L-賴氨酸調(diào)控球霰石碳酸鈣結(jié)晶研究

任麗英 ，徐衡，李倩倩，王坤，馬允

(1.安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 藥學(xué)系，安徽 安慶 2410522.功能配合物安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 安慶師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,安徽 安慶246001)

鈣是生物體的微量元素，廣泛分布在生物體內(nèi)[1]，像脊椎動(dòng)物的骨骼、軟體動(dòng)物的殼及哺乳動(dòng)物的牙齒等的主要無(wú)機(jī)成分亦是鈣鹽.研究表明，碳酸鈣是一種生物相容性好的藥物載體材料，具有pH刺激響應(yīng)性、可降解性、形貌可控等優(yōu)點(diǎn)[2-4].由于尺寸效應(yīng)和細(xì)胞吞噬作用，碳酸鈣的形貌和尺寸是合成藥物載體的關(guān)鍵，球霰石碳酸鈣由于粒徑分布均勻、分散性好、比表面積大、生物相容性和降解性好等優(yōu)點(diǎn)，并且對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有毒副作用，且具有良好的機(jī)械與熱穩(wěn)定性，是藥物載體的首選.但球霰石碳酸鈣不穩(wěn)定[5]，易向更穩(wěn)定的晶型轉(zhuǎn)變，因此，研究制備過(guò)程中各種因素對(duì)碳酸鈣晶型的影響，有助于篩選球霰石碳酸鈣載體材料的制備條件.仿生合成是模擬生物礦化制備出人工晶體的方法，其中氣相擴(kuò)散法是最接近碳酸鈣自然礦化制備過(guò)程，有利于研究碳酸鈣的晶體生長(zhǎng)機(jī)理，為模擬控制碳酸鈣結(jié)晶提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù).在仿生合成碳酸鈣的過(guò)程中，加入有機(jī)物作為無(wú)機(jī)礦物形成的基質(zhì)，將合成條件確定后，無(wú)機(jī)粒子在基質(zhì)上成核，無(wú)機(jī)礦物的整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中都受有機(jī)基質(zhì)及其它給定仿生條件的調(diào)控，有利于碳酸鈣晶體形貌和尺寸的觀察.模板法分為硬模板和軟模板兩類.利用溶液中的粒子，如分子、粒子等通過(guò)化學(xué)鍵或分子間作用力形成晶體，并通過(guò)這些作用力影響和控制晶體的結(jié)晶和成核的方法叫做軟模板法[6].常見(jiàn)的軟模板粒子有生物小分子(糖類、氨基酸等)、無(wú)機(jī)分子或離子、有機(jī)物及各種高分子等.這些模板通過(guò)與碳酸鈣的組成離子(鈣離子或碳酸根離子)相互影響和作用，可實(shí)現(xiàn)對(duì)碳酸鈣晶體的形貌、結(jié)構(gòu)、成核及結(jié)晶過(guò)程的控制.在這些模板中，以生物分子為模板，調(diào)控碳酸鈣晶體的形成過(guò)程，仿生合成具有不同結(jié)構(gòu)和性能的碳酸鈣微米材料更貼近生物體內(nèi)碳酸鈣的合成過(guò)程，利用這種方法不僅能合成出性能優(yōu)越的材料，而且能夠提供探討生物礦化過(guò)程和機(jī)理體外模擬方法，進(jìn)一步完善仿生合成的理論和實(shí)踐，合成更多結(jié)構(gòu)和功能的仿生材料[7].

賴氨酸具有L-型和D-型兩種同分異構(gòu)體.L-賴氨酸的有效成分含量一般為77%～79%，是人體必需氨基酸之一，生物學(xué)研究表明，血液中的多種纖溶活性的蛋白酶與L-賴氨酸有特異型相互作用，生物相容性好且利用率高[8].目前，采用氣相擴(kuò)散法以不同濃度的L-賴氨酸作為基質(zhì)調(diào)控碳酸鈣，制備球霰石微球的文獻(xiàn)鮮有報(bào)道.實(shí)驗(yàn)選用L-賴氨酸作為軟模板，采用氣相擴(kuò)散法仿生合成球霰石碳酸鈣微球，在溫度恒定，低于L-賴氨酸等電點(diǎn)的pH條件下成功制備出性質(zhì)穩(wěn)定的球霰石碳酸鈣微球，結(jié)合實(shí)驗(yàn)過(guò)程與結(jié)果，探討球霰石碳酸鈣的可能形成機(jī)理.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

L-賴氨酸(分析純(AR)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，氯化鈣(AR，北京化學(xué)試劑公司)本實(shí)驗(yàn)所用其他試劑均是AR.實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水.溶液的pH值由PHS-3C型pH計(jì)( 上海精科雷磁 )測(cè)定.在Nicolet Avatar 360型FT-IR上采集紅外光譜數(shù)據(jù)，KBr壓片，波數(shù)：分辯率3 cm-1，500-4000 cm-1,JEOL-7500B型場(chǎng)發(fā)射電子掃描電鏡( SEM，日本JEOL公司 )在工作電壓為5.0 kV條件下采集圖片，以觀測(cè)晶體微觀形貌和結(jié)構(gòu).X射線粉末衍射測(cè)試是用日本島津XRD-6000粉末X-射線衍射儀( Cu靶，Kα,λ=0.154060 nm ).

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

在典型的實(shí)驗(yàn)中，將10 mL 10 mmol/L CaCl2(AR)加到小燒杯中，再加入0.7 g/L L-Lys，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0.用保鮮膜密封小燒杯，之后用針在保鮮膜上扎3個(gè)小孔，輕輕將燒杯放入干燥器中(靠器壁擺放)，再取一小燒杯，加入分析純的碳酸銨，同樣用保鮮膜密封，并在保鮮膜上扎6-9個(gè)透氣孔，處理好后放入上述干燥器的中央，然后將干燥器移至恒溫(提前設(shè)好溫度值恒定值25 ℃)培養(yǎng)箱中，在其他條件恒定下恒溫靜置24 h，即通過(guò)氣相擴(kuò)散法使試劑接觸最終得到CaCO3亞微米粒.接著取出晶體，依次用用二次蒸餾水、無(wú)水乙醇洗滌3-5次，最后干燥晶體：取洗滌后的晶體至于常溫條件下的電熱恒溫干燥箱內(nèi)干燥1 d備用.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同L-Lys濃度條件下碳酸鈣的結(jié)晶行為

圖1給出4個(gè)具有代表性的CaCO3晶體顆粒的掃描電鏡圖.由圖1可看出，L-Lys溶液的濃度變化時(shí)，CaCO3晶體顆粒的形貌也在發(fā)生明顯的改變，可推出L-Lys的濃度對(duì)碳酸鈣晶體的微觀形貌有著十分明顯的影響.圖1a表征：L-Lys的濃度為0 g/L時(shí)，得到菱形的CaCO3晶體粒子，晶體顆粒均勻且呈現(xiàn)立方形貌，表面棱角分明；圖1b表征：L-Lys的濃度為0.2 g/L時(shí)，CaCO3晶體出現(xiàn)透鏡型和菱形；圖1c：將L-Lys的濃度增大到0.4 g/L時(shí)，菱形碳酸鈣粒子消失，全部轉(zhuǎn)變成透鏡形貌，從圖中可得透鏡形晶體粒徑在2.5-4.5 μm之間.圖1d：L-Lys濃度繼續(xù)增大到0.7 g/L，出現(xiàn)橢圓球形碳酸鈣晶體.

(a)純水;(b) 0.2 g/L;(c) 0.4 g/L;(d) 0.7 g/L.圖1 不同濃度L-Lys溶液中形成的CaCO3晶體掃描電鏡圖Fig.1 SEM images of CaCO3 particles obtained in the presence of different concentration L-Lys

2.2 FTIR與XRD分析

CaCO3存在3種穩(wěn)定的晶型[1]：球霰石、文石及方解石，3種晶型的紅外圖譜不盡相同，均有獨(dú)特的特征譜帶.CaCO3晶體的方解石形貌FTIR譜帶的特征峰在876 cm-1和712 cm-1處；876 cm-1和745 cm-1為球霰石形貌CaCO3粒子的特征峰；碳酸鈣晶體的文石形貌晶體特征峰為856 cm-1和712 cm-1.圖2是利用紅外圖譜表征在不同濃度的L-Lys溶液中所得的CaCO3晶體特征峰.從圖2中可以看出，CaCO3晶體紅外譜圖的特征峰隨著L-Lys溶液濃度改變而變化，結(jié)合掃描電鏡圖可知，CaCO3的晶體形貌同樣因L-Lys溶液濃度的變化在逐漸改變.圖2a是圖1a所呈現(xiàn)的菱面體結(jié)構(gòu)的碳酸鈣中未加L-Lys溶液時(shí)得到的CaCO3的紅外光譜圖，由圖2a可知876 cm-1、712 cm-1有吸收峰出現(xiàn)，可推得此菱形結(jié)構(gòu)的CaCO3晶型為方解石型.圖2b中，加入L-Lys的濃度為0.2 g/L，此時(shí)在745 cm-1出現(xiàn)了新的特征吸收峰，而原712 cm-1處的吸收峰沒(méi)有消失，但強(qiáng)度減弱，可說(shuō)明此時(shí)構(gòu)成CaCO3的晶型有球霰石和方解石兩種，這一結(jié)論可結(jié)合掃描電鏡圖(圖1b)及XRD(圖3a)共同得到結(jié)論.增大L-Lys的濃度至0.4 g/L時(shí)，只余下745 cm-1處的吸收峰(圖2c)，712 cm-1處的特征峰基本消失，結(jié)合資料可推得碳酸鈣的晶型為球霰石；當(dāng)L-Lys的濃度增大到0.7 g/L，吸收峰同樣分別在876 cm-1、745 cm-1處出現(xiàn)，表示得到的橢圓球體結(jié)構(gòu)CaCO3的晶型仍為球霰石，這一結(jié)果同樣被其XRD譜圖所證實(shí)(圖3b).綜上：調(diào)整L-Lys溶液的濃度，制備出CaCO3晶體的不同晶型和形貌.

(a)純水;(b) 0.2 g/L;(c) 0.4 g/L;(d) 0.7 g/L.圖2 不同濃度L-Lys溶液中形成的CaCO3晶體的 傅立葉紅外譜圖Fig.2 FTIR spectra of CaCO3 particles obtained in the presence of different concentration L-Lys

(a) 0.2 g/L;(b) 0.7 g/L.圖3 不同濃度L-Lys溶液中形成的CaCO3晶體的 X射線粉末衍射圖Fig.3 XRD of CaCO3 particles obtained in the presence of different concentration L-Lys

2.3 不同濃度L-Lys溶液中CaCO3晶體的形成機(jī)理

在碳酸鈣的眾多晶型中，以方解石、文石和球霰石三種結(jié)晶最為常見(jiàn).其中方解石和文石熱力學(xué)穩(wěn)定性好，無(wú)論在礦石中還是生物界都能穩(wěn)定存在，因此在制備過(guò)程中，碳酸鈣也容易轉(zhuǎn)變?yōu)檫@兩種晶型.由于球霰石處于熱力學(xué)亞穩(wěn)態(tài)，穩(wěn)定性比方解石及文石略差，容易向著更穩(wěn)定的晶型轉(zhuǎn)變.在純水中制備CaCO3時(shí)，沿著(104)晶面生長(zhǎng)的碳酸鈣熱力學(xué)穩(wěn)定性最佳，碳酸鈣粒子優(yōu)先沿此方向生長(zhǎng)，進(jìn)而得到規(guī)則形狀的菱面體CaCO3晶體[9].碳酸鈣在沉積的過(guò)程中，優(yōu)先生成的是亞穩(wěn)態(tài)的晶型，然后再向更加穩(wěn)定的相態(tài)轉(zhuǎn)變，但是如果向該體系中添加控制劑，控制劑能夠阻止晶型之間的轉(zhuǎn)變，使其處在亞穩(wěn)態(tài)的晶型上[10].本文以L-Lys作為控制劑仿生合成碳酸鈣晶體.在CaCO3仿生合成過(guò)程中，碳酸銨能夠分解出CO2，經(jīng)保鮮膜小孔緩慢擴(kuò)散，進(jìn)入裝有軟模板及鈣離子的L-Lys-氯化鈣溶液中，堿性溶液中被吸收電離出CO32-，在L-Lys的調(diào)控下，CO32-與Ca2+于有機(jī)相界面處結(jié)合，在有機(jī)分子膜的包裹下形成了碳酸鈣晶體離子.L-Lys 與Ca2+相互間存在靜電作用，隨著不同濃度的L-Lys加入，形貌與晶型隨之發(fā)生改變.L-Lys 的等電點(diǎn)為9.49，實(shí)驗(yàn)的pH為8時(shí)，低于其等電點(diǎn)條件下，L-Lys可以電離出羧酸根負(fù)離子，同時(shí)可電離出氨基正離子，這種不平衡性可能是碳酸鈣能夠以球霰石亞穩(wěn)態(tài)晶型存在、生長(zhǎng)的因素之一[11].羧酸根離子與晶核之間存在強(qiáng)烈的靜電作用，這可能是球霰石碳酸鈣由透鏡形貌長(zhǎng)成微球形貌的原因，同樣我們也認(rèn)為N—H 和C—O鍵可形成氫鍵，結(jié)構(gòu)沿著c軸生長(zhǎng)成球霰石碳酸鈣微球[12-16].

3 結(jié) 論

以上實(shí)驗(yàn)證明，L-賴氨酸對(duì)CaCO3的結(jié)晶過(guò)程有著十分明顯的影響，采用簡(jiǎn)單易操作的氣相擴(kuò)散法，以不同濃度的L-賴氨酸有機(jī)生物小分子為添加劑，實(shí)現(xiàn)對(duì)碳酸鈣晶體形成過(guò)程的調(diào)控，成功制備出了透鏡、微球形貌的球霰石碳酸鈣晶體.本研究涉及反應(yīng)簡(jiǎn)單，易于操作，合成的產(chǎn)品晶型與形貌可控，這為碳酸鈣晶型和形貌的控制合成提供一條簡(jiǎn)單易行的途徑，為碳酸鈣藥物載體材料的制備提供了合成方法與條件.