溫腎強(qiáng)骨丸對(duì)脾腎陽虛型骨質(zhì)疏松癥大鼠骨轉(zhuǎn)化指標(biāo)的影響?

鄧 強(qiáng)，王雨榕，李中鋒，彭冉東，李軍杰，徐浩軍

1 甘肅省中醫(yī)院脊柱骨二科,甘肅 蘭州730050；2 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)

骨質(zhì)疏松癥是目前老年人群主要罹患的疾病之一，西醫(yī)學(xué)治療方法較為單一，臨床研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥防治骨質(zhì)疏松癥具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，本病屬中醫(yī)學(xué)“骨痿”“骨枯”等范疇，主要與腎、肝、脾3 臟功能有關(guān)，其中腎精虧虛是發(fā)病的基本病機(jī)，近年多數(shù)醫(yī)家從溫補(bǔ)脾腎入手治療本病取得了良好療效。骨質(zhì)疏松癥和脾腎陽虛中醫(yī)證型造模方法種類多樣，骨質(zhì)疏松癥造模方法主要包括去勢(shì)型、藥物誘導(dǎo)型、失用誘導(dǎo)型、飲食誘導(dǎo)型、基因敲除型、自然退變型等［1］，其中去勢(shì)型造模方法具有模型穩(wěn)定、可操作性強(qiáng)、可信度高，經(jīng)濟(jì)適用等特點(diǎn)，應(yīng)用廣泛。腎陽虛造模方法有注射氫化可的松、灌胃腺嘌呤、切除性腺等［2］；脾陽虛造模方法主要包括番瀉葉/大黃灌胃、飲食失節(jié)、勞倦過度等。根據(jù)其病因病機(jī)，采用番瀉葉灌胃+飲食失節(jié)+勞倦過度方法聯(lián)合造?？筛媚M人類脾腎陽虛發(fā)病機(jī)制。本研究通過建立脾腎陽虛型骨質(zhì)疏松癥大鼠模型，觀察各組大鼠骨轉(zhuǎn)化指標(biāo)變化情況，進(jìn)一步探討溫腎強(qiáng)骨丸防治脾腎陽虛型骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF 級(jí)SD 大鼠70 只，雌性，體質(zhì)量（220±20）g，購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（甘）2015-0005。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物喂養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（SPF 級(jí)），普通大鼠顆粒飼料喂養(yǎng)，飲用水為高壓滅菌自來水。環(huán)境溫度4～18℃，光照時(shí)間7∶OO AM～7∶OO PM，暗室時(shí)間7∶OO PM～7∶OO AM，空氣濕度45%～65%。

1.2 試劑與藥品抗酒石酸堿性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)試劑盒（江蘇菲亞生物科技有限公司，批號(hào)：MM-0620R2）；大鼠尿Ⅰ型膠原交聯(lián)N 末端肽（type I collagen cross linked N telopeptides in urine，U-NTX）試劑盒（江蘇菲亞生物科技有限公司，批號(hào)：MM-1056R2）；骨堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，BLAP）試劑盒（江蘇菲亞生物科技有限公司，批號(hào)：MM-0619R2）；雌二醇（estradiol，E2）試劑盒（江蘇菲亞生物科技有限公司，批號(hào)：MM-0575R2）；尿型膠原交聯(lián)C 末端肽（C-terminal telopeptides of type I collagen，U-CTX)、試劑盒（江蘇菲亞生物科技有限公司，批號(hào)：MM-1037R2）；骨鈣蛋白（osteocalcin，BGP)試劑盒（江蘇菲亞生物科技有限公司，批號(hào)：MM-0700R1）；氫化可的松注射液（紫光古漢集團(tuán)衡陽制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H43021210，規(guī)格：2 mL∶10 mg）；番瀉葉（購(gòu)自甘肅省中醫(yī)院中藥藥房）；溫腎強(qiáng)骨丸（甘肅省中醫(yī)院，批號(hào)：20180926，規(guī)格：40 g/瓶）；阿侖膦酸鈉（杭州默沙東制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20130085，規(guī)格：70 mg/片）；甘藍(lán)、精煉豬油自備，蒸餾水、生理鹽水、10%水合氯醛、10%甲醛溶液、苦味酸等由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。番瀉葉為100%水煎液。

1.3 儀器L600 型臺(tái)式離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；Benchmark aaPlus 型連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BIO-RAD 公司）；Q5000型紫外分光光度計(jì)（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司）；DK-S26 型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；NW10VF 型超純水系統(tǒng)（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 造模 將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、西藥組（阿侖膦酸鈉）及溫腎強(qiáng)骨丸高、中、低劑量組，除正常組外，其余各組大鼠采取去勢(shì)法（切除雌性SD 大鼠雙側(cè)卵巢）+注射氫化可的松+番瀉葉灌胃+飲食失節(jié)+勞倦過度方法造模：大鼠禁食12 h 后腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g），麻醉起效后剔除兩側(cè)腹部皮毛，用75%酒精消毒，在雙側(cè)肋下1～1.5cm處縱形切開入腹，結(jié)扎雙側(cè)卵巢動(dòng)脈，切除雙側(cè)卵巢及周圍脂肪，逐層縫合［3］。假手術(shù)組只暴露雙側(cè)卵巢，不做切除。去勢(shì)術(shù)后第2天開始，每日上午9時(shí)用100%番瀉葉水煎液灌胃，每只2 mL，正常組與假手術(shù)組灌胃等量生理鹽水；每日下午3 時(shí)將大鼠置于38℃恒溫水浴中游泳至疲勞（疲勞標(biāo)準(zhǔn)為全身下沉至沒頸，不能堅(jiān)持游泳）；單日喂飼甘藍(lán)每只10 g，雙日喂精煉豬脂每只2 mL，正常組與假手術(shù)組予普通鼠糧，期間各組均自由飲水［4］，大鼠術(shù)后1周開始肌肉注射氫化可的松注射液（2 mL∶10 mg）5 mg/kg，假手術(shù)組肌肉注射等量生理鹽水，每周4次。

1.4.2 干預(yù)方法 造模8 周，確定骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型成功后溫腎強(qiáng)骨丸高、中、低劑量組按人、鼠體型系數(shù)折算為成人等效劑量（生藥含量分別為1.72、0.86、0.43 g/kg，并以每千克體質(zhì)量20 mL蒸餾水稀釋，制成混懸液灌胃），每日1 次；正常組和模型組灌胃等劑量生理鹽水；西藥組按人鼠等效劑量給予阿侖膦酸6 mg/kg，每周1次，持續(xù)灌胃8周。

1.5 血清骨轉(zhuǎn)化指標(biāo)測(cè)量所有動(dòng)物干預(yù)8 周后禁食水12 h，腹腔麻醉后心臟取血4 mL，嚴(yán)格按照試劑盒說明書運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)TRAP、U-NTX、BLAP、E2、U-CTX、BGP 等骨轉(zhuǎn)化指標(biāo)，其質(zhì)量濃度按說明制作各自標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中的含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般活動(dòng)造模期間，第1～3 周各組大鼠一般狀態(tài)比較基本無差異；第4 周，模型組大鼠活動(dòng)較正常組及假手術(shù)組減少，開始出現(xiàn)毛發(fā)無澤、掉毛現(xiàn)象，爪甲顏色較淺，大便較稀軟；第5 周，模型組大鼠出現(xiàn)大便清稀，甚者如水狀，爪甲顏色變淡，毛發(fā)枯萎無華，尾巴涼，弓背倦怠，喜扎堆；第6～8周，模型組大鼠上述狀態(tài)較第5周更甚，且飲食、飲水量低于空白組，游泳持續(xù)時(shí)間為正常組的1/2，表明模型組大鼠體力、能量代謝較正常大鼠組及假手術(shù)組大鼠降低。溫腎強(qiáng)骨丸干預(yù)后第1～2 周，與模型組相比，溫腎強(qiáng)骨丸各劑量組大鼠一般情況基本無明顯差異；第3～4 周，溫腎強(qiáng)骨丸各劑量組大鼠活動(dòng)較模型組明顯增多，掉毛明顯減少，扎堆現(xiàn)象有所改善，大便仍清??；第4～6周，溫腎強(qiáng)骨丸各劑量組大鼠無扎堆現(xiàn)象，毛發(fā)色澤明顯改善，尾巴溫度恢復(fù)正常，大便稀軟但成形，大便量較多；第7～8 周，與模型組相比，溫腎強(qiáng)骨丸各劑量組大鼠大便質(zhì)地恢復(fù)，無便溏癥狀，飲食、飲水量恢復(fù)正常，活動(dòng)明顯增多，脾腎陽虛癥狀明顯改善。

2.2 骨代謝指標(biāo)與正常組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠BALP、E2含量降低（P＜0.05），BGP、TRAP、U-NTX、U-CTX含量升高（P＜0.05）；與模型組相比，阿侖膦酸鈉組和溫腎強(qiáng)骨丸各劑量組BALP、E2含量均增高（P＜0.05）；BGP、TRAP、U-NTX、U-CTX 含量均下降（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠骨代謝指標(biāo)比較（±s）

表1 各組大鼠骨代謝指標(biāo)比較（±s）

注：*表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05；△表示與溫腎強(qiáng)骨丸低劑量組比較，P＜0.05

組別正常組模型組假手術(shù)組溫腎強(qiáng)骨丸高劑量組溫腎強(qiáng)骨丸中劑量組溫腎強(qiáng)骨丸低劑量組阿侖膦酸鈉組鼠數(shù)8 8 8 8 8 8 8 BGP（ng/L）194.59±14.91 231.50±40.25*168.68±17.06 179.42±19.27#△186.69±21.38#181.46±16.20#173.63±31.48#TRAP（pg/mL）625.07±158.43 933.72±53.09*703.40±244.26 828.38±58.16#△830.61±52.49#819.60±52.49#824.28±62.89#U-NTX（nmol/L）3.95±0.56 4.86±0.71*4.31±0.95 3.71±0.88#△4.40±1.82#3.97±1.44#3.90±0.89#U-CTX（μg/L）0.28±0.62 0.41±0.22*0.34±0.20 0.34±0.20#△0.40±0.10#0.32±0.20#0.39±0.70#BALP（μg/L）4.02±2.91 1.91±1.41*3.53±2.57 2.40±1.52#△2.51±1.34#2.90±0.49#2.10±0.54#E2（ng/L）19.61±0.52 16.72±1.78*17.57±2.97 21.32±1.19#△19.90±1.82#17.31±1.39#25.19±1.95#

3 討論

骨質(zhì)疏松癥的治療臨床常用藥物主要有抗骨吸收藥物和促骨形成藥物兩類，但由于長(zhǎng)期用藥副作用較大、患者經(jīng)濟(jì)壓力大等缺點(diǎn)，使得中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松癥的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)成為研究熱點(diǎn)［5-6］。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，從基因調(diào)控水平證實(shí)中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥靶向治療提供了科學(xué)依據(jù)。

中醫(yī)藏象理論認(rèn)為，腎“主骨生髓”，主人體生長(zhǎng)發(fā)育，為“先天之本”，受“后天之本”脾臟運(yùn)化的水谷精微充養(yǎng)，因此人體骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育與脾腎密切相關(guān)，且在骨質(zhì)疏松癥的中醫(yī)證型研究中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)脾腎陽虛證是骨質(zhì)疏松癥的主要證型［7］。臨床研究證實(shí)補(bǔ)腎健脾方藥治療脾腎陽虛型骨質(zhì)疏松癥有顯著療效，如潘永苗等［8］用補(bǔ)腎健脾通絡(luò)湯治療骨質(zhì)疏松癥，發(fā)現(xiàn)其能提高患者骨密度，減輕患者癥狀。王巖等［9］在口服鈣爾奇（碳酸鈣D3）片、羅鈣全（骨化三醇丸）的基礎(chǔ)上加用補(bǔ)腎健脾益氣方（茯苓9 g，白術(shù)9 g，陳皮9 g，人參6 g，生地黃6 g，枸杞子30 g，麥門冬15 g）治療脾腎氣虛型老年骨質(zhì)疏松癥取得了良好療效。黃琳玲等［10］采用自擬益腎健脾化瘀方治療絕經(jīng)后脾腎陽虛型骨質(zhì)疏松癥，發(fā)現(xiàn)該方可改善臨床癥狀，提高患者骨密度。

BALP 是成骨細(xì)胞的一種細(xì)胞外酶，BALP 的增殖、分化和成熟與骨骼正常生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，骨骼礦化受阻時(shí)，成骨細(xì)胞合成大量堿性磷酸酶，使血清BALP 明顯升高。骨特異性堿性磷酸酶參與骨形成過程，在血清中穩(wěn)定，是成骨細(xì)胞成熟和具有活性的標(biāo)志［11］。BALP 被認(rèn)為是最精確的骨形成標(biāo)志物之一。血清BALP 定量測(cè)定與動(dòng)態(tài)觀察對(duì)骨代謝疾病，特別是骨質(zhì)疏松癥的早期診斷、治療效果監(jiān)測(cè)、病情預(yù)后判斷等提供有效依據(jù)。BGP是反映骨形成的特異性生化指標(biāo)，不僅參與骨吸收調(diào)節(jié)，更重要的是參與基質(zhì)礦化過程及成骨細(xì)胞分化，與骨轉(zhuǎn)換相關(guān)，能維持骨正常礦化速率，抑制軟骨礦化速率，并抑制骨異常羥磷灰石結(jié)晶形成［12］。因此，BGP 通常被認(rèn)為是反映骨形成的生化指標(biāo)。TRAP 作為第2 代骨吸收標(biāo)志物，是有特異和高敏感度的骨吸收指標(biāo)［13］。在骨的有機(jī)質(zhì)中，90%為Ⅰ型膠原，NTX 與CTXI 水平均能反映破骨細(xì)胞骨吸收活性［14］，是骨吸收的重要生化標(biāo)志物［15］，其升高程度與破骨細(xì)胞活性增高程度一致，可靈敏反映骨代謝變化，是評(píng)價(jià)骨形態(tài)計(jì)量學(xué)骨吸收的重要參數(shù)［16］。研究［17］發(fā)現(xiàn)，NTX與CTX 是骨代謝的敏感指標(biāo)，與骨密度改變、骨折發(fā)生具有相關(guān)性，其增加可提示骨關(guān)節(jié)炎患者骨量減少。

溫腎強(qiáng)骨丸是甘肅省中醫(yī)院脊柱骨二科經(jīng)驗(yàn)方藥，由淫羊藿、骨碎補(bǔ)、枸杞子和丹參等7 味中藥組成，具有溫腎強(qiáng)骨、活血通絡(luò)功效，臨床用于治療脾腎陽虛型骨質(zhì)疏松癥取得良好效果，因此，本實(shí)驗(yàn)基于臨床療效觀察研究其對(duì)脾腎陽虛型骨質(zhì)疏松癥大鼠的防治作用，為臨床廣泛運(yùn)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)采取去勢(shì)（切除大鼠卵巢）+注射氫化可的松+番瀉葉灌胃+飲食失節(jié)+勞倦過度方法制造脾腎陽虛型骨質(zhì)疏松癥大鼠模型，病癥相結(jié)合，更好地模擬人類發(fā)病機(jī)制，結(jié)果顯示，模型組大鼠BALP、E2含量降低，BGP、TRAP、U-NTX、U-CTX含量升高；與模型組相比，阿侖膦酸鈉組和溫腎強(qiáng)骨丸方各組BALP、E2均增高，BGP、TRAP、U-NTX、U-CTX含量均下降。

綜上所述，溫腎強(qiáng)骨丸改善了脾腎陽虛型骨質(zhì)疏松大鼠的骨代謝生化指標(biāo)，表明溫腎強(qiáng)骨丸對(duì)脾腎陽虛型骨質(zhì)疏松有一定防治作用，但是其藥動(dòng)學(xué)仍需進(jìn)一步研究，并且其作用機(jī)制不明確，未來可基于骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的信號(hào)通路進(jìn)一步深入研究其對(duì)骨代謝影響的作用機(jī)制，為溫腎強(qiáng)骨丸的廣泛臨床應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。