保護劑提高皮革用蛋白酶穩(wěn)定性的研究

吳芳彤，曹倩榮，鄭翔，劉春卯，秦夢，王力源

（河北省微生物研究所，河北 保定 071051）

制革工業(yè)相對于新型產(chǎn)業(yè)來說，依然是一個高污染的“粗放型”工業(yè)，其產(chǎn)生的廢水、廢物、廢氣等污染主要來自灰堿法脫毛?；覊A法脫毛是目前皮革企業(yè)普遍采用的脫毛方法，其優(yōu)點是效果好、成本低，但由于硫化物和石灰的使用，以及大量毛蛋白溶于廢水中，使排放的廢水含有大量S2-、有機物、固體懸浮物、堿性污泥等，該步驟排放的污染物可占整個制革過程排污量的80%～90%[1-4]。作為化學脫毛的替代方法，目前有氧化脫毛法、酶法脫毛、有機脫毛法等，其中酶法脫毛是近些年來最有可能替代灰堿法脫毛的一種清潔化脫毛技術(shù)[5]。

我國酶法脫毛的研究始于20世紀50年代，到七八十年代已篩選出多株適用于不同產(chǎn)品的脫毛酶，如枯草芽孢桿菌AS1.398中性蛋白酶、微白鏈霉菌166中性蛋白酶、矮小芽孢桿菌209堿性蛋白酶[6]。但這些酶制劑產(chǎn)品并未在皮革行業(yè)得到大規(guī)模推廣，其原因在于其酶系中含有水解皮膠原的膠原蛋白酶，在脫毛的同時也會水解皮面的膠原蛋白，在脫毛生產(chǎn)中工藝控制不嚴格很容易造成皮面松弛、爛皮的現(xiàn)象[7]；還有一個原因在于經(jīng)濟成本過高，相對于灰堿法而言酶制劑價格較貴，且酶只在特定的溫度和pH范圍內(nèi)才能發(fā)揮作用，對設(shè)備和操作要求相對嚴格，投入成本高[8，9]。當前提高酶穩(wěn)定性的方法有基因工程、蛋白質(zhì)工程、化學修飾、固定化、添加保護劑等，其中添加保護劑是一種簡便、高效且經(jīng)濟的手段。Sudeep P.George等[10]研究了嗜堿嗜熱單孢菌在80℃時熱穩(wěn)定性，結(jié)果表明山梨糖醇，甘露醇、甘油和甘氨酸可提高嗜堿嗜熱單孢菌的熱穩(wěn)定性。Nirmal Nilesh P.等[11]發(fā)現(xiàn)在50℃時添加50%海藻糖和50%山梨糖醇，與未添加任何助劑相比真菌堿性蛋白酶殘留活性提高了5倍。劉朝輝等[12]研究了多種保護劑對β-甘露聚糖酶熱穩(wěn)定性的影響，結(jié)果表明添加蔗糖、殼聚糖、甘油、山梨醇或復合保護劑均能使β-甘露聚糖酶的最適反應溫度從原來的50℃提高到60℃左右。

針對蛋白酶制劑在脫毛工藝中應用的局限性，本實驗室前期構(gòu)建了一株脫毛用工程菌WB800N/pHT43-npr，其發(fā)酵生產(chǎn)的蛋白酶（JW-3）經(jīng)酶學特性及脫毛應用研究表明，水解膠原蛋白能力較差，在pH 6～7穩(wěn)定性良好，且其脫毛效果與傳統(tǒng)灰堿法脫毛的皮粒面效果相當[13，14]。但JW-3蛋白酶耐受性相對較差，在脫毛應用中溫度與pH的變化易使其酶活性大大降低，影響其脫毛效率。為進一步提高JW-3蛋白酶的穩(wěn)定性，為脫毛酶液的循環(huán)利用提供理論支撐，本文利用單因素結(jié)合響應面優(yōu)化篩選可提高JW-3蛋白酶穩(wěn)定性的保護劑，并對添加保護劑后的JW-3蛋白酶的熱穩(wěn)定性、酶失活動力學參數(shù)等進行研究，提升JW-3蛋白酶在皮革脫毛工藝中的應用性能，從而降低了酶法脫毛生產(chǎn)成本，促進清潔化酶制劑在皮革脫毛工藝的推廣應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌工程菌Bacillus subtilis（WB800N/pHT43-npr），由本研究室與中國科學院微生物研究所共同構(gòu)建，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，CGMCC No.11625。工程菌WB800N/pHT43-npr的發(fā)酵液經(jīng)固液分離獲得上清液即為JW-3蛋白酶。

1.1.2 試劑

福林試劑、碳酸鈉、三氯乙酸、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、酪蛋白、甘油、二甲基亞砜（DMSO）、無水乙醇、1,2-丙二醇均為國藥分析純；甘露醇、聚乙二醇（PEG）2000購自北京酷來博生物技術(shù)有限公司；海藻糖購自生工生物工程（上海）股份有限公司；蔗糖、葡萄糖購自Sigma-Aldrich貿(mào)易有限公司；山梨醇、甘露糖購自北京博奧拓達科技有限公司；乳糖購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；果糖購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗儀器與設(shè)備

DZKW-4電熱恒溫水浴鍋，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；ZXRD-A7230恒溫鼓風干燥箱，上海智城分析儀器制造有限公司；PHS-25 pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；TD10002G電子天平，天津天馬衡基儀器有限公司；JA2003A電子精密天平，天津天馬衡基儀器有限公司；H3018DR高速冷凍離心機，上海知信實驗儀器技術(shù)有限公司；ZWY-2012C振蕩培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司；LH-3BA紫外可見智能型多參數(shù)水質(zhì)測定儀，北京連華永興科技發(fā)展有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 J W-3蛋白酶酶活的測定

JW-3蛋白酶酶活的測定方法，參照《GB/T 23527-2009蛋白酶制劑》中附錄B的方法。酶活保存率的計算公式：w(%)=Ai/A0×100（w：酶活保存率；Ai：不同溫度下保存后的酶活力；A0：初始酶活力）。

1.3.2 J W-3蛋白酶的熱穩(wěn)定性

將JW-3蛋白酶液分別置于35、40、45、50、55、60℃下保溫6 h，每間隔1 h取樣檢測酶活，計算酶活保存率。

1.3.3 添加保護劑對J W-3蛋白酶熱穩(wěn)定性的影響

1.3.3.1 單一保護劑對JW-3蛋白酶熱穩(wěn)定性的影響

在50℃下，分別研究醇類、糖類和有機溶劑三類保護劑對JW-3蛋白酶穩(wěn)定性的影響，選出可提高JW-3蛋白酶穩(wěn)定性的單一保護劑，并進行單因素濃度梯度實驗。

按照0、5%、10%、15%、20%、25%、30%的比例分別在JW-3蛋白酶中添加醇類（山梨醇、甘露醇、無水乙醇和1,2-丙二醇）、糖類（海藻糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖、乳糖和果糖）和有機溶劑（甘油、二甲基亞砜（DMSO））；按照0、2%、4%、6%、8%、10%的比例在JW-3蛋白酶中添加聚乙二醇（PEG）2000。50℃恒溫水浴保存6 h，測定上述不同添加量的酶活，計算酶活保存率，以不加保護劑的酶液作對照，篩選出效果最優(yōu)的保護劑并確定最適添加量。

1.3.3.2 復合保護劑的篩選

根據(jù)單因素優(yōu)化的實驗結(jié)果，采用中心組合設(shè)計（CCD）響應面法優(yōu)化復合保護劑配比。

1.3.4 添加保護劑對酶熱穩(wěn)定性的影響

取適量已添加保護劑的JW-3酶液分裝于離心管中，分別置于35、40、45、50、55、60℃，6個不同溫度的水浴鍋中，定時取樣檢測酶活力，計算酶活保存率。

失活速率常數(shù)（K）的測定[15]：對于一級反應，由速率方程lnA=-kt可求得k，其中，A為酶活保存率(%)；t為失活時間（h）。半衰期(t1/2)的測定：特定溫度下酶活降低一半所需要的時間，對于一級反應，t1/2=0.693/k。

2 結(jié)果與討論

2.1 JW-3蛋白酶熱穩(wěn)定性

JW-3蛋白酶主要應用在皮革脫毛工藝，在工廠化脫毛過程中因操作粗放，調(diào)控不及時等因素，常常造成酶失活率較高，從而導致應用效果不穩(wěn)定。因此，本文首先對JW-3蛋白酶的熱穩(wěn)定性進行了全面的分析，如圖1所示。在35℃時JW-3蛋白酶相對穩(wěn)定，失活率較小，保溫6 h酶活保存率高達93.88±2.97%；在40和45℃時JW-3蛋白酶穩(wěn)定性相對較差，保溫6 h酶活保存率分別為60.08±1.18%和58.34±0.08%；在50℃以上，JW-3蛋白酶熱穩(wěn)定性極差，50℃保溫6 h酶活保存率僅為16.91±1.33%，在55℃和60℃時保溫6 h酶活保存率基本為0。

圖1 JW-3蛋白酶熱穩(wěn)定性試驗Fig.1 The thermos stability of JW-3 protease

在酶法脫毛中多將溫度控制在35℃左右，但JW-3蛋白酶在35℃時穩(wěn)定性良好，短時間內(nèi)酶活波動不大，因此為了快速篩選出提高JW-3蛋白酶熱穩(wěn)定性的保護劑，本文選擇在50℃下展開研究。

2.2 添加保護劑對JW-3蛋白酶熱穩(wěn)定性的影響

2.2.1 添加單一保護劑對J W-3蛋白酶熱穩(wěn)定性的影響

本文考察了在50℃下，不同種類、不同濃度梯度的單一保護劑對JW-3熱穩(wěn)定性的影響，結(jié)果如圖2-圖4所示。醇類中聚乙二醇2000、無水乙醇和1，2-丙二醇（如圖2所示）對JW-3蛋白酶的熱穩(wěn)定性具有抑制作用，山梨醇和甘露醇對JW-3蛋白酶的熱穩(wěn)定性具有顯著的促進作用。其中添加25%的山梨醇效果最佳，在50℃放置6 h后JW-3蛋白酶的酶活保存率為78.50±0.89%，與對照組（不添加任何保護劑的JW-3蛋白酶50℃放置6 h，酶活23.09±1.84%）相比酶活保存率提高了約55.41%。Kumar等[16]研究了山梨醇可提高α-糜蛋白酶的熱穩(wěn)定性，并通過光譜學方法分析了兩種穩(wěn)定劑存在時可以阻止蛋白在高溫環(huán)境中變性。山梨醇作為多羥基化合物，能與酶分子形成氫鍵，穩(wěn)定酶分子結(jié)構(gòu)。本文山梨醇的加入可能在高溫下阻止了JW-3蛋白酶構(gòu)象的變化，保護酶的天然構(gòu)象，使其結(jié)構(gòu)更緊湊，從而維持其活性中心不變性。

圖2 醇類保護劑對JW-3蛋白酶熱穩(wěn)定性的影響Fig.2 The effects of alcohol protective agents on thermal stability of JW-3 protease

如圖3所示，共考察的6種糖類保護劑對JW-3蛋白酶的熱穩(wěn)定性均具有促進作用，其中以添加葡萄糖的效果最佳，添加25%的葡萄糖其酶活保存率可達81.43±1.86%，與對照組（酶活23.09±1.84%）相比酶活保存率提高了約58.34%。糖類保護劑對JW-3蛋白酶的熱穩(wěn)定性作用的原因可能是由于糖類物質(zhì)主要通過結(jié)構(gòu)中的羥基與細胞膜、細胞器膜或蛋白質(zhì)極性基團形成眾多氫鍵或在蛋白質(zhì)表面形成水化層，從而保護細胞（器）膜及蛋白質(zhì)生物大分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[17，18]。

圖3 糖類保護劑對JW-3蛋白酶熱穩(wěn)定性的影響Fig.3 The effects of carbohydrate protective agents on thermal stability of JW-3 protease

本文共研究了2種有機溶劑對JW-3蛋白酶熱穩(wěn)定性的影響（如圖4所示），甘油對JW-3蛋白酶的熱穩(wěn)定性具有促進作用，DMSO對JW-3蛋白酶具有抑制作用。當甘油添加量為15%時，50℃放置6 h后酶活保存率可達46.74±0.54%，與對照組（酶活23.90±1.20%）相比酶活保存率提高了約22.84%。

圖4 有機溶劑類保護劑對JW-3蛋白酶熱穩(wěn)定性的影響Fig.4 The effects of organic solvent on thermal stability of JW-3 protease

2.2.2 復合保護劑對J W-3蛋白酶熱穩(wěn)定性的影響

基于單因素試驗結(jié)果，以酶活保存率（Y）為響應值，運用Design-Expert8.0.6對山梨醇添加量（X1）、葡萄糖添加量（X2）和甘油添加量（X3）進行響應面優(yōu)化，本文響應面優(yōu)化采用中心組合設(shè)計（CCD），涉及立方點±1、軸向點±α以及中心點0，當因素為3的時候α為1.682。因此實驗設(shè)計見表1，響應值見表2。

表1 響應面試驗因素與水平Tab.1 Factors and levels of response surface experiments

表2 響應面優(yōu)化試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.2 Design and results of response surface methodology

根據(jù)實驗結(jié)果，采用逐步回歸的方法進行二次回歸分析，剔除不顯著的因素，得到的回歸方程如下式：Y=80.71+2.40A+4.25B-0.63C-2.17AC-3.38BC-2.45A2-1.84B2-1.64C2

對該模型方程進行方程分析和顯著性分析，結(jié)果見表3。模型F=7.55，P=0.0020＜0.01極顯著，負相關(guān)系數(shù)R2=87.18%，校正決定系數(shù)RAdj2=75.63%，表明75.63%的變化可以由此模型解釋，說明模型的擬合程度較好，能很好地反映山梨醇添加量（X1）、葡萄糖添加量（X2）和甘油添加量（X3）對酶活保存率的影響。其中山梨醇添加量（X1）和葡萄糖添加量（X2）之間交互作用極顯著（P＜0.01），葡萄糖添加量（X2）和甘油添加量（X3）之間交互作用顯著（P＜0.05）。失擬項（P=0.1162＞0.05）不顯著，表明未知因素對實驗結(jié)果影響較小。

表3 二次逐步回歸模型方差分析Tab.3 Variance analysis of the stepwise regression quadratic model

觀察兩因素交互作用對響應值的影響可采用降維分析（dimension reduction analysi，DRA），即其他因素保持在零水平情況下，觀察兩個因素交互作用對響應值的影響并得到其響應面及等高線見圖5。

圖5 山梨醇、葡萄糖和甘油添加量交互作用對酶活保存率影響的響應面及等高線圖Fig.5 Response surface plots and contour lines of interaction between sorbitol,glucose and glycerol addition

通過Design-Expert8.0.6對該模型進行分析，獲得多組最優(yōu)解，選取預測響應值最高的前三組分別為X1=13.34%、X2=24.79%、X3=0.01%。為方便操作，將各保護劑的添加量進行了修正，即山梨醇（X1）13%和葡萄糖（X2）25%，在此條件下進行了3次驗證試驗，其酶活保存率為85.73±1.28%，與預測值84.47%無顯著性差異。在單因素試驗中，添加25%的葡萄糖其酶活保存率可達81.43±1.86%，在實際脫毛應用中考慮到成本的因素，最終確定JW-3蛋白酶的保護劑為25%葡萄糖。

2.3 添加25%葡萄糖對JW-3蛋白酶熱穩(wěn)定性的影響

如圖6所示，加入25%葡萄糖在不同溫度下保溫6 h后，JW-3蛋白酶的熱穩(wěn)定性顯著提高。與未添加保護劑的JW-3蛋白酶相比，在35～50℃時JW-3蛋白酶穩(wěn)定性較好，酶活損失較少，保溫6 h酶活保存率分別為102.374.54%、82.54±4.26%、78.89±0.58%和66.33±0.05%；55℃時保溫6 h酶活保存率為18.76±0.80%，而相同溫度未添加保護劑的JW-3蛋白酶在2 h時酶活僅存0.88±0.05%。實驗表明，添加25%葡萄糖可以顯著提高JW-3蛋白酶的熱穩(wěn)定性，拓寬了JW-3蛋白酶在脫毛應用中的溫度范圍，提高了酶的穩(wěn)定性，有利于開展脫毛含酶廢液循環(huán)利用技術(shù)，進一步降低脫毛成本。

圖6 添加25%葡萄糖對JW-3蛋白酶熱穩(wěn)定性的影響Fig.6 The effect of adding 25%glucose on thermo stability of JW-3 protease

表4為JW-3蛋白酶的熱失活動力學參數(shù)，從表中可以看出，添加25%葡萄糖后JW-3蛋白酶的半衰期顯著提高，熱失活速率常數(shù)大幅度降低。當溫度高于40℃時添加25%葡萄糖的JW-3蛋白酶與未添加的JW-3蛋白酶相比其半衰期分別提高了1.00倍、2.60倍、1.25倍和2.13倍。

表4 JW-3蛋白酶熱失活動力學參數(shù)Tab.4 Kinetic parameters for thermal inactivation of JW-3 protease

3 結(jié)論

針對目前皮革企業(yè)酶法脫毛效果不穩(wěn)定、成本高的問題，本文研究了醇類、糖類和有機溶劑對脫毛用JW-3蛋白酶穩(wěn)定性的影響，經(jīng)單因素試驗篩選出了3種可顯著提高JW-3蛋白酶穩(wěn)定性的保護劑，響應面優(yōu)化后得到復合保護劑的配方為：山梨醇13%和葡萄糖25%。復合保護劑的添加可顯著提高JW-3蛋白酶（酶活保存率為85.73±1.28%）的穩(wěn)定性，與未添加任何保護劑（酶活保存率為23.90±1.20%）相比，50℃保存6 h后其酶活保存率提高了61.83%。但本文所研究的JW-3蛋白酶主要應用于皮革脫毛中，綜合考慮在今后皮革脫毛應用中的操作與成本，最終選擇25%的葡萄糖作為JW-3蛋白酶的熱穩(wěn)定保護劑。

本文考察了添加25%葡萄糖對JW-3蛋白酶熱穩(wěn)定性的影響。加入25%葡萄糖后JW-3蛋白酶的熱失活速率常數(shù)大幅度下降，且隨溫度的升高下降幅度變大，當溫度為45、50、55和60℃時，添加保護劑與未添加保護劑的JW-3蛋白酶相比半衰期分別提高了1.00倍、2.60倍、1.25倍和2.13倍。

本文篩選出的保護劑與JW-3蛋白酶結(jié)合應用在脫毛工藝中，可降低因高溫而造成的脫毛效果不穩(wěn)定的問題，并且添加保護劑后的JW-3蛋白酶在35℃水浴6 h酶活保存率仍在100%左右，可考慮開展JW-3蛋白酶循環(huán)利用脫毛工藝，該工藝可大大降低酶法脫毛中酶制劑的使用成本，提高皮革企業(yè)開展清潔化脫毛工藝的積極性和主動性。