GYS2與p53抑制HBV相關(guān)肝癌的研究

趙新軍，李 循，王書恒，李九智

(1.伊犁師范大學(xué)新疆凝聚態(tài)相變與微結(jié)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室，伊寧 835000；2.伊犁師范大學(xué)微納電傳感器技術(shù)與仿生器械實(shí)驗(yàn)室，伊寧 835000；3.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科，烏魯木齊 830000)

1 引 言

乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)常誘發(fā)肝癌(HCC)，HBV或HCV感染后造成肝細(xì)胞基因改變，引起肝臟病變，誘導(dǎo)HCC的發(fā)生發(fā)展[1-3].流行病學(xué)調(diào)查表明[3]，HCC的發(fā)生多半與乙肝病毒x蛋白(HBx)引發(fā)的炎癥和代謝異常密切相關(guān).新興的證據(jù)也表明[4，5]，葡萄糖代謝異常已經(jīng)成為了癌癥的重要標(biāo)志之一.糖原是葡萄糖的支鏈聚合物，存儲于肌肉和肝臟中，可在需要時(shí)用于能量供應(yīng)[6，7].近來的研究發(fā)現(xiàn)[8-10]，在人類腫瘤細(xì)胞中存在異常的糖原含量，例如，在低糖原組織(如乳房，卵巢，腎和肺)癌細(xì)胞中的糖原含量增加，而在HCC細(xì)胞中，糖原濃度與肝臟腫瘤生長呈負(fù)相關(guān).另外，由于糖原解支酶AGL的喪失，導(dǎo)致的糖原減少，還會(huì)誘導(dǎo)膀胱癌的發(fā)生[11].

糖原合酶(GS)是糖原合成中的關(guān)鍵酶，GS在人體組織中有兩種同工型，糖原合酶1(GYS1)和糖原合酶2(GYS2)[12].諸多的研究證據(jù)表明[13，14]，GYS1通常在肌肉、心臟和腎臟中表達(dá)，而GYS2的表達(dá)則主要限于肝臟中.作為糖原生物合成的限速酶，GS催化將UDP葡萄糖添加到現(xiàn)有的葡萄糖分子上，以延長線性葡萄糖聚合物鏈.研究表明[15]，在髓樣白血病細(xì)胞增殖過程中，GYS1不僅可以降低糖酵解通量，而且增加了糖原反應(yīng)性AMPK(AMP激酶)的激活，從而顯著抑制白血病細(xì)胞生長.在肝臟糖原合成中，GYS2則起著重要的調(diào)控作用，研究發(fā)現(xiàn)[16-18]，GYS2可以刺激肝臟中糖原合成，有助于將血糖水平維持在一定范圍內(nèi)，GYS2基因突變會(huì)引起糖原合酶缺乏癥.最近，Chen等人[19]的研究發(fā)現(xiàn)，在HCV誘發(fā)HCC進(jìn)程中，GYS2與p53協(xié)同限制HCC細(xì)胞生長和增殖，GYS2的敲減則會(huì)調(diào)低p53的表達(dá)，促進(jìn)HCC細(xì)胞生長增殖.在HCV誘發(fā)的HCC進(jìn)程中，GYS2被糖原合酶激酶3β(GSK3β)磷酸化和抑制，被6-磷酸葡萄糖(G6P)變構(gòu)激活[20，21]，并在肝糖原合成的晝夜節(jié)律中由CLOCK基因調(diào)控轉(zhuǎn)錄[22].

p53蛋白是細(xì)胞內(nèi)最重要的腫瘤抑制因子之一[23]，在響應(yīng)應(yīng)激信號的過程中，p53介導(dǎo)細(xì)胞對多種遺傳毒性和生長脅迫作出反應(yīng)，包括DNA損傷和致癌性侵害.激活的p53可以增加許多基因的表達(dá)，并引發(fā)細(xì)胞暫時(shí)的細(xì)胞分裂周期停滯，永久性細(xì)胞衰老和凋亡性細(xì)胞死亡，以防止受損或受壓的細(xì)胞繼續(xù)增殖.通常認(rèn)為，逃避p53介導(dǎo)的檢查點(diǎn)途徑是大多數(shù)(不是全部)腫瘤類型發(fā)展的必要步驟[24，25].同樣重要的是，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、乳腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞中，p53可以通過誘導(dǎo)糖原蓄積的方式，抑制細(xì)胞過早衰老和腫瘤生長[26].在HCV誘發(fā)HCC進(jìn)程中，p53通過帶有GYS2的負(fù)反饋回路，限制HBV相關(guān)的HCC細(xì)胞生長增殖[19].

深刻理解GYS2與p53協(xié)同作用，抑制HBV相關(guān)的HCC基因表達(dá)的信號通路，對于設(shè)計(jì)阻止HBV引起的HCC治療方案是非常重要的.實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果[19，26]為糖原代謝失調(diào)誘發(fā)的HCC臨床治療提供了新的治療靶點(diǎn).之前的理論[27-32]在激活基因通路研究方面已經(jīng)取得了重要的成果，并定量揭示了腫瘤抑制的物理機(jī)制.在GYS2與p53協(xié)同作抑制HBV相關(guān)的HCC進(jìn)程中，HBx、HDAC1與乙?；膒53(p53AC)形成復(fù)合體，并抑制GYS2表達(dá)；GYS2通過調(diào)控增強(qiáng)p53蛋白的穩(wěn)定性，抑制HCC的發(fā)生發(fā)展[19].p53已被證實(shí)了在抑制癌變過程中起著重要的作用[23-26].那么，GYS2與p53是如何協(xié)同調(diào)控HBV相關(guān)的HCC的發(fā)生發(fā)展，當(dāng)前仍然沒有相關(guān)理論或模擬研究揭示其深刻的物理機(jī)制，在HBV誘導(dǎo)HCC的發(fā)生發(fā)展過程中，糖原代謝的改變和潛在的分子機(jī)制仍然未知.

鑒于文獻(xiàn)[19]中新穎而重要的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在本文中，將建立動(dòng)力學(xué)理論模型，研究GYS2與p53抑制HBV相關(guān)的HCC進(jìn)展的動(dòng)力學(xué)機(jī)制，分析GYS2與p53的調(diào)控作用，進(jìn)一步深刻揭示GYS2與p53調(diào)控HBV相關(guān)的HCC的抑癌機(jī)理，為設(shè)計(jì)阻斷乙型肝炎向HCC轉(zhuǎn)變的通路治療方案提供理論依據(jù).

2 理論模型

Chen等人的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)[19]，GYS2與p53通過負(fù)反饋抑制HBV相關(guān)的HCC進(jìn)程中，HBx、HDAC1與p53AC形成復(fù)合體，抑制GYS2表達(dá)；抑制HBx/HDAC1/p53AC復(fù)合物形成，則會(huì)支持GYS2的轉(zhuǎn)錄.GYS2與MDM2蛋白競爭結(jié)合p53，分別與p53形成復(fù)合體.同時(shí)，GYS2與MDM2競爭性地與p53結(jié)合，也阻止了p53介導(dǎo)的MDM2的泛素化和降解.MDM2也通過抑制p53的反式激活活性來抑制p53的功能[27].基于以上考慮，GYS2與p53抑制HBV相關(guān)的肝癌進(jìn)展的具體模型示意圖為：

圖1 GYS2與p53抑制HBV相關(guān)的肝癌進(jìn)展的具體模型示意圖.Fig.1 Schematic depiction of the model on GYS2 and p53 inhibiting the progression of HBV-related hepatocellular carcinoma.

在這里，我們描述HBx、HDAC1與p53AC形成復(fù)合體HHP，這一復(fù)合體抑制GYS2表達(dá).GYS2和MDM2競爭與p53結(jié)合，與GYS2和MDM2結(jié)合的p53標(biāo)記為Gp53和Mp53.Gp53、Mp53分別和GYS2、MDM2形成的復(fù)合體為GYGP、MPMD.假定形成復(fù)合體HHP的反應(yīng)為三級反應(yīng)，形成其余復(fù)合體的反應(yīng)為二級反應(yīng).復(fù)合體GYGP誘導(dǎo)p53形成穩(wěn)態(tài)的p53(Sp53)，與p300結(jié)合的Sp53標(biāo)記為PSp53，p300通過與PSp53形成的復(fù)合體為pp53，并將PSp53乙?；癁閜53AC.未與p300結(jié)合的Sp53標(biāo)記為FSp53，F(xiàn)Sp53抑制HCC的發(fā)生發(fā)展.基于Hill動(dòng)力學(xué)與Michaelis-Menten方程[33，34]，可以獲得各組分濃度隨時(shí)間變化的動(dòng)力學(xué)方程組為：

以上方程組中，k3、k4為競爭因子參數(shù)，為了符合實(shí)驗(yàn)結(jié)果[19]，我們模型化k3=1/{1+exp[0.5(1-[GYS2]/[MDM2])]}，k3、k4描述了GYS2和MDM2對p53的競爭結(jié)合能力，其中：k4=1-k3.k10=?1/{1+exp[0.3(1-[p300]/[Sp53])]}描述了p300對Sp53的結(jié)合能力，k11=1-k10，標(biāo)記未與p300結(jié)合的Sp53的分?jǐn)?shù)，方程(5)中的Hill系數(shù)為n=3.GYS2通過與p53協(xié)同作用而起到抑癌作用，在這里我們考慮FSp53抑制HCC的發(fā)生發(fā)展.

生物系統(tǒng)具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性，這使得合理的數(shù)學(xué)模型能夠在很大的參數(shù)范圍內(nèi)有效描述系統(tǒng)的特性，可以通過考察模型對參數(shù)變化的敏感性檢測參數(shù)(如附錄中附表所示)設(shè)置的合理性，模型中微分方程組可以通過四階Runge-Kutta方法求解.

3 結(jié)果與討論

Chen等人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明[19]，GYS2通過與p53結(jié)合，致使Sp53形成，F(xiàn)Sp53抑制HCC的發(fā)生發(fā)展.為了深刻揭示GYS2與p53協(xié)同抑癌作用，取各參數(shù)值(如附錄中附表所示)，可以獲得并分析[HBx]=0.2 μM時(shí)[Sp53]、[FSp53]隨[GYS2]的變化關(guān)系.

圖2 顯示了[Sp53]和[FSp53]隨[GYS2]變化的函數(shù)關(guān)系.從圖2可以看出，在較小的[GYS2]范圍內(nèi)，[Sp53]和[FSp53]隨[GYS2]的增大而顯著增加.[Sp53]和[FSp53]隨[GYS2]的變化呈現(xiàn)了相似的變化規(guī)律，由此表明了[FSp53]與[Sp53]的正相關(guān)性，Sp53表達(dá)水平的提升會(huì)促使FSp53表達(dá)水平幅度提高.如圖2所示，在起始的GYS2濃度變化范圍內(nèi)(0.04～0.1 μM)，[Sp53]和[FSp53]隨[GYS2]的變化較為緩慢，當(dāng)GYS2達(dá)到較高濃度時(shí)(0.12～0.16 μM)，[Sp53]和[FSp53]隨[GYS2]的增加較快增長.由此表明，少量的GYS2的增加即可促使Sp53的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而FSp53的表達(dá)水平隨著Sp53表達(dá)水平的提升而增大.當(dāng)GYS2濃度達(dá)到較高時(shí)(0.12～0.16 μM)，這會(huì)促使Sp53和FSp53的表達(dá)上調(diào)加快.由此可以確定，Sp53和FSp53的活性可以由GYS2靈敏地調(diào)控.GYS2調(diào)節(jié)提升了Sp53表達(dá)水平，激活并促進(jìn)下游FSp53的表達(dá)提升，抑制HCC的發(fā)生發(fā)展.相反，如果GYS2敲減，會(huì)使得Sp53表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而降低FSp53表達(dá)水平，HCC發(fā)生發(fā)展的抑制程度減弱.Chen等人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[19]已經(jīng)揭示，在HCV誘發(fā)的HCC進(jìn)程中，由于GYS2的缺失，在很大程度上促進(jìn)了HCC細(xì)胞的生長.

圖2 [Sp53]與[FSp53]隨[GYS2]的變化關(guān)系Fig.2 [Sp53]and[FSp53]as a function of[GYS2]

通過RNA測序進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄分析結(jié)果表明[19]，GYS2的敲減抑制了p53通路，通過GYS2和p53的直接結(jié)合，GYS2的過多表達(dá)誘導(dǎo)p53表達(dá)水平提升.同時(shí)，MDM2介導(dǎo)的p53泛素化被GYS2減弱，MDM2則通過抑制p53的反式激活活性來抑制p53的功能[27].為了揭示MDM2介導(dǎo)的p53的潛在抑制機(jī)制，可以考察[MDM2]的動(dòng)力學(xué)特性和MDM2影響Sp53的特性.

k5參數(shù)描述了Sp53對MDM2的激活速率，改變k5可以獲得不同幅值的[MDM2]與[Sp53]隨時(shí)間改變的函數(shù)關(guān)系.圖3顯示了不同k5條件下，[MDM2]與[Sp53]隨時(shí)間改變的動(dòng)力學(xué)關(guān)系.從圖3a可以看出，隨著時(shí)間的演化，[MDM2]極快地升高到了穩(wěn)定值.并且，較大的k5對應(yīng)了較大的[MDM2]隨時(shí)間變化的幅值.這是由于較大的k5代表了Sp53對MDM2較大的激活速率，因此使得MDM2表達(dá)水平幅值變大.這是由于MDM2由Sp53誘導(dǎo)激活，很快提升了表達(dá)水平，Sp53的高表達(dá)會(huì)促使MDM2表達(dá)水平提升.同時(shí)，激活的MDM2與p53結(jié)合，形成復(fù)合物MPMD抑制Sp53的功能.另外，GYS2和p53結(jié)合的復(fù)合物GYGP誘導(dǎo)Sp53水平提升.圖3b顯示了在不同k5(不同MDM2表達(dá)幅值)條件下，Sp53幅值水平只是輕微改變，由此表明了Sp53的穩(wěn)態(tài)特性，這意味著GYS2在調(diào)控維持Sp53處于穩(wěn)態(tài)、進(jìn)而抑制HCC中起著重要作用.實(shí)驗(yàn)的研究表明，MDM2通過與GYS2競爭性結(jié)合p53，抑制p53的泛素化而穩(wěn)定了p53蛋白.部分穩(wěn)定的p53蛋白(Sp53)經(jīng)過p300乙酰化后，形成p53AC，并與HBx、HDAC1結(jié)合形成復(fù)合體HHP，抑制GYS2表達(dá).

圖3 [MDM2]與[Sp53]隨時(shí)間改變的動(dòng)力學(xué)關(guān)系Fig.3 Temporal evolutions of the levels of[MDM2]and[Sp53]

圖4 顯示了[HHP]隨[p53AC]變化的函數(shù)關(guān)系.從圖4可以看出，被p300乙酰化后的p53(p53AC)會(huì)導(dǎo)致HHP急劇增加.p53AC通過與HBx、HDAC1形成復(fù)合體HHC，這種復(fù)合體誘導(dǎo)GYS2表達(dá)水平降低.這樣，通過p300介導(dǎo)的p53乙酰化，形成了依賴于p300的負(fù)反饋回路抑制GYS2.Chen等人發(fā)現(xiàn)[19]，p53能夠轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)糖原合成中涉及的基因，例如PYGL，GBE1，G6PC和GSK3β.在這里，p53AC的過多表達(dá)，則誘導(dǎo)HHP表達(dá)上調(diào)，抑制GYS2的表達(dá)水平，進(jìn)而會(huì)調(diào)低細(xì)胞中的糖原含量.因此，這種p53的異位表達(dá)的敲低，則會(huì)上調(diào)GYS2，由此表明了GYS2在p53介導(dǎo)的異常糖原代謝中的作用[18，19].

圖4 [HHP]隨[p53AC]變化的函數(shù)關(guān)系Fig.4 [HHP]as a function of[p53AC]

除了p53AC通過與HBx、HDAC1形成復(fù)合體HHC，參與糖原代謝調(diào)節(jié)，Chen等人的數(shù)據(jù)也表明乙肝表面抗原(HBsAg)陽性HCC患者的GYS2會(huì)被進(jìn)一步降低，為了進(jìn)一步深刻理解HBx在糖原代謝中的作用，可以考察不同HBx濃度條件下GYS2與Fsp53的動(dòng)力學(xué)特性.

圖5 呈現(xiàn)了在不同HBx濃度條件下，GYS2和FSp53濃度隨時(shí)間改變的動(dòng)力學(xué)關(guān)系.從圖5a可以看出，在HBx處于較低濃度條件下，GYS2濃度經(jīng)過較短時(shí)間升到了較大的穩(wěn)定值，表明GYS2很快被激活并達(dá)到一定的表達(dá)水平.當(dāng)HBx濃度較高時(shí)，GYS2很快升高到了最大值，然后持續(xù)極短時(shí)間后降低并趨于穩(wěn)定.由于HBx與p53AC、HDAC1結(jié)合形成復(fù)合體HHP，較高濃度的HBx可以生成較多的HHP(圖5a插圖)，HHP通過負(fù)反饋抑制GYS2表達(dá).由此表明，較高濃度的HBx誘發(fā)減弱了GYS2表達(dá)，使得GYS2表達(dá)下調(diào)，這種下調(diào)使得HBx弱化了下游FSp53的表達(dá)，促進(jìn)了HCC的發(fā)生發(fā)展.圖5b呈現(xiàn)了隨著HBx濃度增大，F(xiàn)Sp53隨時(shí)間改變的幅值降低.由此表明，HBx會(huì)促使FSp53的表達(dá)下調(diào)，這樣下調(diào)后的FSp53對HCC的抑制程度減弱，有利于HCC增殖.因此，在糖原代謝過程中，HBx與HDAC1、p53AC形成復(fù)合體，調(diào)控GYS2表達(dá)降低，進(jìn)而使得FSp53表達(dá)下調(diào)，HCC細(xì)胞增殖加快.相反，敲低的HBx不能形成過多的HHP，有利于GYS2表達(dá)上調(diào)，在一定程度上恢復(fù)HCC細(xì)胞中的糖原含量，并且GYS2表達(dá)上調(diào)還可以促使FSp53表達(dá)水平提升，抑制HCC的發(fā)生發(fā)展.實(shí)驗(yàn)研究也表明，HBx通過其120-134aa域抑制GYS2表達(dá)，在HepG2.2.15和HepG2-HBx細(xì)胞中，沉默的HBx會(huì)使得GYS2表達(dá)上調(diào)，在HBx陽性病例中，GYS2低表達(dá)更為常見[18，19].

圖5 不同[HBx]條件下，[GYS2]與[FSp53]隨時(shí)間改變的動(dòng)力學(xué)關(guān)系Fig.5 Temporal evolutions of the levels of[GYS2]and[FSp53]at different[HBx]

在HCC的發(fā)生發(fā)展過程中，F(xiàn)Sp53是最重要的抑制因子之一，p300與Sp53結(jié)合，調(diào)低了FSp53的表達(dá)水平，從而減弱了FSp53對HCC的抑制程度.

圖6 呈現(xiàn)了在不同p300濃度條件下，[pp53]與[FSp53]隨時(shí)間改變的動(dòng)力學(xué)關(guān)系.從圖6可以看出，[pp53]與[FSp53]隨時(shí)間演化很快增加，并維持穩(wěn)定值趨于不變，這表明pp53與FSp53很快會(huì)達(dá)到穩(wěn)定的表達(dá)水平.比較圖中p300濃度在[p300]=0.2 μM，[p300]=0.7 μM和[p300]=1.2 μM時(shí)的[pp53]幅值，可以發(fā)現(xiàn)，隨著[p300]增大，[pp53]隨時(shí)間變化幅值明顯變大，這是由于，較多的p300有利于與Sp53形成較多的復(fù)合物pp53.過多pp53生成使得p53AC增多，p53AC協(xié)同HBx與HDAC1促使GYS2表達(dá)降低，形成了誘發(fā)HCC的負(fù)反饋通路.同時(shí)，與Sp53形成較多pp53，會(huì)消耗較多的Sp53，致使FSp53表達(dá)降低，從而導(dǎo)致FSp53對HCC抑制程度減弱，進(jìn)而誘導(dǎo)HCC發(fā)生發(fā)展.

圖6 不同[p300]條件下，[pp53]與[FSp53]隨時(shí)間改變的動(dòng)力學(xué)關(guān)系Fig.6 Temporal evolutions of the levels of[pp53]and[FSp53]at different[p300]

4 結(jié) 語

在本文中，基于Hill動(dòng)力學(xué)與Michaelis-Menten方程，建立理論模型研究GYS2與p53抑制HBV相關(guān)的肝癌進(jìn)展.理論模型考慮：HBx、HDAC1與p53AC結(jié)合形成復(fù)合體，并抑制GYS2表達(dá)；GYS2通過增強(qiáng)調(diào)控p53蛋白，進(jìn)而抑制HCC的發(fā)生發(fā)展.研究發(fā)現(xiàn)，GYS2靈敏地促使了穩(wěn)態(tài)p53(Sp53)的表達(dá)上調(diào)，并激活下游FSp53的活性，抑制HCC的發(fā)生發(fā)展.由此表明，在HCV誘發(fā)HCC進(jìn)程中，由于GYS2的缺失，在很大程度上會(huì)促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖.通過考察MDM2的濃度隨時(shí)間改變的動(dòng)力學(xué)關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)，MDM2只是輕微改變Sp53幅值水平，GYS2使得Sp53處于穩(wěn)態(tài).穩(wěn)態(tài)的Sp53經(jīng)過p300乙酰化后與HBx、HDAC1結(jié)合形成復(fù)合體，并抑制GYS2表達(dá).由此表明了GYS2在p53介導(dǎo)的糖原代謝中對HCC的抑制作用[18，19].實(shí)驗(yàn)研究數(shù)據(jù)表明[19]，HBsAg陽性HCC患者的GYS2會(huì)被進(jìn)一步降低，通過考察不同濃度HBx條件下GYS2與Fsp53的動(dòng)力學(xué)特性，我們發(fā)現(xiàn)，較高濃度的HBx減弱了GYS2表達(dá)，進(jìn)而弱化了下游FSp53的表達(dá)，促進(jìn)了HCC的發(fā)生發(fā)展.這也表明了在糖原代謝過程中，HBx與HDAC1、p53AC形成復(fù)合體，調(diào)控GYS2表達(dá)降低，進(jìn)而使得FSp53表達(dá)下調(diào)，HCC細(xì)胞增殖加快.另外，p300與Sp53結(jié)合，也在一程度上調(diào)低了FSp53的表達(dá)水平，減弱了FSp53對HCC的抑制程度，進(jìn)而誘導(dǎo)HCC發(fā)生發(fā)展.

本文中只考慮GYS2與p53協(xié)同抑制HBV相關(guān)的肝癌進(jìn)展，事實(shí)上，GYS2還可以由糖原合酶激酶3β(GSK3β)磷酸化和抑制，還會(huì)被6-磷酸葡萄糖(G6P)變構(gòu)激活[20，21]，并在肝糖原晝夜節(jié)律的合成過程中由CLOCK基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控[22]，因此，GYS2的臨床意義及其在人類癌癥糖原調(diào)節(jié)中的生物功能仍需要進(jìn)一步研究[35].本文考慮HBx、HDAC1與p53AC抑制GYS2表達(dá)，以及GYS2通過增強(qiáng)調(diào)控穩(wěn)態(tài)p53表達(dá)，進(jìn)而抑制HCC的發(fā)生發(fā)展，理論結(jié)果符合實(shí)驗(yàn)[19]，表明了GYS2通過與p53協(xié)同作用，抑制HBV相關(guān)的肝癌基因的表達(dá)通路的動(dòng)力學(xué)特性.理論結(jié)果進(jìn)一步深刻揭示了GYS2與p53調(diào)控HCC的抑癌機(jī)理，可為設(shè)計(jì)阻斷HBV向HCC轉(zhuǎn)變的通路治療方案提供理論依據(jù).

表1 模型中的參數(shù)取值Table 1 Standard parameter values of the model