multi分光光度計(jì)（Promega公司，美國）在600 nm吸光度下測量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，以（±s）表示，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2種材料表面的體外抑菌作用比較

2種材料對牙周致病菌株均具有一定的體外抑制作用。且含銀離子羥基磷灰石表面的抑菌作用要強(qiáng)于普通羥基磷灰石表面（P＜0.05），見表1。

表1 材料表面對6種牙周致病菌的體外抑菌率（±s, %）

表1 材料表面對6種牙周致病菌的體外抑菌率（±s, %）

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2.2 掃描電鏡觀察

掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)：未接觸細(xì)菌的鈦板表面光滑、無任何附著物或結(jié)晶體（圖1A）。和細(xì)菌共培養(yǎng)過的材料表面存在數(shù)量不等的炎性附著物或結(jié)晶體，以及生長的細(xì)菌、凋亡中的細(xì)菌被大量的纖維膜包裹或覆蓋于表面（圖1B）。但含銀離子羥基磷灰石表面的細(xì)菌和細(xì)菌生物膜明顯減少（圖1C）。

圖1 鈦板表面掃描電鏡觀察結(jié)果

2.3 材料表面對細(xì)菌生物膜細(xì)菌的清除作用

未接觸細(xì)菌的材料表面無細(xì)菌生物膜形成（0%），含銀離子羥基磷灰石表面的6種牙周致病菌的細(xì)菌生物膜菌量均明顯低于普通羥基磷灰石表面（P＜0.05），見表2。

表2 材料表面對細(xì)菌生物膜細(xì)菌的清除作用（±s, %）

表2 材料表面對細(xì)菌生物膜細(xì)菌的清除作用（±s, %）

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3 討論

牙周病的病原菌已經(jīng)逐漸明確，革蘭氏陰性厭氧菌P. gingivalis、F. nucleatum等已經(jīng)證明是牙周病的主要致病菌[8]。P. gingivalis的齦下定植與牙周病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[9]。該菌為G-、無芽胞、產(chǎn)黑色素、專性厭氧的桿菌。它可產(chǎn)生內(nèi)毒素、膠原酶、胰酶樣蛋白酶、磷酸脂酶A以及氨、吲哚、有機(jī)酸、硫化氫等代謝產(chǎn)物，對牙周組織產(chǎn)生毒性及破壞作用。另外，P. gingivalis具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)化膿性感染的能力，可產(chǎn)生多種炎癥因子，能破壞宿主的防御系統(tǒng)，同時(shí)降解細(xì)胞基質(zhì)蛋白而造成組織破壞。F. nucleatum是G-、無芽胞、不解糖或弱發(fā)酵碳水化合物的梭形厭氧菌，也是口腔常見的細(xì)菌之一，主要在齦緣和齦下菌斑定植[10]。該菌產(chǎn)生的脂肪酸、NH3、吲哚、H2S、內(nèi)毒素可以抑制成纖維細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1，誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞和外周血多形核細(xì)胞的凋亡，從而逃避免疫殺傷細(xì)胞。另一方面，通過清除對免疫防御至關(guān)重要的免疫細(xì)胞而有助于其它病原菌的再生，進(jìn)而導(dǎo)致牙周病的發(fā)生和發(fā)展。

種植體表面的羥基磷灰石涂層與哺乳動(dòng)物牙齒、骨骼的無機(jī)質(zhì)成分相同，結(jié)構(gòu)相似，具有良好的生物活性和生物相容性。然而，HA易吸附蛋白質(zhì)、氨基酸和其他有機(jī)質(zhì)，這為細(xì)菌的生長提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)[11]。細(xì)菌在材料表面形成生物膜，繼而生長繁殖。Ag+即使在10 ～ 70μg/mL 的低濃度范圍也能對G-和G+菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌活性[12]。從材料表面緩釋出的Ag+通過靜電力吸附在帶負(fù)電的細(xì)菌細(xì)胞壁上，中斷跨膜電子傳遞，還可與-SH 結(jié)合破壞酶蛋白的活性。接著Ag+從細(xì)菌尸體中游離出來，再與其他細(xì)菌結(jié)合達(dá)到循環(huán)殺菌的效果。因此，Ag+對細(xì)菌、真菌和病毒都具有良好的廣譜抗菌能力[13，14]。研究表明，雖然Ag+對微生物的毒性強(qiáng)，但對人體細(xì)胞相對安全。Ag-HA無論是在富營養(yǎng)還是貧營養(yǎng)環(huán)境都表現(xiàn)出抗菌性能[15-17]。

本實(shí)驗(yàn)選擇了6種具有代表性的牙周致病菌，通過采用CLSI推薦的平板菌落計(jì)數(shù)法檢測普通羥基磷灰石表面鈦板和含銀離子羥基磷灰石表面鈦板對這些致病菌的體外抑菌作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種材料對牙周致病菌模式株均具有一定的體外抑制作用。但是，含銀離子羥基磷灰石表面的抑菌作用要強(qiáng)于普通羥基磷灰石表面，表明含銀離子羥基磷灰石表面鈦板具有較強(qiáng)的體外抑菌作用。

此外，采用電鏡掃描和結(jié)晶紫染色法發(fā)現(xiàn)，含銀離子羥基磷灰石表面的細(xì)菌和細(xì)菌生物膜明顯少于普通羥基磷灰石表面，并且6種牙周致病菌的細(xì)菌生物膜菌量均明顯低于普通羥基磷灰石表面，提示含銀離子羥基磷灰石表面可以抑制細(xì)菌生物膜的形成，減少細(xì)菌生物膜菌量，有利于種植體的長期存活率和種植成功率。進(jìn)一步驗(yàn)證了含銀離子羥基磷灰石具有良好抗菌性能，含銀離子羥基磷灰石表面涂層的鈦板抑制牙周致病菌的能力較強(qiáng)，尤其是對于P. endodentalis，P.intermedia以及E. nuclealum。其原因可能是由于是這3種細(xì)菌對于銀離子的結(jié)合能力更強(qiáng)，銀離子和細(xì)菌表面結(jié)合，進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞后，作用于DNA，在雙螺旋結(jié)構(gòu)中形成嘌呤/銀/嘧啶的化學(xué)鍵，取代相鄰的嘌呤與嘧啶之間的氫鍵，形成一個(gè)更穩(wěn)定的螺旋結(jié)構(gòu)，阻止DNA解鏈，DNA分子不能有效復(fù)制，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

4 結(jié)論

表面含銀離子羥基磷灰石涂層的鈦板抑制牙周致病菌的能力較強(qiáng)，尤其是對于牙髓卟啉單胞菌、中間普雷沃菌、具核梭桿菌效果更明顯，可以考慮作為口腔種植體材料，尤其可能對于慢性牙周炎、慢性根尖周炎、2型糖尿病等高風(fēng)險(xiǎn)人群具有重要意義。