皮革及其制品中三氯生的測定

閆杰，王成云，王飛，林君峰，劉志紅，沈雅蕾，張嘉麗，曾錦嫦，楊左軍,謝堂堂★

（1.深圳海關工業(yè)品檢測技術中心，廣東 深圳 518067;2.深圳市檢驗檢疫科學研究院，廣東 深圳 518010；3.深圳國際旅行衛(wèi)生保健中心，廣東 深圳 518033；4.深圳職業(yè)技術學院 應用化學與生物技術學院，廣東 深圳 518000）

0 引言

人們追求安全、清潔的高品質生活，但在使用皮革制品時很少進行專門的清洗，從而導致其表面污垢累積和細菌大量繁殖，因此皮革抗菌問題逐漸引起人們的關注[1]。皮革制品的生產經歷三個階段，第1個階段是準備工段，第2個階段是鞣制工段，包括鞣制、染色、加油等工序，第3個階段是整理工段，皮革被拉伸后進行切割，并在光滑表面上用各種涂飾劑進行處理以使其美觀，抗菌整理一般在第2個階段進行。皮革的膠原纖維以多孔型網狀形式存在，從而可讓抗菌劑滲透進入。膠原纖維本身含有羧基、氨基、亞氨基、羥基等多種極性基團，可與抗菌劑中的極性基團進行交聯(lián)。三氯生是一種常用的抗菌劑，大量用于紡織品、日化產品、皮革等產品的抗菌整理[2-7]。三氯生含有羥基，可通過乙二醛、戊二醛等二醛類助劑與皮革膠原纖維發(fā)生交聯(lián)，從而在皮革纖維中引入抗菌劑三氯生，賦予皮革抗菌性能[1]。

但是三氯生能干擾甲狀腺荷爾蒙的正常分泌，且對水生動植物有毒[8-10]。因此歐盟法規(guī)(EU)No.169/2010限制在紡織品中使用三氯生[11]，2010/675/EU指令禁止在消費品中使用三氯生[12]，歐盟生物殺滅產品法規(guī)(EU)No.528/2012限制在殺菌劑中使用三氯生[13]。2015年，歐洲化學品管理局正式全面禁用三氯生，2016年美國食品與藥品管理局(FDA)禁止在抗菌洗滌品中使用三氯生。目前已有大量文獻報道了紡織品、日化產品、印染助劑中三氯生的測定[14-25]，但只有周佳等采用超高效合相色譜法測定了皮革中的三氯生[26]，大部分實驗室均未配備合相色譜，極大地限制了該方法的應用。本文采用超聲萃取技術提取皮革及其制品中的三氯生，提取液經固相萃取柱凈化后進行超高效液相色譜/串聯(lián)質譜法(UPLC/MS-MS)測定，從而建立了1個皮革及其制品中三氯生含量的UPLC/MS-MS分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290 Infinity II-6495超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜儀(美國Agilent公司)，配Agilent 1290 Infinity II超高效液相色譜儀和Agilent 6495 Triple Quad三重四極桿串聯(lián)質譜儀；Retsch SM 200切割式織物研磨儀(德國Retsch公司)。

標準品：三氯生(純度99.5%)由德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司提供，用色譜純甲醇(美國Merck公司)配制成濃度為44.80μg/mL的標準儲備液。

陽性樣品：市售粒面牛皮革。

1.2 樣品前處理

選取有代表性的樣品，裁成小塊后，經Retsch切割式織物研磨儀磨成粉末。稱取1 g樣品，置于50 mL反應瓶中，加入25 mL乙醇，在45℃下超聲萃取30 min。過濾，濾液經固相萃取柱(已用5 mL乙醇進行預活化)凈化后，定容至25 mL，經濾膜過濾后進行UPLC/MS-MS分析。

1.3 分析條件

1.3.1 液相色譜條件

Agilent Eclipse Plus C18RRHD色譜柱(150 mm×2.1 mm×3.5μm)，等梯度洗脫，流動相為甲醇/水=90/10，流速為0.25 mL/min，柱溫為40℃，進樣量為5μL。

1.3.2 質譜條件

毛細管電壓為-3500V，碰撞氣為高純氮氣（純度＞99.999%），吹掃氣和鞘氣均為氮氣，流速均為11 L/min，吹掃氣和鞘氣溫度分別為250℃、350℃。EI離子源，負離子掃描模式，動態(tài)MRM監(jiān)測模式，保留時間為tR=4.194 min，ΔtR=2%tR。離子對分別為m/z 286.7→m/z 35.0（定量離子對）、m/z 286.7→m/z 142.1。碰撞電壓均為-35V，池加速電壓均為3 V。

2 結果與討論

2.1 凈化條件選擇

皮革樣品基質復雜，在萃取過程中，大量雜質伴隨待測組分一起被萃取出來，嚴重干擾待測組分的測定，因此必須進行凈化處理。固相萃取柱凈化是一種常見的凈化處理手段，經固相萃取柱凈化后，會損失部分目標分析物，且凈化處理過程也有可能會引入新的雜質。在不含三氯生的皮革萃取液中加入三氯生標準溶液，然后分別用Waters Sep-Pak Vac Silica柱（1 g/6 mL）、Waters Sep-Pak Vac C18柱（0.5g/3mL）、Cleanert PA SPE柱（1g/6mL）、Anpelclean PA SPE柱（1g/6mL）、Supelclean LC-PH Tubes柱(0.5g/3mL)、CNW Bond Alumina-N SPE Cartridge柱(1g/6mL)、Supelclean ENVI-18 Tubes柱（0.5g/3mL）、Varian HF C18柱（2g/12mL）、Agilent Si柱（1g/6mL）、Agilent Al-N柱（0.5g/3mL）、Varian Bond Elut SCX柱（0.5g/3mL）等11種常見固相萃取柱對萃取液進行凈化，測定凈化后三氯生的峰面積，并與未過柱凈化的同一濃度的三氯生標準溶液的峰面積進行比較，各萃取柱的回收率分別為66.00、79.65、80.57、81.87、84.58、10.21、87.47、70.48、78.71、81.82、99.59%。選擇回收率最高的Varian Bond Elut SCX柱（0.5g/3mL）作為凈化柱。

2.2 超聲萃取條件選擇

決定超聲萃取效率的因素有5個：萃取溶劑種類、萃取溶劑體積、萃取時間、萃取溫度和萃取方式。首先以甲醇為萃取溶劑，超聲萃取1個市售陽性樣品中的三氯生，分別考察萃取溫度(A)、萃取時間(B)、萃取溶劑體積(C)三個因素對萃取量的影響。萃取溫度分別為35、40、45、50、55、60℃，用25 mL甲醇萃取30 min，萃取量分別為28.64、35.76、39.39、39.17、39.03、38.78 mg/kg，在45℃時達到最大值。萃取時間分別為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 min，45℃下用25 mL甲醇萃取，萃取量分別為16.93、20.75、28.54、33.67、36.42、39.39、36.28、35.79、35.46、35.34、34.87、34.52 mg/kg，在30 min時達到最大值。分別以15、20、25、30、35 mL甲醇作為萃取溶劑，45℃下萃取30 min，萃取量分別為24.68、37.21、39.39、36.74、35.45 mL，在25 mL時達到最大值。因此設計了如表1所示的正交試驗來綜合考察3個因素對萃取量的影響，在表1給出的9個實驗條件下分別進行超聲萃取，萃取量也列于表1中。根據表1中的數據，分別計算3個因素的k值和極差，確定優(yōu)方案為A1B1C1。在此條件下，分別以甲醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯/二氯甲烷(1∶1，V/V)、乙酸乙酯、乙醇、叔丁基甲醚、石油醚等8種常見溶劑作為萃取溶劑對陽性樣品進行超聲萃取，其萃取量分別為39.39、31.59、34.34、27.50、20.69、45.13、17.45、16.45 mg/kg。由此可見，乙醇的萃取效果最好。以25 mL乙醇為萃取溶劑，在優(yōu)方案給定的萃取條件下對陽性樣品進行連續(xù)3次超聲萃取，第1、2、3次萃取量分別為45.13、1.74、0.31 mg/kg。第1次萃取量占總萃取量的95.65%，因此最終選擇1次超聲萃取方式。

表1 正交實驗結果

2.3 分析條件優(yōu)化

分別采用甲醇/水、乙腈/水作為流動相進行分析，結果發(fā)現(xiàn)，使用甲醇/水作為流動相時，三氯生的響應值明顯較大。在水相中分別加入0.1%甲酸、0.01 mol/L甲酸銨、0.01 mol/L乙酸銨，觀察響應值的變化，結果發(fā)現(xiàn)，三氯生的響應反而變小。因此，選擇甲醇/水作為流動相。

以甲醇/水作為流動相，考察不同柱溫、流速、洗脫梯度下三氯生響應值的變化，結果發(fā)現(xiàn)，當采用1.3節(jié)給出的分析條件時，三氯生譜峰尖銳，對稱性好。

根據三氯生分子結構可知三氯生在負離子模式下有較高的響應值，經ESI-電離產生特征離子峰[M-H]-為母離子峰，三氯生的母離子為m/z 286.70。以質量濃度為112 ng/mL的三氯生標準溶液為對象，對質譜條件進行優(yōu)化。在碰撞電壓分別為10、30、50、70 V的條件下，用高純氮氣對母離子m/z 286.70進行碰撞，各產生一系列的二級子離子。母離子與其產生的1個二級子離子組成1個離子對。選擇4個豐度較高的離子對利用Optimizer優(yōu)化軟件進一步細致優(yōu)化碰撞能量。細致優(yōu)化時，碰撞電壓從1 V逐步增加至79 V，增長步長為2 V。觀察各離子對在不同碰撞電壓下響應值的變化情況，選擇豐度最大時的電壓作為優(yōu)化后的碰撞電壓。進行動態(tài)MRM監(jiān)測時，為了最大限度地利用離子的駐留時間,保證每個峰都能獲得足夠的數據點，只在化合物離子出峰前后的時間段內對該化合物的離子進行質譜掃描,從而在保持恒定循環(huán)時間的同時增強了分析物的信噪比,獲得更高的靈敏度[27]。本實驗中，質譜掃描時間段為ΔtR=2%tR。確定優(yōu)化碰撞電壓后，對毛細管電壓、鞘氣溫度、鞘氣流速、吹掃氣溫度、吹掃氣流速等參數進行優(yōu)化,通過單因素實驗的方法,確定優(yōu)化后的條件。

在確定的優(yōu)化條件下對質量濃度為84 ng/mL的三氯生標準溶液進行分析，UPLC/MS-MS譜圖見圖1，在tR=4.194 min處出現(xiàn)1個對應于三氯生的尖銳譜峰。

圖1 三氯生標準溶液的UPLC/MS-MS圖

2.4 方法的線性范圍和定量下限

用甲醇對三氯生標準溶液進行稀釋，配制質量濃度(ρ)分別為7、14、28、56、84、112、168、224、336、448 ng/mL的標準工作液，按1.3節(jié)給定的分析條件進行測試，峰面積(A)分別為6698、10015、17482、31349、45832、62103、91467、119977、181975、233783。用峰面積(A)對質量濃度(ρ)作圖，結果發(fā)現(xiàn)，當三氯生的質量濃度(ρ)為7～448 ng/mL時，峰面積(A)與質量濃度(ρ)之間存在良好的線性關系，線性方程為A=521.71ρ+3011.2，線性相關系數為0.9998。按10倍信噪比(S/N=10)來計算定量下限，儀器的定量下限為4μg/kg，方法的定量下限為0.1 mg/kg。

2.5 方法的回收率和精密度

以不含三氯生的牛皮革、豬皮革和羊皮革為基質，分別添加3個不同質量濃度的三氯生標準溶液(28、84、224 ng/mL)，制備成測試樣，每個添加濃度水平各制備9個測試樣，測定每個測試樣的三氯生回收率，結果見表2。平均加標回收率為81.94%～94.89%，相對標準偏差為3.93%～11.73%。

表2 回收率與精密度實驗

2.6 實際樣品測試

采用建立的方法對69個市售皮革及其制品進行測試，結果在1個粒面牛皮革中檢出三氯生，其含量為45.11 mg/kg。圖2是該樣品的UPLC/MS-MS圖，在圖2中，在tR=4.193 min處出現(xiàn)1個對應于三氯生的尖銳譜峰。

圖2 1個陽性樣品的UPLC/MS-MS圖

3 結論

建立了1個測定皮革及其制品中三氯生含量的UPLC/MS-MS方法，該方法簡便快捷，靈敏度高，定量下限低至0.1 mg/kg，可完全滿足皮革及其制品中三氯生含量檢測工作的需要。