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    雙功能碳點(diǎn)用于葡萄糖的比色/比率熒光測定

    2021-08-16 05:14:08袁春玲姚曉條徐遠(yuǎn)金成詩琦王益林
    關(guān)鍵詞:葡萄糖氧化酶比色過氧化物

    袁春玲,姚曉條,徐遠(yuǎn)金,覃 秀,石 睿,成詩琦,王益林

    (廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,廣西電化學(xué)能源材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南寧 530004)

    葡萄糖是生物活動(dòng)中主要的能量來源和代謝中間體,在生命運(yùn)行過程中起著重要作用,血糖水平異常通常被認(rèn)為與糖尿病、低血糖及代謝紊亂等疾病有關(guān)[1,2].因此,快速和準(zhǔn)確測定血清中葡萄糖的濃度對(duì)疾病診斷具有重要意義.目前,色譜分析[3,4]、電分析[5,6]和光分析[7,8]等檢測技術(shù)已被應(yīng)用于葡萄糖的測定.因具有響應(yīng)快、成本低和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),比色和熒光等光分析技術(shù)備受關(guān)注[7].隨著納米科技的不斷發(fā)展,各種納米材料在光分析領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛.一些金屬氧化物[9]、金屬硫化物[10]及貴金屬[11]納米材料因具有類過氧化物酶特性,可催化H2O2氧化3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)而用于葡萄糖的比色測定.因吸收譜帶寬和摩爾吸光系數(shù)大,MnO2納米片可有效猝滅稀土納米顆粒(NaYF4∶Yb,Tm@NaYF4nanoparticles)[12]及銅納米簇(Copper nanoclusters)[13]的熒光;而H2O2的加入可將MnO2還原為Mn2+,使被猝滅的熒光得到恢復(fù).結(jié)合葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化生成H2O2的原理,上述納米材料已用于構(gòu)建測定葡萄糖濃度的“off-on”型熒光探針.迄今,采用比色或熒光法測定葡萄糖的研究報(bào)道較多,但鮮見同時(shí)用這2種方法測定葡萄糖的報(bào)道[14,15].研究[14,15]表明,ZnFe2O4磁性微球、Pd納米顆粒能催化H2O2氧化鄰苯二胺(OPD)生成能發(fā)熒光的黃色產(chǎn)物2,3-二氨基吩嗪(DAP);DAP的存在會(huì)導(dǎo)致硼和氮共摻雜的碳點(diǎn)(B,N-CDs)、C3N4納米片的熒光猝滅.據(jù)此,Li[14]和Qiu課題組[15]分別發(fā)展了一種基于比色和比率熒光的雙信號(hào)葡萄糖測定新方法,均用到了2種納米(或微米)材料.

    與其它納米材料相比,CDs具有制備簡單、穩(wěn)定性高、生物相容性好及發(fā)光能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[16].作為類過氧化物酶或熒光納米材料,CDs在生化分析及細(xì)胞成像等研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[17~22],但同時(shí)具有類過氧化物酶活性和熒光發(fā)射特性的雙功能CDs的報(bào)道較少[23~25].采用苦楝樹葉(Azadirachta indica leaves)[23]和芥菜種子(Mustard seeds)[24]等生物質(zhì)材料制備的CDs既能發(fā)射熒光,也能催化H2O2氧化TMB,但相關(guān)研究只將其催化功能應(yīng)用于H2O2和抗壞血酸的測定;以有機(jī)胺和硝酸鐵為反應(yīng)物可制備雙功能的鐵、氮共摻雜CDs,該雙功能CDs可用于黃嘌呤的比色/比率熒光測定[25].元素?fù)诫s不僅能夠提高CDs的熒光量子產(chǎn)率,而且可以改變CDs的內(nèi)部電子環(huán)境,賦予CDs新的功能,拓寬其應(yīng)用領(lǐng)域[26].基于鐵元素在過氧化物酶中的關(guān)鍵作用和氮摻雜能改善CDs的熒光特性,本文以生物質(zhì)(合果芋葉片)、十二水合硫酸鐵銨和脲為起始物,通過水熱法制備了鐵、氮共摻雜的CDs(Fe,N-CDs),所得Fe,N-CDs既具有類過氧化物酶活性,也能在450 nm處產(chǎn)生強(qiáng)熒光發(fā)射(圖1).基于Fe,N-CDs的雙功能特性,建立了一種比色/比率熒光測定葡萄糖濃度的方法,并成功應(yīng)用于實(shí)際樣品分析.

    Fig.1 Preparation and properties of Fe,N-CDs

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 試劑與儀器

    十二水合硫酸鐵銨[NH4Fe(SO4)2·12H2O]、脲(N2HCONH2)、三水合乙酸鈉、冰醋酸和過氧化氫(廣東光華科技股份有限公司);葡萄糖、苯丙氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、色氨酸和絲氨酸(天津市大茂化學(xué)試劑廠);鄰苯二胺(OPD,上海阿拉丁試劑有限公司);葡萄糖氧化酶(北京索萊寶科技有限公司).所用試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為去離子水.

    RF-5301PC型熒光分光光度計(jì)(日本島津公司);UV-4802型紫外-可見分光光度計(jì)(上海龍尼柯公司);Tecnai G2 F20 S-Twin型透射電子顯微鏡(美國FEI公司);Nicolet iS5型傅里葉變換紅外光譜儀(美國賽默飛世爾公司);FLS1000型熒光光譜儀(英國愛丁堡公司).

    1.2 Fe,N-CDs的制備

    將合果芋葉片洗凈,晾干表面的濕存水后剪碎,稱取2.0 g置于75 mL反應(yīng)釜中,加入0.8 g NH4Fe(SO4)2·12H2O,0.2 g N2HCONH2和25 mL去離子水,混合均勻后密封;將反應(yīng)釜置于180℃恒溫干燥箱中加熱6 h.待自然冷卻至室溫后,先用漏斗過濾,得深棕色溶液;再用0.22μm微濾膜去除溶液中的大顆粒聚集物;將反應(yīng)溶液透析24 h以除去未反應(yīng)的試劑,收集袋內(nèi)溶液并定容到25 mL,保存于4℃冰箱中備用.

    1.3 H2O2和葡萄糖的測定

    H2O2的測定:在系列比色管中,依次加入0.5 mL不同濃度的H2O2溶液、0.5 mL 17.5 mmol/L OPD溶液和100μL Fe,N-CDs溶液,混合均勻后,用pH=5.4的HAc-NaAc(0.2 mol/L)緩沖溶液定容到5.0 mL,置于40℃水浴中反應(yīng)25 min.分別在330~550 nm范圍內(nèi)掃描其吸收光譜,在360 nm波長光的激發(fā)下記錄熒光光譜,實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行3次.

    葡萄糖的測定:在系列比色管中,依次加入0.5 mL 10 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4(pH=7.0)緩沖溶液、0.5 mL不同濃度的葡萄糖溶液和0.1 mL 2.0 mg/mL葡萄糖氧化酶,混合均勻后,在37℃水浴中培育30 min使之產(chǎn)生H2O2;隨后,加入0.5 mL 17.5 mmol/LOPD溶液和100μL Fe,N-CDs溶液,并用0.2 mol/L HAc-NaAc緩沖溶液(pH=5.4)定容到5.0 mL,混合均勻,后續(xù)過程與H2O2的測定相同,實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行3次.

    2 結(jié)果與討論

    2.1 Fe,N-CDs的表征

    采用透射電子顯微鏡(TEM)對(duì)Fe,N-CDs的形貌和顆粒尺寸進(jìn)行表征.由圖2(A)可見,F(xiàn)e,N-CDs呈近似球狀,分散性好;從高分辨透射電子顯微鏡照片(插圖)中可見清晰的晶格條紋,間距為0.23 nm,與石墨烯(100)面相對(duì)應(yīng)[27].根據(jù)Nano Measurer軟件分析表明[圖2(B)],F(xiàn)e,N-CDs的粒徑主要分布在1.34~3.68 nm范圍內(nèi),平均粒徑約為2.51 nm.

    Fig.2 TEMimage(A)and particle size distribution diagram(B)of Fe,N-CDsInset of(A)is the relative HRTEM image.

    在365 nm紫外燈照射下,F(xiàn)e,N-CDs發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光[圖3(A)插圖].當(dāng)激發(fā)波長從310 nm增加到440 nm時(shí),F(xiàn)e,N-CDs的熒光發(fā)射峰從427 nm紅移到472 nm;熒光強(qiáng)度呈先升后降趨勢;用360 nm波長的光激發(fā)時(shí),熒光發(fā)射最強(qiáng)[圖3(A)].這種激發(fā)依賴的發(fā)射行為與顆粒的表面缺陷及顆粒大小有關(guān)[27].Fe,N-CDs溶液在紫外區(qū)具有較強(qiáng)的光吸收,270 nm處的吸收峰歸因于C=C或C=N的π-π*躍遷[28](見本文支持信息圖S1).采用傅里葉變換紅外光譜(FTIR)分析了Fe,N-CDs所含的基團(tuán)[圖3(B)],3150 cm-1處的寬峰歸屬為O—H和N—H的伸縮振動(dòng),1630 cm-1處的峰歸屬為C=O和C=C的伸縮振動(dòng),1400和1120 cm-1處的峰分別歸屬為C—OH和C—O—C的伸縮振動(dòng).FTIR分析表明,F(xiàn)e,N-CDs表面存在—COOH,—OH和—NH2等親水基團(tuán),從而使其具有良好的水溶性.

    Fig.3 Emission spectra of Fe,N-CDs excited at 310—440 nm(A)and FTIR spectrum of Fe,N-CDs(B)

    采用X射線光電子能譜(XPS)對(duì)Fe,N-CDs的元素組成和所含官能團(tuán)進(jìn)行了表征.從全掃描譜圖(圖4)可以看出,CDs主要由碳(44.02%)、氮(13.41%)、氧(39.98%)和鐵(2.59%)4種元素組成,結(jié)合能分別為284.8,401.3,531.5和710.7 eV.C1s的高分辨XPS譜圖含有284.7,286.1和288.3 eV 3個(gè)峰,分別對(duì)應(yīng)C=C,C=O和O—C=O官能團(tuán)[29].N1s的高分辨XPS譜圖顯示出399.8和401.5 eV 2個(gè)峰,分別對(duì)應(yīng)C—N—C和N—H官能團(tuán)[30].O1s的高分辨XPS譜圖中有531.3和532.4 eV2個(gè)峰,分別歸屬于C—OH/C—O—C和C=O鍵[31].Fe2p譜圖含有710.7,714.1,724.7和727.6 eV 4個(gè)峰,分別對(duì)應(yīng)于[見本文支持信息圖S2(A)~(D)].以上結(jié)果表明,F(xiàn)e和N 元素確已摻雜到CDs中;Fe,N-CDs表面具有豐富的含O和含N官能團(tuán).

    Fig.4 Survey spectrum of Fe,N-CDs

    2.2 Fe,N-CDs的催化活性及葡萄糖雙信號(hào)測定機(jī)理

    為研究Fe,N-CDs的類過氧化物酶活性,在pH=5.4的HAc-NaAc緩沖溶液中進(jìn)行了對(duì)照實(shí)驗(yàn).含F(xiàn)e,N-CDs和OPD的溶液呈無色,UV-Vis譜圖中無吸收峰[圖5(A)譜線a];含H2O2和OPD的溶液在420 nm處有1個(gè)弱吸收峰[圖5(A)譜線b],其溶液呈淡黃色,說明H2O2可以緩慢地將OPD氧化為DAP;當(dāng)Fe,N-CDs存在時(shí),含H2O2和OPD的溶液在420 nm處有1個(gè)強(qiáng)吸收峰[圖5(A)譜線c],其溶液呈深黃色.以上數(shù)據(jù)表明,F(xiàn)e,N-CDs具有類過氧化物酶活性,能催化H2O2氧化OPD的反應(yīng).

    DAP溶液呈黃色,其吸收峰位于420 nm處;在360 nm波長光的激發(fā)下,F(xiàn)e,N-CDs的熒光發(fā)射峰位于450 nm處.由圖5(B)可見,DAP的吸收光譜與Fe,N-CDs的熒光光譜有較大重疊;二者共存時(shí),可通過熒光內(nèi)濾效應(yīng)(IFE)或熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FREF)導(dǎo)致Fe,N-CDs的熒光猝滅.加入Fe,N-CDs前后,DAP吸收峰的位置和吸收強(qiáng)度幾乎無變化[見本文支持信息圖S3(A)],說明Fe,N-CDs與DAP之間并未形成配合物,即Fe,N-CDs與DAP之間不可能發(fā)生FRET[33].此外,加入DAP前后,F(xiàn)e,N-CDs的熒光壽命未發(fā)生明顯變化[見本文支持信息圖S3(B)],說明Fe,N-CDs與DAP之間無電荷轉(zhuǎn)移,故Fe,NCDs的熒光猝滅并非電荷轉(zhuǎn)移所致[14].因此,二者共存時(shí),F(xiàn)e,N-CDs的熒光猝滅是因IFE所致.

    Fig.5 Absorbance spectra of different solutions in 0.2 mol/L HAc-NaAc buffer solution at pH=5.4(A)and absorbance spectrum of DAP and emission spectrum of Fe,N-CDs(B)Inset of(A)shows the corresponding photograph.

    Fe,N-CDs可催化H2O2氧化OPD生成DAP;經(jīng)360nm波長光激發(fā),DAP在550 nm處有1個(gè)熒光發(fā)射峰,而在同一波長光的激發(fā)下,F(xiàn)e,N-CDs在450 nm處也有熒光發(fā)射峰;DAP通過IFE而猝滅Fe,N-CDs的熒光.即在Fe,N-CDs/OPD體系中加入H2O2,不僅引起溶液顏色的變化,也會(huì)導(dǎo)致DAP和Fe,N-CDs相對(duì)熒光強(qiáng)度的變化;隨著H2O2濃度的增加,DAP在420 nm處的吸光度和550 nm處的熒光強(qiáng)度均增加,而Fe,N-CDs在450 nm處的熒光強(qiáng)度則降低.通過測定DAP在420 nm處的吸光度及DAP與Fe,NCDs的熒光強(qiáng)度比(I550/I450)可確定H2O2濃度;而H2O2又是葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化的產(chǎn)物之一.據(jù)此,可進(jìn)一步建立比色/比率熒光雙信號(hào)葡萄糖測定方法(圖6).

    2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

    為獲得最佳的信號(hào)響應(yīng),以相對(duì)熒光強(qiáng)度I550/I450(其中I550和I450分別表示550和450 nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度)為指標(biāo),考察了pH、溫度、反應(yīng)時(shí)間及OPD濃度等因素對(duì)Fe,N-CQDs催化H2O2氧化OPD反應(yīng)的影響.考慮到類過氧化物酶通常在弱酸性條件下表現(xiàn)出較強(qiáng)的催化活性,以HAc-NaAc緩沖液為介質(zhì),在5.0~6.2的pH值范圍內(nèi)考察了介質(zhì)酸度對(duì)I550/I450值的影響.由圖S4(A)(見本文支持信息)可見,隨著pH的升高,I550/I450值呈現(xiàn)先增后減的變化規(guī)律,且當(dāng)pH=5.4時(shí),I550/I450值最大.因此,實(shí)驗(yàn)選擇在pH=5.4的HAc-NaAc緩沖液中進(jìn)行.常溫下,F(xiàn)e,N-CDs催化OPD氧化的速度較慢,反應(yīng)體系的顏色變化不明顯.圖S4(B)(見本文支持信息)示出了Fe,N-CDs/H2O2/OPD混合液經(jīng)30~60℃水浴孵育后,測得的I550/I450值與溫度變化的關(guān)系,可見,40℃是比較適宜的溫度.隨著反應(yīng)時(shí)間的延長,I550/I450值也隨之增大,在25 min時(shí)基本達(dá)到穩(wěn)定[見本文支持信息圖S4(C)],為保證獲得最大熒光比和穩(wěn)定的信號(hào)響應(yīng),選擇25 min作為最佳反應(yīng)時(shí)間.隨著OPD濃度的增大,I550/I450值逐漸增大,當(dāng)濃度為1.75 mmol/L時(shí)I550/I450值趨于平穩(wěn)[見本文支持信息圖S4(D)].最終選定的實(shí)驗(yàn)條件為pH=5.4,溫度40℃,反應(yīng)時(shí)間25 min,1.75 mmol/L OPD.

    Fig.6 Schematic diagram of detection principle

    2.4 H2O2和葡萄糖的比色/比率熒光雙信號(hào)檢測

    在優(yōu)化的條件下,考察了H2O2濃度對(duì)體系吸收與熒光光譜的影響.紫外-可見吸收光譜測定結(jié)果表明,當(dāng)H2O2濃度從1.0μmol/L增加到300μmol/L時(shí),DAP在420 nm處特征吸收峰的波長不變,吸收強(qiáng)度逐漸增大[見本文支持信息圖S5(A)];且420 nm處的吸光度值(A420)與H2O2濃度呈良好的線性關(guān)系[見本文支持信息圖S5(B)],線性方程為A420=0.0039cH2O2+0.0087,相關(guān)系數(shù)為0.996.熒光測定結(jié)果表明,隨著H2O2濃度的升高,DAP在550 nm處的熒光逐漸增強(qiáng),而Fe,N-CQDs在450 nm處的熒光則逐漸減弱[見本文支持信息圖S5(C)].H2O2濃度在1.0~80μmol/L范圍內(nèi),I550/I450值與H2O2濃度之間呈良好的線性關(guān)系[見本文支持信息圖S5(D)],線性方程為I550/I450=0.0039cH2O2+0.2606,相關(guān)系數(shù)為0.998.比色和比率熒光法的檢出限(3σ/k)分別為0.7和0.6μmol/L,表明方法具有較高的靈敏度.

    葡萄糖經(jīng)葡萄糖氧化酶催化氧化后會(huì)產(chǎn)生H2O2,據(jù)此,可進(jìn)一步建立雙信號(hào)測定葡萄糖的方法.圖7(A)顯示了依賴于葡萄糖濃度的DAP的吸收光譜.隨著葡萄糖濃度的增加,420 nm處的吸光度逐漸增大;在1.0~100μmol/L濃度范圍內(nèi),DAP的吸光度與葡萄糖濃度呈良好的線性關(guān)系[圖7(B)],回歸方程為A420=0.0038cglucose+0.0142(R2=0.991).從圖7(C)可以看出,隨著葡萄糖濃度的增加,DAP在550 nm處的熒光強(qiáng)度增大,而Fe,N-CDs在450 nm處的熒光強(qiáng)度降低;在1.0~100μmol/L濃度內(nèi),I550/I450值與葡萄糖濃度成正比[圖7(D)],回歸方程為I550/I450=0.0039cglucose+0.2237(R2=0.998).比色和比率熒光法的檢出限分別為0.8和0.6μmol/L,表明方法具有較高的靈敏度.方法的線性范圍和檢出限優(yōu)于或可比于已報(bào)道的方法(表1);且最終檢測液顏色隨葡萄糖濃度的升高而加深[圖7(B)插圖],裸眼可辨別的最低濃度為5.0μmol/L,本方法可實(shí)現(xiàn)低濃度葡萄糖的可視化檢測.

    Fig.7 Absorption(A)and emission(C)spectra of Fe,N-CDs-OPD with different concentrations of glucose,linear relationship between A420 and glucose concentration(B)and linear relationship between I550/I450 and glucose concentration(D)Inset of(B)is the photograph of the solutions corresponding to(A).

    Table 1 Comparison of different methods for detecting glucose

    2.5 方法的選擇性

    為評(píng)價(jià)方法的選擇性,選取血清中常見的金屬離子如Na+,K+,Mg2+,Zn2+及系列氨基酸[苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、異亮氨酸(Ile)、蘇氨酸(Thr)、天冬氨酸(Asp)、色氨酸(Trp)、纈氨酸(Val)和絲氨酸(Ser)]作為干擾物代替葡萄糖,經(jīng)培育、顯色后分別測定吸收與熒光信號(hào).圖8(A)和(B)分別示出了葡萄糖(Glu)濃度為0.1 mmol/L,各干擾物濃度均為1.0 mmol/L時(shí)的比色和比率熒光響應(yīng)情況.盡管各干擾物的濃度是葡萄糖濃度的10倍,但只有葡萄糖能引起2種分析信號(hào)的顯著變化,這與葡萄糖氧化酶的高選擇性有關(guān).因此,該方法的選擇性良好.

    Fig.8 Selectivities of colorimetric(A)and ratio fluorescence for glucose detection(B)The concentration of glucose was 0.1 mmol/L,of other substances was 1.0 mmol/L.a.Glu;b.blank;c.Na+;d.K+;e.Zn2+;f.Mg2+;g.Phe;h.Glycine;i.Ile;j.Thr;k.Asp;l.Try;m.Val;n.Ser.

    2.6 實(shí)際樣品分析

    為驗(yàn)證方法的可行性,對(duì)人體血清中葡萄糖的含量進(jìn)行了測定.取0.8 mL血清樣品加入0.8 mL三氯乙酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%),在10000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min,去除血清蛋白.向反應(yīng)體系中加入0.1 mL處理過的血清和不同濃度的葡萄糖,按1.3節(jié)步驟測定,結(jié)果見表2.樣品檢測液中葡萄糖濃度的比色法測定值分別為40.2和35.9μmol/L,根據(jù)稀釋比,計(jì)算得出原樣中葡萄糖的濃度分別為4.02和3.59 mmol/L,與臨床測定結(jié)果(4.53和3.86 mmol/L)基本吻合,均在正常值范圍內(nèi).此外,比色法與比率熒光法測定結(jié)果一致;回收率為93.3%~111.5%;RSD在0.4%~6.8%之間,說明方法的準(zhǔn)確度和精密度高,可應(yīng)用于實(shí)際樣品分析.

    Table 2 Detection of glucose in human serum*

    3 結(jié) 論

    以生物質(zhì)(合果芋葉片)、含鐵和含氮物質(zhì)為起始物,制備了具有類過氧化物酶活性和熒光特性的雙功能Fe,N-CDs.在Fe,N-CDs和OPD混合溶液中加入H2O2后,F(xiàn)e,N-CDs能催化H2O2氧化OPD生成能發(fā)射熒光的DAP,DAP和Fe,N-CDs形成雙發(fā)射體系,體系的相對(duì)熒光強(qiáng)度及DAP的吸光度受H2O2濃度的調(diào)節(jié).結(jié)合葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化產(chǎn)生H2O2的原理,發(fā)展了一種比色/比率熒光雙信號(hào)測定葡萄糖的分析方法.該方法具有靈敏度高、選擇性好的特點(diǎn),應(yīng)用于人體血清中葡萄糖的測定,其結(jié)果與臨床測定值相吻合.與已報(bào)道的雙信號(hào)葡萄糖測定方法相比,本方法只需制備一種納米材料.

    支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20210019.

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