MiR-145-3p抑制肝癌細(xì)胞系Huh-7的腫瘤干細(xì)胞特性

胡程郡，劉勝，唐豪佑，馬林，曾新，楊洋，黃孝彬，鄧大煒，李勇，李建水(通信作者*)

（1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 肝膽外二科，四川 南充 610000；2.川北醫(yī)學(xué)院 肝膽胰腸研究所，四川 南充 610000）

0 引言

據(jù)最新發(fā)布的《2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)》（Global Cancer Statistics 2020）估計(jì)，原發(fā)性肝癌是導(dǎo)致癌癥相關(guān)性死亡的第三大主要原因，每年約造成83萬(wàn)例死亡病例，同時(shí)其也是第六常被診斷的癌癥，據(jù)估計(jì)2020年約906,000例新發(fā)。肝細(xì)胞癌（Hepatocellularcarcinoma，HCC）約占所有原發(fā)性肝癌的75%-85%[1]，是最主要的原發(fā)性肝臟惡性腫瘤。由于早 期癥狀隱匿，就診率低，且復(fù)發(fā)率高，加上對(duì)化學(xué)和放射療法的頑固抗性，HCC被認(rèn)為是預(yù)后最差的癌癥之一[2-4]。HCC在世界范圍內(nèi)，特別是發(fā)展中國(guó)家中造成了沉重的醫(yī)療和社會(huì)負(fù)擔(dān)，尋找更有效的HCC治療方法，改善HCC患者預(yù)后迫在眉睫。

腫瘤干細(xì)胞（Cancerstemcell，CSC）是一類干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞，具有自我更新和產(chǎn)生非CSC腫瘤細(xì)胞群體的特性。自其概念提出至今，大量的研究報(bào)道了其在惡性腫瘤中的重要意義。CSC在癌癥的發(fā)生，進(jìn)展，轉(zhuǎn)移、耐藥性和復(fù)發(fā)中起著關(guān)鍵作用。特異性靶向CSC可能是有潛力的HCC新療法[5-8]。

MicroRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性的單鏈非編碼RNA，其長(zhǎng)度一般較短，約為22 nt，在物種間高度保守。其通過(guò)與靶mRNA堿基配對(duì)對(duì)其進(jìn)行切割或翻譯抑制，從而在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控作用。不同的miRNA和靶mRNA形成了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。研究顯示，miRNA參與了細(xì)胞中幾乎所有生物行為的調(diào)控[9-13]。

目前，已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)miR-145-3p在癌癥（包括肺癌、胃癌、結(jié)腸癌和前列腺癌）中被顯著下調(diào)，其能充當(dāng)強(qiáng)有力的抑癌因子和高效的腫瘤檢測(cè)標(biāo)志物[14-18]。然而，其在肝癌中的功能和機(jī)制尚未闡明。在我們的研究中，這個(gè)問(wèn)題被重點(diǎn)關(guān)注。我們分析了miR-145-3p在肝癌中的表達(dá)水平及其生物學(xué)功能。結(jié)果顯示，同在其他惡性腫瘤中一樣，miR-145-3p是強(qiáng)力的HCC抑制因子，其能顯著抑制HCC細(xì)胞系Huh-7的惡性行為和腫瘤干細(xì)胞特性。這項(xiàng)研究揭示了HCC腫瘤干細(xì)胞調(diào)控的新機(jī)制，并且可能為HCC治療提供新的療法。

1 材料和方法

1.1 生物信息學(xué)分析

使用在線工具UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)分析了miR-145的表達(dá)譜[19]。miR-145表達(dá)數(shù)據(jù)獲取自癌癥基因圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA，https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga），本項(xiàng)研究中共包含了369例原發(fā)性肝癌和49例正常肝組織。使用Kaplan-Meier Plotter (http://kmplot.com/analysis/index.php?p=service)分析miR-145同原發(fā)性肝癌的預(yù)后相關(guān)性，數(shù)據(jù)包含421 例RNA-seq平臺(tái)的原發(fā)性肝癌患者[20]。

1.2 腫瘤組織標(biāo)本

收集10對(duì)HCC癌及對(duì)照肝組織（癌旁組織）。所有標(biāo)本均來(lái)自于2019年1月1日到2019年6月1日期間，在川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外二科接受根治性肝癌切除的初治患者。所有腫瘤樣本均在川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科進(jìn)行了病理切片和免疫組化分析，證實(shí)為肝細(xì)胞癌。驗(yàn)證后的HCC和對(duì)照組織標(biāo)本在液氮中保存，用于miR-145-3p檢測(cè)。所有患者都簽署了用于研究目的標(biāo)本采集及使用的知情同意書。標(biāo)本采集、保存及使用程序已經(jīng)過(guò)川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞系Huh-7及永生化肝細(xì)胞LO2均購(gòu)買自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)（上海）。細(xì)胞培養(yǎng)條件如下：Huh-7細(xì)胞使用DMEM培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)），加入10% 胎牛血清（BI，以色列）、1% 青霉素及鏈霉素（BI），LO2細(xì)胞使用RMPI 1640培養(yǎng)基（Gibco），加入10%胎牛血清、1%青霉素及鏈霉素。所有細(xì)胞均在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)在恒溫孵箱（三洋，日本）中。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

慢病毒載體GV369-miR-145-3p和對(duì)照陰性載體（加入無(wú)意義序列）由吉?jiǎng)P基因（上海）構(gòu)建。根據(jù)吉?jiǎng)P慢病毒使用手冊(cè)推薦的轉(zhuǎn)染方案對(duì)Huh-7細(xì)胞進(jìn)行了慢病毒轉(zhuǎn)染，常規(guī)培養(yǎng)72h后，使用2.5 ug/ml終濃度的嘌呤霉素進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞篩選，經(jīng)篩選的細(xì)胞使用含終濃度1.25ug/ml嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)以抑制野生型細(xì)胞生長(zhǎng)。穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株使用流式細(xì)胞術(shù)及qRT-PCR進(jìn)行了驗(yàn)證。靶向miR-145-3p的siRNA由擎科生物合成，siRNA轉(zhuǎn)染使用Lipofectamine? 3000（Invitrogen，美國(guó)），按使用說(shuō)明進(jìn)行。siRNA轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)時(shí)間均在轉(zhuǎn)染后10天內(nèi)。

1.5 RNA提取和qRT-PCR

使用TRIzol（Ambion，美國(guó)）分別提取實(shí)驗(yàn)及對(duì)照細(xì)胞RNA，總RNA在Nanodrop 2000紫外分光光度計(jì)上進(jìn)行濃度測(cè)定，再使用 Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCRStarter Kit（銳博，廣州）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用特異性的莖環(huán)法引物（使用銳博生物專利技術(shù)，由銳博生物設(shè)計(jì)并合成）分別對(duì)miR-145-3p和內(nèi)參U6進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄條件如下：42℃ 60 min，70℃10min 。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）引物由銳博生物設(shè)計(jì)并合成。使用LightCycler?96 PCR儀（羅氏，瑞士）進(jìn)行qPCR，反應(yīng)體系為 20μl，程序如下：（1）預(yù)變性：95℃ 10min；（2）擴(kuò)增（40個(gè)循環(huán)）：95℃ 2秒，60℃ 20秒，70℃ 10秒；（3）熔解曲線分析：70-95℃。使用2-△△CT法對(duì)qPCR結(jié)果進(jìn)行分析，miR-145-3p相對(duì)表達(dá)量以U6為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行組間對(duì)比。

1.6 蛋白質(zhì)提取和免疫印跡試驗(yàn)（westernblotting）

使用RIPA蛋白裂解緩沖液（索萊寶，中國(guó)）裂解細(xì)胞，并加入蛋白酶抑制劑混合物（索萊寶），離心后收集上清液。用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒（索萊寶）定量蛋白，并通過(guò)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。針對(duì)CD44、CD133、EpCAM和GAPDH的一抗抗體購(gòu)買自Abcam（英國(guó)），辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗抗體購(gòu)買自索萊寶。熒光條帶使用Fusion電化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（VILBER，法國(guó)）檢測(cè)。使用AlphaEaseFC軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.7 5-乙炔基-2'-脫氧尿苷（5-Ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU）增殖試驗(yàn)

使用帶有Alexa Fluor 647染料的BeyoClick? EdU細(xì)胞增殖試劑盒（碧云天，中國(guó)）檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，過(guò)程如下：將轉(zhuǎn)入miR-145-3p的Huh-7細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞分別種到6孔板中，每組3孔。培養(yǎng)24h后，加入終濃度10 μmol/L的EdU，繼續(xù)培養(yǎng)4h。用4%多聚甲醛（PFA）固定細(xì)胞，使用含0.3%Triton X-100的PBS進(jìn)行穿透后，按使用說(shuō)明配制每孔0.5mL Click反應(yīng)混合物，孵育細(xì)胞30min。用Hoechst（1:1,000）作為細(xì)胞核示蹤劑，染色時(shí)間為5min后在暗室中室溫自然風(fēng)干。使用Leicamicrosystem熒光顯微鏡（Leica，德國(guó)）進(jìn)行成像，每孔隨機(jī)檢測(cè)3個(gè)視野，使用ImageJ軟件計(jì)數(shù)EdU陽(yáng)性和Hoechst陽(yáng)性細(xì)胞，最終得出增殖率。

1.8 克隆形成試驗(yàn)

分別將103個(gè)Huh-7-145OE和NC細(xì)胞種入6孔板，每組重復(fù)3孔，并在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，期間每4天換液1次。3周后，使用4%PFA固定細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色。將6孔板拍照后，使用ImageJ對(duì)每孔克隆集落計(jì)數(shù)，并計(jì)算各組細(xì)胞克隆形成率。

1.9 Transwell試驗(yàn)

使用Transwell?板（康寧，美國(guó)）檢測(cè)Huh-7細(xì)胞的遷移和侵襲能力。用于侵襲能力檢測(cè)的transwell小室用Matrigel Matrix（康寧）預(yù)孵育2h。每個(gè)小室中分別種入5×104（遷移）、105（侵襲）懸浮在無(wú)血清培養(yǎng)基中的Huh-7細(xì)胞。下室中加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基。在孵箱中培養(yǎng)48h后，輕柔洗去上室中的細(xì)胞。穿透至膜下的細(xì)胞用4%PFA固定，0.1%結(jié)晶紫染色，并在Leicamicrosystem顯微鏡下成像。使用ImageJ對(duì)隨機(jī)3個(gè)視野的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算平均每視野細(xì)胞數(shù)。

1.10 流式細(xì)胞術(shù)

使用分別與APC和PE染料偶聯(lián)的CD44和CD133抗體（Miltenyi Biotec，德國(guó)）來(lái)鑒定腫瘤干細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后懸浮在PBS中，同時(shí)加入抗CD44和抗CD133的熒光偶聯(lián)抗體，孵育30min后，使用NovoCyte流式細(xì)胞儀采集并在NovoExpress軟件中進(jìn)行分析。

1.11 成球試驗(yàn)

使用成球試驗(yàn)評(píng)估Huh-7細(xì)胞的干性。過(guò)程如下：細(xì)胞經(jīng)胰酶消化、計(jì)數(shù)后種植到超低附著培養(yǎng)瓶（Thermo Scientific，美國(guó)）中，每瓶104個(gè)細(xì)胞，每組重復(fù)3瓶。成球試驗(yàn)特異性培養(yǎng)基成分如下：在無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基中加入10%牛血清白蛋白（索萊寶），5mg/mL胰島素（Gibco），20μng/mL表皮生長(zhǎng)因子（EGF，Gibco），20μng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF，Gibco）和 1：50的 B27（Gibco）。細(xì)胞在孵箱中培養(yǎng)1周，分別在第5和第7天使用Leicamicrosystem顯微鏡隨機(jī)拍攝5個(gè)視野，對(duì)每視野下的細(xì)胞球進(jìn)行計(jì)數(shù)，使用ImageJ測(cè)量球體直徑。

1.12 統(tǒng)計(jì)分析

所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均使用GraphPad Prism 8.0.2（GraphPad Prism Software，美國(guó)）分析。組間數(shù)據(jù)通過(guò)studentt檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P值小于 0.05、0.01、0.001分別標(biāo)注為 *、**、***。

2 結(jié)果

2.1 MiR-145在HCC中被顯著下調(diào)，且低表達(dá)的miR-145與更差的預(yù)后相關(guān)。

已有多項(xiàng)研究證明了miR-145在HCC組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，但其潛在的作用和機(jī)制并未被闡明[21-24]。我們使用在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析工具UALCAN分析了來(lái)自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的369例HCC和49例正常肝組織標(biāo)本數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，miR-145在HCC組織中被顯著下調(diào)（P<0.0001, 圖1a），并且，低水平的miR-145與TP53基因突變相關(guān)（P<0.001, 圖1b），這表明miR-145可能是HCC的潛在抑癌因子。

因此，我們收集了10對(duì)HCC和癌旁組織，并使用qRTPCR檢測(cè)了miR-145-3p的表達(dá)。檢測(cè)結(jié)果與前期生物信息學(xué)分析一致，在HCC組織中，miR-145-3p表達(dá)明顯低于正常組織（P=0.0253, 圖1c）。

進(jìn)一步地，我們分析了miR-145同HCC預(yù)后的關(guān)聯(lián)。使用Kaplan-Meier Plotter分析421 例來(lái)自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的RNA-seq平臺(tái)HCC患者預(yù)后信息。生存曲線顯示，低表達(dá)的miR-145與更差的生存顯著相關(guān)（P=0.028，圖1d）。

圖1 正常和肝癌組織中miR-145的表達(dá)差異以及miR-145同肝癌患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)

2.2 MiR-145-3p在Huh-7細(xì)胞中低表達(dá)，且能顯著抑制Huh-7細(xì)胞的惡性行為。

我們檢測(cè)了HCC細(xì)胞系Huh-7和永生化肝細(xì)胞LO2的miR-145-3p表達(dá)，發(fā)現(xiàn)同LO2相比，Huh-7細(xì)胞的miR-145-3p表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.0001，圖2a）。這與上述組織數(shù)據(jù)以及生信分析結(jié)合，提示了miR-145-3p作為HCC抑癌因子的高度可能性。

在Huh-7細(xì)胞中，我們使用GV369-miR-145-3p慢病毒上調(diào)了miR-145-3p的表達(dá)。建立高表達(dá)miR-145-3p的Huh-7穩(wěn)轉(zhuǎn)株（記為Huh-7-145OE）及其對(duì)照轉(zhuǎn)染細(xì)胞（記為 Huh-7-NC）用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)（P<0.0001，圖2b）。

我們分析了miR-145-3p對(duì)Huh-7細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。使用EdU增殖試驗(yàn)分析Huh-7-145OE和NC細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果表明，高表達(dá)miR-145-3p的Huh-7（Huh-7-145OE）細(xì)胞,其增殖速度相比轉(zhuǎn)染了對(duì)照慢病毒的細(xì)胞（Huh-7-NC）受到顯著抑制（P<0.001，圖2c），同時(shí)，克隆形成試驗(yàn)的結(jié)果表明，其克隆形成率也明顯低于對(duì)照細(xì)胞（P<0.01，圖2d）。Transwell試驗(yàn)被用于檢測(cè)細(xì)胞的侵襲和遷移能力。我們觀察到，同NC細(xì)胞相比，Huh-7-145OE細(xì)胞的侵襲和遷移能力出現(xiàn)了明顯的下降（P<0.01圖2e和2f）。這些結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染了miR-145-3p后，Huh-7細(xì)胞的增殖、克隆形成、侵襲和遷移能力被顯著抑制。

圖2 Huh-7細(xì)胞中miR-145的表達(dá)及miR-145-3p在Huh-7細(xì)胞中的生物學(xué)功能

2.3 MiR-145-3p抑制Huh-7細(xì)胞的干細(xì)胞特性。

腫瘤干細(xì)胞已經(jīng)在包括HCC在內(nèi)的多種癌癥中被發(fā)現(xiàn)和鑒定[25,26]。2018年，zhu等報(bào)道了miR-145能抑制結(jié)直腸癌的干性15。由于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miR-145-3p能抑制Huh-7細(xì)胞的惡性行為，我們進(jìn)一步分析了其對(duì)Huh-7細(xì)胞干性的影響。

成球試驗(yàn)常用于檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的干性。我們發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)了5天和7天后，轉(zhuǎn)染了miR-145-3p的Huh-7細(xì)胞形成的細(xì)胞球，其直徑（P<0.01，P<0.05，圖3a）和數(shù)量（P<0.05，P<0.05，圖3a）明顯低于Huh-7-NC細(xì)胞。結(jié)果初步表明，miR-145-3p對(duì)Huh-7細(xì)胞干性產(chǎn)生了抑制。

CD44和CD133作為HCC的干性標(biāo)志物已被廣泛認(rèn)可[27]。我們使用流式細(xì)胞術(shù)分析了Huh-7細(xì)胞表面CD44和CD133的表達(dá)情況。同成球的結(jié)果一致，在Huh-7-145OE細(xì)胞中，CD133+ CD44+ 細(xì)胞比例明顯低于Huh-7-NC細(xì)胞（P<0.01，圖3b）。這表明miR-145-3p顯著抑制了Huh-7細(xì)胞的干細(xì)胞特性。

使用蛋白免疫印跡試驗(yàn)，我們還檢測(cè)了Huh-7細(xì)胞中HCC干性基因的表達(dá)情況。CD44、CD133和EpCAM是被廣泛接受了HCC干性標(biāo)志物[27]，我們檢測(cè)了其蛋白表達(dá)情況。結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染了miR-145-3p后，CD44、CD133以及EpCAM的蛋白表達(dá)水平都出現(xiàn)了不同程度的下調(diào)（P<0.01，圖3c）。

圖3 MiR-145-3p對(duì)Huh-7細(xì)胞干性的影響

2.4 抑制Huh-7-145OE細(xì)胞中的miR-145-3p表達(dá)恢復(fù)了Huh-7細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞特性。

在Huh-7-145OE細(xì)胞中，我們?cè)俅无D(zhuǎn)染了靶向miR-145-3p的siRNA，抑制了其表達(dá)（抑制miR-145-3p組和對(duì)照組分別記為si145組和siNC組，P<0.001，圖4a）。我們對(duì)轉(zhuǎn)染了siRNA的Huh-7細(xì)胞進(jìn)行了成球試驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)以分析其腫瘤干細(xì)胞特性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著miR-145-3p的表達(dá)再次被抑制，Huh-7細(xì)胞的成球能力得到了提升（圖4b），且CD133+ CD44+細(xì)胞比例也再次提高（P<0.05，圖4c）。

最后，我們?cè)俅螜z測(cè)了細(xì)胞中CD44、CD133和EpCAM的表達(dá)。與之前的結(jié)果一致，抑制miR-145-3p后，這些干性基因的蛋白表達(dá)再次升高（P<0.01，圖4d）。這些結(jié)果都表明，miR-145-3p是強(qiáng)有力的HCC抑癌基因，其能顯著抑制HCC細(xì)胞系Huh-7的干細(xì)胞特性。

圖4 再次抑制miR-145-3p后，Huh-7-145OE細(xì)胞干性被恢復(fù)

3 討論

由于早期診斷率低、嚴(yán)格的手術(shù)適應(yīng)證以及缺乏移植來(lái)源，HCC在世界范圍內(nèi)，尤其是發(fā)展中國(guó)家中造成了很大的醫(yī)療和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。加強(qiáng)早期患者篩查和系統(tǒng)治療能會(huì)帶來(lái)更多的臨床獲益。近年來(lái)，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局推薦了多種系統(tǒng)性藥物，包括酪氨酸激酶抑制劑（索拉非尼，侖伐替尼）和抗PD-1藥物（納武單抗和帕博利珠單抗），作為目前的一線治療藥物，它們的療效顯示出HCC治療中令人鼓舞的進(jìn)步[28]。然而，HCC仍是癌癥相關(guān)死亡的第三大主要原因，反映出目前的治療方法仍有相當(dāng)程度的不足。

腫瘤干細(xì)胞在惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和復(fù)發(fā)過(guò)程中起關(guān)鍵作用。隨著CSC研究的深入，越來(lái)越多的研究報(bào)道了肝細(xì)胞癌中干樣腫瘤細(xì)胞的存在。HCC中CSC表現(xiàn)出的高增殖潛能、致瘤性、抗凋亡能力，以及自我更新和分化為異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞的潛力，顯著加速了腫瘤的進(jìn)展[29]。有報(bào)道指出，高水平的CD133表達(dá)與更晚的腫瘤分期、更高級(jí)別的分級(jí)和復(fù)發(fā)率、更短的總生存期相關(guān)[30]。類似地，EpCAM + AFP+的HCC亞型具有肝干/祖細(xì)胞的特征，且EpCAM +HCC細(xì)胞與腫瘤的進(jìn)展和侵襲性相關(guān)[31]。靶向CSC的治療是非常有潛力的HCC療法，但受限于復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境、CSC強(qiáng)大的耐藥性以及自我更新能力，這種療法尚未取得顯著的療效[32]。因此，加深CSC調(diào)控機(jī)制探索，尋找更精確、更有力的治療靶點(diǎn)，是CSC靶向療法未來(lái)的發(fā)展方向。

MicroRNA研究作為近年來(lái)表觀遺傳學(xué)和腫瘤研究的熱點(diǎn)，已受到廣泛關(guān)注。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)了miR-145-3p在HCC中充當(dāng)抑癌因子，并進(jìn)一步證明了其對(duì)HCC腫瘤干細(xì)胞存在顯著的抑制作用。這為HCC的干細(xì)胞研究找到了新的潛在的治療方法。盡管如此，miR-145-3p調(diào)節(jié)Huh-7腫瘤干細(xì)胞特性的機(jī)制還有待于進(jìn)一步探索，尋找更多的精確治療靶點(diǎn)。希望有朝一日，特異性靶向腫瘤干細(xì)胞的肝癌新療法能為HCC患者帶來(lái)更好的臨床獲益。

縮寫詞

HCC,hepatocellular carcinoma，肝細(xì)胞癌; CSC, cancer stem cells，腫瘤干細(xì)胞; miRNA, microRNA，微小RNA; TCGA, The Cancer Genome Atlas，癌癥基因圖譜;EdU, 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine，5-乙炔基-2’ -脫氧尿苷; PFA, paraformaldehyde，多聚甲醛;PBS,phosphate buffer solution，磷酸鹽緩沖液; HRP, horseradish peroxidase辣根過(guò)氧化物酶。