CRIM1 對(duì)非小細(xì)胞肺癌輻射敏感性和轉(zhuǎn)移的影響

李科君 趙雯月 李娜 王彥 劉強(qiáng) 杜利清

中國(guó)科學(xué)醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津市放射醫(yī)學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 300192

肺癌是癌癥中導(dǎo)致死亡的首要原因[1-2]。約有85%的肺癌患者被診斷為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），而90%的NSCLC 患者病死與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)[3]。多數(shù)NSCLC 患者發(fā)病時(shí)已經(jīng)發(fā)生了多處轉(zhuǎn)移，而未經(jīng)治療的轉(zhuǎn)移性患者的中位生存時(shí)間僅為4～5 個(gè)月，1 年生存率僅為10%[4]。盡管目前對(duì)肺癌轉(zhuǎn)移方面的研究有了新的進(jìn)展，但肺癌轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后仍然不樂(lè)觀。因此，有必要進(jìn)一步拓寬對(duì)NSCLC 轉(zhuǎn)移機(jī)制的認(rèn)識(shí)，以改善對(duì)該病的治療效果。

放療被認(rèn)為是無(wú)法進(jìn)行手術(shù)的早期NSCLC 患者的主要治療手段。立體定向放射療法（stereotactic body radiation therapy，SBRT）可以安全、有效地對(duì)無(wú)法進(jìn)行手術(shù)的早期NSCLC 患者（包括基礎(chǔ)肺功能較差的患者）進(jìn)行治療[5]。盡管SBRT 對(duì)早期NSCLC 患者的局部控制率很好（3 年期為98%、5 年期為87%）[6-7]，但患者在隨訪中經(jīng)常發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；對(duì)于不能手術(shù)治療的Ⅲ期NSCLC 患者，化療聯(lián)合放療的試驗(yàn)結(jié)果顯示，腫瘤控制率或患者生存期并未得到明顯改善[8]。因此，目前仍需要探索影響NSCLC 輻射敏感性的因素，從而改善NSCLC的放療效果，特別是在疾病的早期階段。

富含半胱氨酸型運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元蛋白1（cysteinerich motor neuron 1，CRIM1）是骨形態(tài)發(fā)生蛋白抑制劑家族中富含半胱氨酸區(qū)域的Ⅰ型跨膜糖蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約為130 000，含有1036 個(gè)氨基酸，由胞質(zhì)區(qū)、跨膜域和胞外域組成。在CRIM1 蛋白的羧基末端，有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)相對(duì)較短的胞質(zhì)區(qū)，胞外域包括位于氨基末端的信號(hào)肽序列、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白樣結(jié)構(gòu)域和6 個(gè)高度保守的富含半胱氨酸的重復(fù)序列，胞外域可以從細(xì)胞中釋放，形成分泌型CRIM1[9-10]。在本研究中，我們通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探討CRIM1 對(duì)NSCLC 輻射敏感性和轉(zhuǎn)移的影響，并初步探索其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

胎牛血清購(gòu)自上海傳秋生物科技有限公司，1640 培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)HyClone 公司，慢病毒顆粒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P公司，小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）購(gòu)自蘇州吉瑪基因股份有限公司，Trizol 試劑購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司，磷酸化組蛋白H2AX（γ-H2AX）抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司，Cy3 標(biāo)記的山羊抗鼠免疫球蛋白G 購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司，Matrigel基質(zhì)膠和Transwell 小室購(gòu)自美國(guó)康寧公司，正常熔點(diǎn)瓊脂糖購(gòu)自美國(guó)Biowest 公司，低熔點(diǎn)瓊脂糖購(gòu)自美國(guó)Promega 公司，Super GelRed 染液購(gòu)自蘇州宇恒生物科技公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)公司，結(jié)晶紫、多聚甲醛、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）和纖連蛋白購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（CCK-8）購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司。DMI3000B 倒置熒光顯微鏡購(gòu)自德國(guó)徠卡公司，37℃恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自上海力申科學(xué)儀器有限公司，Gammacell?40 Exactor137Cs γ 射線照射源購(gòu)自加拿大Best Theratronics 公司，CFX Connect 實(shí)時(shí)定量PCR 儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人NSCLC H460、H358 細(xì)胞均購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（ATCC）細(xì)胞庫(kù)，均采用含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)液，在含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 短發(fā)夾RNA（shRNA）慢病毒感染與siRNA轉(zhuǎn)染

慢病毒LV-CRIM1-RNAi（LV：慢病毒載體；RNAi：RNA 干擾）和陰性對(duì)照LV-CON 均由上海吉?jiǎng)P生物公司構(gòu)建。將H460、H358 細(xì)胞按照1×105個(gè)/孔接種于12 孔板中，培養(yǎng)24 h，用慢病毒顆粒（感染復(fù)數(shù)=10）進(jìn)行感染。感染12 h 后，將含病毒的培養(yǎng)液換為完全培養(yǎng)基。感染96 h 后，用嘌呤霉素篩選，后擴(kuò)大培養(yǎng)。將H460、H358 細(xì)胞分別分為3 組：H460 細(xì)胞、H460-shCRIM1 細(xì)胞、H460-shNC 細(xì)胞和H358 細(xì)胞、H358-shCRIM1 細(xì)胞、H358-shNC 細(xì)胞（其中shCRIM1 表示用shRNA敲降CRIM1 的表達(dá)，shNC 表示陰性對(duì)照）。

將H358 細(xì)胞按照1×106個(gè)/孔接種于6 孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將siRNA 轉(zhuǎn)染H358 細(xì)胞分為2 組：H358-NC 細(xì)胞（轉(zhuǎn)染siRNA-NC，即陰性對(duì)照）和H358-siCRIM1細(xì)胞（轉(zhuǎn)染siRNA-CRIM1，即CRIMI 敲降序列：正義鏈為5′-CCUUAUUGCUGGCUGCAAUTT-3′；反義鏈為 5′-AUUGCAGCCAGCAAUAAGGTT-3′）。轉(zhuǎn)染24 h 后棄去原有培養(yǎng)液，加入新鮮完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用Trizol 試劑裂解細(xì)胞，采用熒光定量PCR 法檢測(cè)干擾效率。

1.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及分組

雄性BALB/c-nu 裸鼠30 只，6～8 周齡，體重（20±2）g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供[許可證號(hào)：SCXK（京）2020-0004]，飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有動(dòng)物在無(wú)特定病原體條件下，于恒溫（23℃±2℃）、恒濕（45%～50%）、無(wú)菌凈化屏障系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)，隨意采食全價(jià)鼠飼料及清潔水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)開展前獲得了中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：IRM-DWLL-2020140）。

將30 只裸鼠分為3 組，每組10 只，分別接種H460、H460-shCRIM1、H460-shNC 細(xì) 胞。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的上述3 種細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，離心（115×g）5 min 后棄上清，用PBS 洗滌2 次并離心（115×g）5 min，用Matrigel 基質(zhì)膠混合制備成5×106個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液。于BALB/c-nu裸鼠右腋前線第二肋上緣，右肺第二葉注射100 μL 細(xì)胞懸液，2 周后將小鼠全部處死并取肺臟。

1.5 照射方法

使用137Cs γ 射線照射源對(duì)細(xì)胞進(jìn)行照射，劑量率為1 Gy/min。

1.6 熒光定量PCR

采用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)，包括CRIM1、連接黏附分子2（junctional adhesion molecule 2，JAM2）、連接蛋白3（nectin cell adhesion molecule 3，NECTIN3）和緊密連接蛋白4（claudin 4，CLDN4）等基因，同時(shí)檢測(cè)甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH)基因的表達(dá)，并作為內(nèi)參。擴(kuò)增條件：95℃激活10 min；95℃變性 15 s、60℃退火1 min，循環(huán)35 次。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR 儀分析熒光強(qiáng)度，數(shù)據(jù)采用 2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列如下。

GAPDH 引物序列：

正向5′-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3′；

反向5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3′；

CRIM1 引物序列：

正向5′-ACGCGATCACAATGGTTGTCGG-3′；

反向5′-GGCATCAGTAAGGAAACCGAAGG-3′；NECTIN3 引物序列：

正向5′- ATTCCCGCTTGGAAATGCCCAG-3′；

反向5′- GCTGCTACTGTTTCATTTCCTCC-3′；CLDN4 引物序列：

正向5′- AGTGCAAGGTGTACGACTCGCT-3′；

反向5′- CGCTTTCATCCTCCAGGCAGTT-3′；JAM2 引物序列：

正向5′- AGACTTGGCTCCCAAAGCACCA-3′；

反向5′- TTCCCAGGACACCTGCGATATC-3′。

1.7 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

分別將500 個(gè)H460、H460-shCRIM1、H460-shNC 細(xì)胞接種至6 孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，分別進(jìn)行0、1、2、4 Gy 照射，照射時(shí)間分別為0、1、2、4 min，并繼續(xù)培養(yǎng)至出現(xiàn)肉眼可見的克隆，共計(jì)7 d。棄掉培養(yǎng)基，用結(jié)晶紫染液染色。肉眼進(jìn)行克隆計(jì)數(shù)，以每團(tuán)細(xì)胞數(shù)＞50 個(gè)作為1 個(gè)克隆。根據(jù)公式進(jìn)行計(jì)算，細(xì)胞克隆形成率＝照射細(xì)胞克隆數(shù)/未照射（0 Gy 照射）同種細(xì)胞克隆數(shù)×100%。

1.8 細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)

將H460、H460-shNC、H460-shCRIM1 細(xì) 胞接種至載玻片上24 h 后，行6、8、12 Gy 照射，照射時(shí)間分別為6、8、12 min，12 h 后取出載玻片，PBS 清洗，4%多聚甲醛室溫下固定15 min，0.3% Triton X-100 室溫下處理細(xì)胞15 min，5%牛血清蛋白室溫封閉2 h，加入磷酸化組蛋白H2AX（γ-H2AX）一抗30 μL，4℃孵育過(guò)夜，PBS 清洗3次，加入二抗（Cy3 標(biāo)記的山羊抗鼠免疫球蛋白G）。室溫孵育1 h，PBS 清洗，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色后于熒光顯微鏡下拍照并記錄細(xì)胞中磷酸化組蛋白H2AX（γ-H2AX）foci 數(shù)。

1.9 單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)（彗星實(shí)驗(yàn)）

收集H460、H460-shNC、H460-shCRIM1 細(xì)胞，用PBS 沖洗2 次，并用PBS 重懸，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液密度至4×105個(gè)/mL，經(jīng)8 Gy 照射后立即鋪板。彗星實(shí)驗(yàn)板（自制）每孔鋪入0.75%正常熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠約500 μL，待凝結(jié)后，將30 μL 細(xì)胞懸液與70 μL 0.75%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠混勻并滴于上層鋪平，將彗星實(shí)驗(yàn)板完全浸沒(méi)在細(xì)胞裂解液中，于4℃裂解2.5 h。再將彗星實(shí)驗(yàn)板移入裝有Tris-硼酸緩沖液的電泳槽中進(jìn)行DNA 解旋20 min（30 V電壓下電泳20 min），電泳結(jié)束后用中和緩沖液中和20 min。PBS 沖洗彗星實(shí)驗(yàn)板后用Super GelRed染液染色，在熒光顯微鏡下拍照。應(yīng)用CASP 6.0軟件（http://www.casp-program.org）分析圖像；casp_1.2.3b1 彗星分析軟件（波蘭弗羅茨瓦夫大學(xué)）分析olive 尾距。

1.10 Transwell 實(shí)驗(yàn)

用胰蛋白酶消化H460、 H460-shCRIM1、H460-shNC 細(xì)胞和H358、H358-shCRIM1、H358-shNC 細(xì)胞，再用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋。在Transwell小室的上室中加入5×104個(gè)細(xì)胞，在下室中加入600 μL 含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基，將上室放入24 孔板后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。24 h 后取出上室，用乙醇配制的0.5%結(jié)晶紫固定染色30 min，PBS 清洗，擦去上室內(nèi)殘留細(xì)胞，晾干后用倒置顯微鏡拍照。

1.11 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)

在實(shí)驗(yàn)前12 h，將纖連蛋白涂布于96 孔板中；將胰蛋白酶消化后的H460、H460-shCRIM1、H460-shNC 細(xì)胞和H358、H358-shCRIM1、H358-shNC 細(xì)胞鋪至上述96 孔板中，37℃孵育20 min，用無(wú)血清1640 培養(yǎng)基洗去未黏附細(xì)胞，再加入無(wú)血清1640 培養(yǎng)基，37℃孵育4 h 后加入細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（CCK-8）試劑，檢測(cè)450 nm 波長(zhǎng)下的吸光度（A450 值），根據(jù)吸光度值判定細(xì)胞黏附能力。

1.12 肺組織的組織病理學(xué)檢查

將小鼠處死后迅速取出肺臟，經(jīng)生理鹽水漂洗后，用4%中性甲醛溶液固定，在左右肺的最大截面處進(jìn)行組織病理切片，然后用蘇木精-伊紅染色，在顯微鏡下觀察肺組織中腫瘤的分布情況。

1.13 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

用Trizol 法提取H460-shCRIM1、H460-shNC細(xì)胞總RNA，每種細(xì)胞設(shè)3 個(gè)重復(fù)樣品，并進(jìn)行測(cè)序（委托廣州基迪奧公司完成）。對(duì)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析，以差異表達(dá)倍數(shù)＞2、校準(zhǔn)后P＜0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選得到差異基因。利用基因本體論（gene ontology，GO）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)全部差異基因進(jìn)行注釋，京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)全部差異基因進(jìn)行通路分析，注釋與通路分析均使用北京大學(xué)KOBAS 系統(tǒng)（http://kobas.cbi.pku.edu.cn）進(jìn)行，采用超幾何分布計(jì)算差異基因顯著富集的GO 條目和KEGG 通路，P＜0.05 為顯著富集。篩選得到目的基因后進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)，具體方法同1.6 節(jié)。

1.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用IBM SPSS Statistics 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，在方差齊的條件下，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRIM1 對(duì)NSCLC H460 細(xì)胞輻射敏感性的影響

細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H460-shNC 細(xì)胞和H460-shCRIM1 細(xì)胞在接受1、2、4 Gy 照射后的克隆形成率分別為（87.04±8.04）%、（48.23±1.22）%、（9.45±4.21）%和（58.01±4.39）%、（31.43±0.08）%、（4.79±1.54）%。與H460-shNC 細(xì)胞相比，1、2 Gy 照射后H460-shCRIM1 細(xì)胞克隆形成率明顯降低，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.48、19.50，均P＜0.05），4 Gy 照射后H460-shCRIM1 細(xì)胞克隆形成率也呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)（圖1A）。彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H460-shCRIM1 細(xì)胞的olive 尾距長(zhǎng)于H460-shNC 細(xì)胞，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.27±0.54對(duì)1.05±0.42，t=2.14，P＜0.05）（圖1B）。細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H460-shCRIM1 細(xì)胞受照后的磷酸化組蛋白H2AX（γ-H2AX）foci 數(shù)多于H460-shNC細(xì)胞（6 Gy：14.33±2.81 對(duì)11.00±3.92；8 Gy：34.00±11.14 對(duì)21.17±6.15；12 Gy：25.80±3.96 對(duì)20.17±3.31），且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.45、5.52、2.47，均P＜0.05）（圖1C）。由此可見，敲降H460 細(xì)胞內(nèi)CRIM1 的表達(dá)可以增強(qiáng)其輻射敏感性。H358細(xì)胞由于克隆形成能力較差，未檢測(cè)其輻射敏感性。

2.2 CRIM1 對(duì)NSCLC 細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響

由圖2 可見，shRNA 可以從轉(zhuǎn)錄水平敲降H460、H358 細(xì)胞中CRIM1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量（t=35.35、22.50，均P＜0.05）。Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H460-shCRIM1 細(xì)胞的遷移率較H460-shNC細(xì)胞明顯升高（t=4.73，P＜0.05），黏附能力下降（t=2.86，P＜0.05）（圖3A）；H358-shCRIM1 細(xì)胞的遷移率較H358-shNC 細(xì)胞明顯升高（t=10.19，P＜0.05），黏附能力下降（t=3.66，P＜0.05）（圖3B）。小鼠肺內(nèi)原位接種腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，接種后2 周，H460-shCRIM1 細(xì)胞的肺內(nèi)轉(zhuǎn)移灶明顯多于H460-shNC 細(xì)胞（圖3C、D），且在縱隔和胸膜下出現(xiàn)大量的轉(zhuǎn)移灶。

圖 1 CRIM1 對(duì)非小細(xì)胞肺癌H460 細(xì)胞輻射敏感性的影響 A 為3 種細(xì)胞照射后的克隆形成（左）及克隆形成率（右），a 表示與H460 細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.45，P＜0.05），b 表示與H460-shNC 細(xì)胞比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.48、19.50，均P＜0.05）；B 為3 種細(xì)胞經(jīng)8 Gy 照射后的彗星實(shí)驗(yàn)電泳圖（左）及olive 尾距（右），a 表示與H460 細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.66，P＜0.05），b 表示與H460-shNC 細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.14，P＜0.05）；C 為3 種細(xì)胞經(jīng)6、8、12 Gy 照射后磷酸化組蛋白H2AX foci 的形成（左）及結(jié)果（右），a 表示與H460 細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.34，P＜0.05），b 表示與H460-shNC 細(xì)胞比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.45、5.52、2.47，均P＜0.05）。shNC 為陰性對(duì)照；shCRIM1 為用短發(fā)夾RNA 敲降CRIM1 的表達(dá)；CRIM1 為富含半胱氨酸型運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元蛋白1Figure 1 Effect of cysteine-rich moter neuron 1 on radiosensitivity of non-small cell lung cancer H460 cell

2.3 CRIM1 影響NSCLC 細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的可能機(jī)制

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，通過(guò)主成分分析（PCA）結(jié)果發(fā)現(xiàn)，降維分析后H460-shCRIM1 細(xì)胞和H460-shNC 細(xì)胞的樣本聚集度較高（圖4A）。與H460-shNC 細(xì)胞相比，H460-shCRIM1 細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)基因58 個(gè)、下調(diào)基因39 個(gè)。對(duì)所有97 個(gè)基因和39 個(gè)下調(diào)基因的KEGG 富集分析結(jié)果（圖4B）顯示，其顯著變化的通路均富集在細(xì)胞黏附分子通路上，富集的基因是參與細(xì)胞黏附連接的NECTIN3、CLDN4 基因和構(gòu)成細(xì)胞緊密連接的JAM2 基因，其相對(duì)表達(dá)量在H460-shCRIM1 細(xì)胞中均有所下降。

圖 2 短發(fā)夾RNA 敲降后非小細(xì)胞肺癌H460、H358 細(xì)胞中CRIMI mRNA 的相對(duì)表達(dá)量 A 為 H460 細(xì)胞的CRIM1mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，a 表示與 H460 細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=27.94，P＜0.05），b 表示與 H460-shNC 細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=35.35，P＜0.05）；B 為 H358 細(xì)胞的CRIM1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，a 表示與H358 細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.67，P＜0.05），b 表示與H358-shNC 細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=22.50，P＜0.05）。shNC 為陰性對(duì)照；shCRIM1 為用短發(fā)夾RNA 敲降CRIM1的表達(dá)；CRIM1 為富含半胱氨酸型運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元蛋白1Figure 2 Effect of short hairpin RNA on cysteine-rich motor neuron 1 expression in non-small cell lung cancer H460 and H358 cells

2.4 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果的驗(yàn)證

由 圖5 可 見， 與H460-shNC 細(xì) 胞 比 較，H460-shCRIM1 細(xì) 胞 中 的 JAM2、 NECTIN3 和CLDN4 基因的相對(duì)表達(dá)量分別下降了86.66%、49.35%、30.27%（t=47.52、7.47、18.98，均P＜0.05）（圖5A）。與H358-siNC 細(xì)胞比較，H358-siCRIM1細(xì)胞中的JAM2、NECTIN3 和CLDN4 基因的相對(duì)表達(dá)量分別下降了36.60%、31.70%、50.00%（t=7.40、7.10、16.56，均P＜0.05）（圖5C）。由此可見，CRIM1的表達(dá)降低可能會(huì)導(dǎo)致NSCLC 中細(xì)胞黏附分子轉(zhuǎn)錄水平的降低。

圖 3 CRIM1 對(duì)非小細(xì)胞肺癌H460、H358 細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響 A 為H460 3 種細(xì)胞的遷移圖（左）、細(xì)胞遷移率（中）和細(xì)胞黏附能力（右），a 表示與H460 細(xì)胞比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.48、3.63，均P＜0.05），b 表示與H460-shNC 細(xì)胞比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.73、2.86，均P＜0.05）；B 為H358 3 種細(xì)胞的遷移圖（左）、細(xì)胞遷移率（中）和細(xì)胞黏附能力（右），a 表示與H358 細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.34、5.69，均P＜0.05），b 表示與H358-shNC 細(xì)胞比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.19、3.66，均P＜0.05）；C 為組織病理學(xué)檢查結(jié)果（蘇木精-伊紅染色，×5），顯示小鼠原位接種腫瘤后的腫瘤轉(zhuǎn)移圖；D 為小鼠右肺大體圖，可見H460-shCRIM1 中腫瘤病灶分布較彌散，而H460 和H460-shNC 中腫瘤病灶較少，分布集中。shNC 為陰性對(duì)照；shCRIM1 為用短發(fā)夾RNA 敲降CRIM1 的表達(dá)；CRIM1 為富含半胱氨酸型運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元蛋白1Figure 3 Effect of cysteine-rich motor neuron 1 on the metastasis of non-small cell lung cancer H460 and H358 cells

圖 4 敲降非小細(xì)胞肺癌H460 細(xì)胞中CRIM1 的表達(dá)后的轉(zhuǎn)錄組基因分析 A 為轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的主成分分析圖；B 為H460-shCRIM1 細(xì)胞中39 個(gè)下調(diào)基因的KEGG 富集分析圖。PC1 為第一主成分；PC2 為第二主成分；shNC 為陰性對(duì)照；shCRIM1 為用短發(fā)夾RNA 敲降CRIM1 的表達(dá)；CRIM1 為富含半胱氨酸型運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元蛋白1；FDR 為校準(zhǔn)后P 值；HIF-1 為缺氧誘異因子1Figure 4 Transcriptome gene analysis after reducing cysteine-rich motor neuron 1 expression in non-small cell lung cancer H460 cell

圖 5 敲降非小細(xì)胞肺癌H460、H358 細(xì)胞中CRIM1 的表達(dá)對(duì)細(xì)胞黏附相關(guān)基因表達(dá)的影響 A 為H460 3 種細(xì)胞內(nèi)JAM2、NECTIN3 和CLDN4 基因相對(duì)表達(dá)量的變化，a 表示與H460 細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=16.15，P＜0.05），b 表示與H460-shNC細(xì)胞比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=47.52、7.47、18.98，均P＜0.05）；B 為經(jīng)小干擾RNA 敲降后，H358 細(xì)胞中CRIM1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，a 表示與H358 細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.24，P＜0.05），b 表示與H358-siNC 細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=24.73，P＜0.05）；C 為經(jīng)小干擾RNA 敲降H358 細(xì)胞中CRIM1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量后，JAM2、NECTIN3 和CLDN4 基因相對(duì)表達(dá)量的變化，a 表示與H358 細(xì)胞比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.36、12.17、130.09，均P＜0.05），b 表示與H358-siNC 細(xì)胞比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.40、7.10、16.56，均P＜0.05）。shNC 為陰性對(duì)照；shCRIM1 為用短發(fā)夾RNA 敲降CRIM1 的表達(dá)；CRIM1 為富含半胱氨酸型運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元蛋白1；siNC 為陰性對(duì)照；siCRIM1 為用小干擾RNA 敲降CRIM1 的表達(dá)；JAM2 為連接黏附分子2；NECTIN3 為連接蛋白3；CLDN4 為緊密連接蛋白4Figure 5 Expression of cell adhesion-related genes after reducing cysteine-rich motor neuron 1 expression in non-small cell lung cancer H460 and H358 cells

3 討論

放療盡管在NSCLC 的治療上取得了一定進(jìn)展，但進(jìn)一步提高NSCLC 的輻射敏感性仍然是非常有必要的。Hurov 等[11]對(duì)人骨肉瘤U2OS 細(xì)胞進(jìn)行全基因組RNA 干擾分析，篩選結(jié)果顯示CRIM1可能與降低U2OS 細(xì)胞的輻射敏感性相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，敲降CRIM1 的H460-shCRIM1 細(xì)胞照射后的克隆形成能力降低。DNA 是輻射的直接作用靶點(diǎn)，因此DNA 的損傷程度可間接反映細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性。為了進(jìn)一步評(píng)估CRIM1 對(duì)NSCLC H460 細(xì)胞輻射敏感性的影響，我們通過(guò)慧星實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察了敲降CRIM1 后受照H460細(xì)胞的DNA 損傷情況，結(jié)果也表明敲降CRIM1會(huì)增加照射對(duì)H460 細(xì)胞DNA 的損傷程度，增強(qiáng)其輻射敏感性。隨后，我們分析了轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果，但未顯示出與輻射敏感性緊密相關(guān)的信號(hào)通路的改變。推測(cè)CRIM1 可能通過(guò)不依賴于轉(zhuǎn)錄水平變化的方式來(lái)影響H460 細(xì)胞的輻射敏感性。

轉(zhuǎn)移是腫瘤治療失敗的主要原因，而腫瘤的遷移、侵襲、黏附和血管形成等能力將直接影響腫瘤的轉(zhuǎn)移。本研究主要從遷移和黏附2 個(gè)角度闡述了CRIM1 對(duì)NSCLC 細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。首先采用shRNA 慢病毒感染與siRNA 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染2 種NSCLC H460 和H358 細(xì)胞，分別采用Transwell實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)評(píng)估了細(xì)胞的遷移和黏附能力，結(jié)果表明敲降CRIM1 可以促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞的遷移和黏附，進(jìn)而促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞的轉(zhuǎn)移；且肺內(nèi)原位接種H460 細(xì)胞的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，CRIM1 低表達(dá)的肺癌細(xì)胞更易形成多發(fā)的轉(zhuǎn)移灶。由此證實(shí)CRIM1 具有抑制NSCLC 細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。CRIM1 與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系的研究已有報(bào)道。Ogasawara 等[12]的研究結(jié)果表明，CRIM1 可抑制腎癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移；Zeng 等[13]的研究結(jié)果顯示，敲降CRIM1 可抑制肺癌A549 細(xì)胞在體外的遷移。本研究結(jié)果與Ogasawara 等[12]的結(jié)果一致，但與Zeng 等[13]的研究結(jié)果相反。選用細(xì)胞系的不同可能是造成這一差異的原因之一。另外，我們還比較了NSCLC 細(xì)胞和多種小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中CRIM1 的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CRIM1 在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中普遍低表達(dá)（研究結(jié)果尚未發(fā)表）。而這與小細(xì)胞肺癌易轉(zhuǎn)移、對(duì)輻射敏感的特性相吻合，這也與本研究的結(jié)果相吻合。目前，我們正在就CRIM1 對(duì)小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移的影響進(jìn)行探討，以期深入了解CRIM1 與肺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

關(guān)于CRIM1 影響NSCLC 細(xì)胞轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制，我們分析了敲降CRIM1 和陰性對(duì)照NSCLC細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞黏附分子通路在H460-shNC 細(xì)胞和H460-shCRIM1 細(xì)胞之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，通路中的3 個(gè)細(xì)胞黏附分子JAM2、CLDN4、NECTIN3 在 敲 降CRIM1 的H460 和H358 細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量均明顯下調(diào)。這提示CRIM1 可能是通過(guò)影響NSCLC 細(xì)胞間的黏附發(fā)揮其改變肺癌轉(zhuǎn)移的作用。對(duì)非洲爪蟾的神經(jīng)板發(fā)育的研究結(jié)果也表明，CRIM1 主要通過(guò)與鈣黏著蛋白和β-catenin形成復(fù)合物來(lái)影響細(xì)胞連接復(fù)合物的形成和穩(wěn)定，而該功能對(duì)于細(xì)胞黏附至關(guān)重要[14]。細(xì)胞黏附是由橋粒、黏附連接和緊密連接等組成的細(xì)胞間錨定和信號(hào)傳遞的場(chǎng)所，用于維持和形成正常的細(xì)胞間黏附。細(xì)胞黏附的失調(diào)在惡性腫瘤的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[15-16]。細(xì)胞黏附連接除發(fā)揮錨定作用外，對(duì)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)和轉(zhuǎn)錄過(guò)程的調(diào)節(jié)均有重要意義。因此，連接通訊系統(tǒng)的失調(diào)在腫瘤侵襲中具有特殊意義[17-18]。緊密連接及其相關(guān)黏附因子的失調(diào)也與腫瘤的轉(zhuǎn)化和侵襲有很大關(guān)系。多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，在乳腺癌、肝癌、子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌中，CLDN 失調(diào)明顯會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移的潛能增加[19-20]。

因此，我們后期將使用電鏡觀察腫瘤組織中的細(xì)胞間連接，包括黏附連接和緊密連接的變化，以進(jìn)一步確定CRIM1 對(duì)細(xì)胞連接的影響。對(duì)于CRIM1是如何影響細(xì)胞黏附分子的水平及其具體的機(jī)制，還有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，抑制CRIM1 能夠增強(qiáng)NSCLC H460細(xì)胞的輻射敏感性；CRIM1 可能通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞連接的方式影響NSCLC 的轉(zhuǎn)移。

利益沖突本研究由署名作者按以下貢獻(xiàn)聲明獨(dú)立開展，不涉及任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明李科君負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)的實(shí)施、論文的撰寫與修訂；趙雯月負(fù)責(zé)細(xì)胞學(xué)的實(shí)驗(yàn)；李娜負(fù)責(zé)動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)、數(shù)據(jù)的獲??；王彥負(fù)責(zé)方法的建立、數(shù)據(jù)的分析；劉強(qiáng)負(fù)責(zé)論文的審閱；杜利清負(fù)責(zé)研究命題的設(shè)計(jì)、論文的修訂。