醫(yī)用純鎂骨植入后降解產(chǎn)物的體內(nèi)代謝及重要臟器分布的定量評價

陸 華 俞懿強 隋佰延 劉 昕 孫 皎

（上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院 口腔醫(yī)學院口腔材料科，國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心，上海市口腔醫(yī)學重點實驗室，上海市口腔醫(yī)學研究所，上海生物材料研究測試中心，上海 200011）

近年來，醫(yī)用純鎂作為新一代的“智能綠色材料”，成為可降解醫(yī)用植入材料領域的焦點。相比傳統(tǒng)的不銹鋼和鈦基材料，它不僅具有與人體骨組織匹配的力學性能（力學強度和彈性模量），而且表現(xiàn)出良好的生物相容性和成骨活性[1-3]。高純鎂（99.99 wt.%）抗腐蝕性優(yōu)于大多數(shù)的鎂合金[4]，還能有效避免毒性元素釋放的風險問題，P Han等報道醫(yī)用高純鎂在體內(nèi)外具有良好的成骨活性[5]。然而，作為生物可降解的骨植入材料，由于不需二次手術(shù)拆除，醫(yī)用純鎂會在體內(nèi)存在相當長的時間。在這期間，它的主要降解產(chǎn)物鎂離子是否會引起血鎂和尿鎂含量的變化，從而影響肝腎功能等尚未見系統(tǒng)研究。本文選擇醫(yī)用純鎂，研究純鎂骨植入后的主要降解產(chǎn)物在體內(nèi)的代謝及其在重要臟器中的蓄積和定量分布情況，為其臨床應用提供重要的安全性方面的評價數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料

醫(yī)用純鎂：直徑2 mm，長度6 mm的柱狀植入棒，由上海交通大學材料科學與工程學院提供；對照材料：直徑2 mm，長度6 mm的柱狀HDPE植入棒，由日本Hatano研究所提供。

1.2 主要儀器設備

全自動生化分析儀（Hitachi 7600， Japan）；電感耦合等離子質(zhì)譜儀（ICP-MS 7700，安捷倫，美國）。

1.3 實驗動物

健康、成年新西蘭大白兔24只，購自上海松江松聯(lián)實驗動物場，體重2.2～2.5 kg。實驗動物的使用經(jīng)上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院動物倫理委員會批準。

1.4 實驗分組及周期

動物編號，隨機選擇1#～9#兔子植入醫(yī)用純鎂（實驗組），10#～18#兔子植入HDPE（對照組），用于研究體內(nèi)代謝分布；植入周期分別為4 w、12 w和26 w，每組每期各3只動物。19#～24#兔子植入醫(yī)用純鎂，研究植入前、后不同時間點的血鎂和尿鎂等的變化趨勢，試驗周期為26 w。

1.5 試驗方法

1.5.1 骨植入實驗

參照ISO1093-6：2016[6]的標準，用2.5%戊巴比妥鈉麻醉動物。按常規(guī)外科手術(shù)要求消毒，沿肌肉間隙暴露脛骨皮質(zhì)，在脛骨中段用低轉(zhuǎn)速間歇地鉆孔（每側(cè)制備3個孔，孔徑2 mm，間隔10 mm），并用生理鹽水沖洗降溫。實驗組動物雙側(cè)脛骨共植入6個純鎂試樣，逐層縫合肌肉、筋膜和皮膚。對照組動物同法操作，植入HDPE。

1.5.2 主要降解產(chǎn)物Mg2+的體內(nèi)代謝分布

植入后4 w、12 w和26 w分別對實驗組和對照組的動物實施安樂死，收集2組的尿液、血液及重要臟器（心、肝、脾、腎、肺），利用ICPMS，檢測各組織中降解產(chǎn)物Mg2+的含量。

1.5.3 植入前后體內(nèi)血鎂/尿鎂濃度的動態(tài)變化

分別在植入前、植入后的1 w、2 w、3 w、4 w、6 w、8 w、10 w、12 w、14 w、16 w、18 w、20 w、22 w、24 w和26 w收集19#～24#每只兔子的尿液各5 mL，運用全自動生化分析儀測定尿鎂濃度。分別在植入前及植入后的4 w、8 w、12 w、18 w、22 w、26 w抽取兔血4 mL，離心收集0.5 mL血清后，運用全自動生化分析儀測定血清中的鎂濃度以及重要生化指標（血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、肌酐及尿酸）的水平。

1.6 統(tǒng)計學分析

利用SPSS軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，實驗組與對照組相比，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ICP-MS分析Mg2+的體內(nèi)代謝分布

ICP-MS分析結(jié)果如表1 所示，體內(nèi)分布研究結(jié)果表明，純鎂試樣植入后4 w、12 w、26 w，與對照相比，體內(nèi)重要臟器（心、肝、脾、腎、肺）組織中Mg2+濃度未發(fā)生顯著變化（P＞0.05）。

表1 ICP法分析骨植入后不同時間點動物體內(nèi)的Mg2+濃度 （μg/g）

體內(nèi)代謝研究結(jié)果顯示，植入后4 w、12 w和26 w，血液中Mg2+濃度未發(fā)生顯著的升高或降低，與對照組之間的差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而尿液中Mg2+濃度在植入后4 w和12 w時有升高趨勢，與對照相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），到26 w可恢復到正常水平。

2.2 植入前后的血鎂濃度變化

血生化分析結(jié)果顯示：相比植入前，純鎂植入后的血清鎂濃度僅發(fā)生很小幅度的波動，未見顯著的升高或降低（圖1）。而且各時期的血清鎂濃度的標準差均很小，說明不同個體間的差異也不大，該指標較為穩(wěn)定可靠。

圖1 純鎂植入前后動物的血清鎂濃度變化

2.3 植入前后的尿鎂濃度變化

尿液生化分析結(jié)果顯示：純鎂植入前后的尿鎂濃度未發(fā)生顯著的升高或降低（圖2），無時間依賴性變化。僅在6 w到8 w階段出現(xiàn)了短時的小幅上升，到10 w時又回落到之前的水平。而且各時期的尿鎂濃度的標準差均很小，說明不同個體間的差異也不大，該指標較為穩(wěn)定。

圖2 純鎂植入前后動物的尿液鎂濃度變化

2.4 植入前后主要血生化指標的變化

在純鎂植入前后，實驗動物的血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和血清肌酐（CR）水平未發(fā)生顯著性變化（圖3A，B）；血清尿酸（UA）的濃度均在4 w時較植入前顯著降低，但在4 w后均穩(wěn)定維持在較低水平（圖3C，D）。

圖3 純鎂植入前后4種主要的血清生化指標的變化

3 討論

醫(yī)用純鎂作為一類預期應用于口腔、心血管和骨科領域的可降解類生物材料，由于會在體內(nèi)存在相當長的時間，因此，揭示醫(yī)用純鎂的長期全身毒性，探究其主要降解產(chǎn)物（鎂離子）在生物體內(nèi)的分布和代謝規(guī)律，對于系統(tǒng)評價材料的長期生物安全性顯得尤為重要。

研究結(jié)果表明，純鎂試樣植入后4 w、12 w和26 w，與對照組相比，體內(nèi)重要臟器（心、肝、脾、腎、肺）組織中Mg2+濃度未發(fā)生顯著變化（P＞0.05），提示醫(yī)用純鎂材料在骨植入26 w內(nèi)其降解產(chǎn)物Mg2+未在體內(nèi)重要臟器發(fā)生蓄積。體內(nèi)代謝研究結(jié)果顯示，與對照組相比，植入后4 w、12 w、26 w，血液中Mg2+濃度未發(fā)生顯著的升高或降低（P＞0.05），且血鎂水平在植入后26 w之內(nèi)無時間依賴性變化，基本保持穩(wěn)定，提示純鎂金屬的降解并未快速產(chǎn)生大量的Mg2+釋放入血液，因而未引起血清鎂含量的明顯升高。而尿液中Mg2+濃度在植入后4 w和12 w時與對照相比有升高趨勢（P＜0.05），到26 w回落到正常水平，提示純鎂金屬材料的降解產(chǎn)物Mg2+可能經(jīng)腎臟代謝后由尿液排出。

醫(yī)用純鎂降解后不可避免地會產(chǎn)生鎂離子和鎂微粒等產(chǎn)物。這些降解產(chǎn)物進入骨髓和體液而后進入循環(huán)系統(tǒng)。那么它們是否會引起血液中鎂的升高或蓄積呢？本研究結(jié)果顯示：純鎂植入體內(nèi)后，實驗動物的血清鎂含量未發(fā)生異常升高或降低（圖1），這表明高純鎂的降解并沒有快速產(chǎn)生大量的鎂離子進入血液，因而未引起血清鎂含量的明顯升高。這一現(xiàn)象與Mg-1Ca和ZEK100鎂合金植入后的血清鎂結(jié)果相符[7，8]。成人體內(nèi)的鎂元素50%存在于骨骼，45%在細胞內(nèi)液，細胞外液的鎂元素僅占5%。在細胞外液，鎂的含量僅次于鈉、鉀、鈣而居第4位。眾所周知，鎂元素在許多生理過程中發(fā)揮了重要作用，是多種重要生物酶的激活劑。例如堿性磷酸酶、磷酸變位酶、己糖激酶、焦磷酸酶、肌酸激酶等的催化作用都須有鎂離子的激活[9]。鎂也是組成DNA、RNA及核糖體大分子結(jié)構(gòu)所必需的元素之一，參與維持正常的神經(jīng)和肌肉功能。血清鎂是反應肝腎功能的重要指標之一。嚴重肝腎功能異常疾病如慢性腎炎少尿期、急性或慢性腎功能衰竭和急性病毒性肝炎等均會引起血清鎂的異常升高。純鎂植入前后各時期的血清鎂濃度未見異常升高（圖1），說明純鎂的降解產(chǎn)物既沒有引起機體鎂元素的代謝紊亂，也未影響正常的肝腎功能。這可能是因為純鎂在體內(nèi)降解較為緩慢，產(chǎn)生的鎂離子并未突釋進入血液，而且逐步產(chǎn)生的一定濃度的鎂離子還利于骨組織新生。

血液中的鎂離子最終經(jīng)過腎臟濾過進入尿液，本研究發(fā)現(xiàn)：實驗動物在26 w的植入周期內(nèi)，純鎂植入前后的尿液鎂含量也未發(fā)生顯著變化（圖2），這表明純鎂的降解并沒有快速產(chǎn)生大量的鎂離子經(jīng)由尿液排泄。由此提示，緩慢降解產(chǎn)生的鎂離子是逐漸勻速地排泄出體外，因而不會引起尿鎂濃度大幅度的波動。

盡管已經(jīng)證明醫(yī)用純鎂降解產(chǎn)生的鎂離子未引起血液和尿液中的鎂異常升高，那么這些鎂離子是否會在經(jīng)過肝臟代謝和腎臟濾過時蓄積在組織器官中而引起肝腎功能異常呢？這是純鎂生物安全性的重要方面。為此，我們對血清中與肝腎功能密切相關的生化指標進行了長期動態(tài)監(jiān)測。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）廣泛存在于各種器官組織中，肝細胞中ALT含量最多。當肝臟發(fā)炎時轉(zhuǎn)氨酶就會從肝細胞釋放到血液中，因此，血清ALT是評價肝臟功能和肝細胞受損的重要指標。與ALT類似，正常血清中天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）含量很低，但當肝細胞或心肌細胞受損時胞漿內(nèi)的AST釋放入血漿。AST是反映肝細胞壞死的重要指標，可以和ALT結(jié)合起來反映肝功能的狀況。本研究結(jié)果顯示，在醫(yī)用純鎂植入后各時期ALT和AST的水平均未發(fā)生顯著升高（圖3A，B），提示純鎂植入物的降解產(chǎn)物經(jīng)肝臟代謝時沒有引起肝細胞損傷和肝功能異常。

腎臟是降解產(chǎn)物排出體外的重要器官，為了研究醫(yī)用純鎂降解產(chǎn)物對腎臟功能的影響，我們動態(tài)監(jiān)測了兩個重要的腎功能生化指標，即血肌酐和血尿酸。肌酐是肌肉代謝產(chǎn)生的小分子物質(zhì)，幾乎全部通過腎小球濾過隨尿液排出體外。血肌酐是反應腎功能的靈敏指標，它的升高意味著腎功能異常。尿酸是嘌呤分解代謝的最終產(chǎn)物，腎臟功能受損會導致血尿酸濃度顯著升高，因此血尿酸檢測是診斷腎功能受損的有效手段。醫(yī)用純鎂植入后各時期的動態(tài)監(jiān)測結(jié)果顯示，血肌酐和血尿酸的濃度均未出現(xiàn)明顯增高（圖3C，D）。這有力地證明新型純鎂的降解產(chǎn)物沒有引起腎功能的損害。由此推測緩慢降解產(chǎn)生的鎂尚在機體清除的能力之內(nèi)，而不會蓄積在肝腎組織中。

4 結(jié)論

綜上所述，由于醫(yī)用純鎂在體內(nèi)發(fā)生長期緩慢的降解，降解過程中并沒有快速產(chǎn)生大量的鎂離子進入血液而導致血鎂異常升高，且降解產(chǎn)物經(jīng)腎臟排泄出體外，既未引起肝腎功能異常，也未導致尿鎂的顯著增高。由此提示，醫(yī)用純鎂作為一種預期用于骨組織的可降解類生物材料，在體內(nèi)顯示了良好的生物安全性。