腹部推拿對慢傳輸型便秘大鼠神經(jīng)遞質(zhì)及5-HT 受體表達的調(diào)節(jié)作用?

王棟良，馬鑫文

新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院推拿科，新疆，烏魯木齊830000

慢傳輸型便秘（slow transit constipation，STC）是由于大腸功能紊亂，傳導(dǎo)失常而導(dǎo)致的排便周期延長和排便困難，屬慢性、原發(fā)性、功能性、結(jié)腸性和傳輸緩慢性便秘。其發(fā)病機制可能與腸神經(jīng)系統(tǒng)及Cajal 間質(zhì)細胞、中樞神經(jīng)及自主神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)功能障礙、激素水平異常等有關(guān)［1-3］。此外，長期不良的生活習(xí)慣，如起居無規(guī)律、飲食過于精細、減肥、節(jié)食及缺少運動等，均可使腸道受刺激不足，排便動作缺乏，糞便在腸腔內(nèi)滯留時間過久而形成STC［4-6］。近年研究[7-10]發(fā)現(xiàn)，5-羥色胺（5-hydroxyptrytamine,5-HT）受體表達異常與STC 等多種胃腸道疾病的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，因此調(diào)節(jié)5-HT相關(guān)受體表達水平可能是治療STC 的潛在有效途徑。

腹部推拿是中醫(yī)特色療法之一。有研究表明，腹部推拿能改善STC 患者的臨床癥狀，緩解患者疾病狀態(tài)［11-15］，但其作用機制及對神經(jīng)遞質(zhì)及5-HT受體表達的作用目前尚沒有明確報道。本研究通過探討腹部推拿對STC 大鼠體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)及5-HT受體表達的影響，為腹部推拿在STC 治療中的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與藥物健康雄性SD 大鼠39 只，SPF級，6 周齡，體質(zhì)量（180±20）g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，實驗動物合格證號：SCXK（新）2018-0002），自由進食、飲水飼養(yǎng)于實驗動物房。涉及動物實驗的操作遵照新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物管理和使用委員會相關(guān)規(guī)定（批號：IACVC 20180516-57）。5-HT3R、5-HT4R 和GAPDH 抗體均購自Proteintech公司；RIPA 蛋白裂解液、SP、NOS 及VIP 檢測ELISA試劑盒購自上海碧云天公司；ECL 顯色液購自Thermo 公司；酶標(biāo)儀購自北京島津公司；雙垂直電泳儀、轉(zhuǎn)印電泳儀、凝膠成像儀均購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。

1.2 STC 大鼠模型建立及分組將39 只大鼠隨機分為對照組、模型組及推拿組，每組13 只。模型組及推拿組大鼠采用腸神經(jīng)節(jié)消融術(shù)造模：將動物麻醉后仰臥于手術(shù)臺上，無菌條件下取腹部正中切口，長約4 cm，充分暴露結(jié)腸，取寬度約1 cm雙層紗布，使用生理鹽水完全浸濕，包繞全部結(jié)腸，紗布長度與腸管相當(dāng)，保持紗布濕潤，每5 min沿紗布長軸間隔約1 cm 各滴3 滴0.25%苯扎氯銨溶液，其余器官用濕紗布覆蓋、隔離，共30 min，術(shù)后逐層關(guān)腹，對照組不做處理，相同條件下繼續(xù)喂養(yǎng)。術(shù)后12 h 恢復(fù)大鼠正常飼養(yǎng)，自由進食、飲水，給予青霉素鈉抗炎1 周，觀察大鼠排便及精神和營養(yǎng)狀況。為確保實驗結(jié)果可靠性和減少誤差，所有模型制備均由指定動物實驗員完成，且以糞粒干燥、粒形縮短、排便費力、日排便量低于對照組大鼠作為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 按摩方法造模成功后，根據(jù)文獻方法［16］，選用腹部推拿中核心手法中“按法”“摩法”作為主要干預(yù)手法。為保證手法的一致性，實驗前應(yīng)用YF-3 手法測定儀事先采集操作手法信息，對手法的用力大小、頻率等進行標(biāo)定，建立手法操作模型。實驗過程中手法由專人操作，手法操作者除掌握手法要點外，還需應(yīng)用YF-3 手法測定儀進行評測，待其手法的力度大小、頻率形成的波形軌跡與手法模型基本一致后，方可于實驗大鼠身上操作。取穴參考《實驗推拿學(xué)》［17］選取大鼠的關(guān)元穴、中脘穴。腹部按法：手法操作者以右手食指、中指二指疊按置于關(guān)元穴上，余指并攏。以右手腕關(guān)節(jié)為支點，食、中二指掌指部主動施力，向恥骨聯(lián)合脊柱方向徐徐按下，力量自輕至重，待指面可感覺到大鼠腹部動脈輕微搏動，按而留之，完成此過程大約30 s，后維持此時的壓力及其所達到的深度，靜待1 min后手法操作者掌指部徐徐上提，直至完全離開受壓部位，此過程大約持續(xù)30 s。如此反復(fù)操作2 次，共4 min。腹部摩法：手法操作者肘關(guān)節(jié)自然屈曲，腕部放松，指掌自然伸直，食指、中指并攏。以食指、中指指面著于施術(shù)部位，以腕關(guān)節(jié)為中心，連同掌、指作環(huán)形摩動，并以中脘穴為圓心，做順時針方向節(jié)律性環(huán)旋運動，頻率宜緩，每分鐘20～30 次，如此反復(fù)操作6 min，每天治療1 次，連續(xù)治療14 天。對照組及模型組只擺相同體位，不進行腹部推拿。實驗期間大鼠正常飲食，每日收集各組大鼠糞便，稱重后記為濕重，然后置于90℃恒溫干燥箱內(nèi)干燥3 h 至恒重后再次稱重，記為干重，并按照以下公式計算各組大鼠糞便含水率，且在最后一次推拿24 h 后進行后續(xù)實驗。糞便含水率（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.4 大鼠血漿中SP、NOS 及VIP 水平測定大鼠眼眶后靜脈叢取血至肝素潤洗過的離心管中，室溫靜置5 min，然后置于離心機中，4℃，離心半徑13.5 cm，3500 r/min 離心10 min，取上清液，按ELISA試劑盒說明書檢測SP、NOS及VIP含量。

1.5 首粒黑便排出時間測定每組取6 只大鼠，禁食不禁水24 h 后，每只大鼠灌胃2 mL 濃度為100 g/L的活性炭懸液，記錄各組大鼠首粒黑便排出時間。由于大鼠禁食后糞便呈黑色，排出黑便不易看出，可每過半小時換1 次底盆，并將糞便倒入水池中放水，用棍子擠壓糞便，如果有黑色活性炭粉末漂出則記錄時間。結(jié)束后各組大鼠用于后續(xù)結(jié)腸組織蛋白水平的測定。

1.6 大鼠腸推動率每組取6 只大鼠，禁食不禁水24 h后，每只大鼠灌胃1 mL濃度為100 g/L的活性炭混懸液，灌胃1 h 后用烏拉坦腹腔注射麻醉，立即解剖，取出從幽門到直腸末端的全部腸道，測量腸道全長以及幽門至黑色物質(zhì)前端的距離，計算腸推動率。

腸推動率（%）=幽門至黑色物質(zhì)前端的距離/腸道全長×100%

1.7 大鼠結(jié)腸組織樣本采集及組織蛋白提取每組取6 只大鼠，頸椎脫臼處死后迅速分離結(jié)腸組織，用生理鹽水小心清洗干凈腸道內(nèi)容物，用濾紙吸干表面水分后將一部分結(jié)腸組織放入10%中性甲醛中固定，其余放入玻璃勻漿器中，加入RIPA 蛋白裂解液，用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解，置于4℃離心機以離心半徑13.5 cm，12 000 r/min離心10 min，用移液槍將上清液移至另一干凈離心管中，并加入SDS 上樣緩沖液，混勻后放入100℃水浴5 min，然后放入-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 蘇木精-伊紅（Hematoxylin-eosin staining，HE）染色將在10%中性甲醛中固定24 h 后的結(jié)腸組織轉(zhuǎn)移至75%的酒精中，經(jīng)自動組織脫水機脫水、透明處理，在石蠟包埋機中浸蠟、包埋，進行5μm 切片，水浴展開、撈片、瀝干，放溫箱中烘干，置于烘箱中60℃烤2 h，常規(guī)HE 染色，在顯微鏡下進行組織病理學(xué)觀察。HE 染色步驟：1）脫蠟：將石蠟切片依次置于二甲苯（I）5 min→二甲苯（Ⅱ）5 min；2）復(fù)水：依次置于100%乙醇2 min→95%的乙醇1 min→80%乙醇1 min→75%乙醇1 min→蒸餾水洗2 min，各2次，然后吸干水份；3）蘇木精染色：置于蘇木精溶液中2 min，自來水流水沖洗2 min，把水吸干；4）分化：1%鹽酸乙醇分化30 s，自來水浸泡15 min，吸干水份；5）伊紅染色：置于伊紅溶液中2 min；6）脫水：依次置于95%乙醇（I）5 min→95%乙醇（Ⅱ）5 min→100%乙醇（I）5 min→100%乙醇（Ⅱ）2 min；7）封片：置于通風(fēng)櫥，待乙醇徹底干后依次置于二甲苯（I）5 min→二甲苯（Ⅱ）5 min，待載玻片上殘留二甲苯揮干后用中性樹膠封片。

1.9 蛋白濃度測定將凍存的結(jié)腸組織蛋白液于室溫下融化，采用BCA 法測定蛋白濃度，處理好待測樣品后，取50 μg 蛋白進行SDS-PAGE 電泳分離，轉(zhuǎn)膜，將分離的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。封閉液室溫封閉1 h，經(jīng)5-HT3R、5-HT4R 及GAPDH 抗體（1∶1000）孵育后，4℃過夜。PBST 充分洗膜后，加入二抗（1∶2000）室溫孵育1 h，PBST清洗后顯色液顯影，利用凝膠成像儀成像后進行灰度值檢測。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，應(yīng)用Graphpad prism 5 作圖，應(yīng)用Image J軟件進行免疫印跡灰度值檢測，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠糞便含水率模型組大鼠糞便含水率為（60.11±1.14）%，低于對照組的（65.29±1.01）%（P＜0.05），推拿組大鼠糞便含水率為（64.97±0.98）%，高于模型組（P＜0.05），提示腹部推拿能夠改善STC大鼠糞便含水率，緩解STC大鼠的疾病狀態(tài)。

2.2 各組大鼠血漿SP、NOS 及VIP 水平與對照組相比，模型組大鼠血漿SP 水平下降（P＜0.05），VIP及NOS水平升高（P＜0.05），提示STC 大鼠發(fā)病機制可能與體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平改變有關(guān)；與模型組相比，推拿組大鼠體內(nèi)SP 水平升高（P＜0.05），VIP及NOS水平降低（P＜0.05），提示對STC 大鼠連續(xù)腹部推拿14 天能夠調(diào)節(jié)其體內(nèi)相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)水平，改善STC大鼠疾病進展與轉(zhuǎn)歸。見表1。

表1 各組大鼠血漿SP、VIP及NOS水平（±s）

表1 各組大鼠血漿SP、VIP及NOS水平（±s）

注：*表示與對照組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05

組別對照組模型組推拿組鼠數(shù)13 13 13 SP 65.41±0.76 31.62±1.46*63.89±2.31#VIP 31.62±0.84 86.19±1.13*33.98±0.72#NOS 0.61±0.29 4.17±1.13*0.83±0.18#

2.3 各組大鼠首粒黑便排出時間模型組STC大鼠首粒黑便排出時間為（10.68±2.11）h，長于對照組的（5.13±1.51）h（P＜0.05），提示造模成功；推拿組大鼠首粒黑便排出時間為（6.12±1.39）h，短于模型組，推拿組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；提示腹部推拿可以改善STC大鼠的首粒黑便排出時間，改善STC大鼠的病理狀態(tài)，改變疾病狀態(tài)。

2.4 各組大鼠腸推動率與對照組相比，模型組大鼠腸推動率降低（P＜0.05），提示STC 大鼠發(fā)病機制與腸推動率改變有關(guān)；與模型組相比，推拿組大鼠腸推動率升高（P＜0.05），提示腹部推拿可改善大鼠腸推動率。見表2。

表2 各組大鼠腸推動率（±s）

表2 各組大鼠腸推動率（±s）

注：*表示與對照組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05

組別對照組模型組推拿組鼠數(shù)13 13 13小腸長度（cm）100.67±4.98 100.19±3.76 99.48±5.69碳末推進距離（cm）83.39±3.69 51.54±2.87*78.37±4.19#腸推動率（%）81.83±2.44 51.33±3.71*80.91±2.68#

2.5 各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)與對照組相比，模型組大鼠結(jié)腸組織黏膜層及肌層染色淺，厚度增加，結(jié)腸絨毛上皮細胞可見脫落，提示造模成功；與模型組相比，推拿組STC 大鼠結(jié)腸組織黏膜層及肌層染色深，偶見結(jié)腸絨毛上皮細胞脫落，細胞排列整齊，細胞形態(tài)圓潤，細胞間隙縮??；提示對STC 大鼠進行連續(xù)14 天的腹部推拿，有利于STC大鼠結(jié)腸組織細胞的恢復(fù)，改善STC大鼠結(jié)腸組織的病理學(xué)轉(zhuǎn)歸。見圖1。

2.6 各組大鼠結(jié)腸組織5-HT3R、5-HT4R 水平與對照組相比，模型組大鼠結(jié)腸組織5-HT3R、5-HT4R水平降低（P＜0.05）；提示STC 大鼠發(fā)病機制可能與5-HT 受體表達有關(guān)；與模型組相比，推拿組大鼠5-HT3R、5-HT4R水平升高（P＜0.05），提示腹部推拿可能通過調(diào)節(jié)STC大鼠體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平，進而調(diào)節(jié)大鼠結(jié)腸組織5-HT3R、5-HT4R水平。見圖2。

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織5-HT3R、5-HT4R水平

3 討論

5-HT是參與調(diào)節(jié)胃腸道分泌和運動功能的重要神經(jīng)遞質(zhì)和旁分泌信號分子。其中5-HT3、5-HT3R、5-HT4R與胃腸道動力緊密聯(lián)系，其分泌、轉(zhuǎn)運異常都能引起胃腸道疾?。?-8］。現(xiàn)代研究顯示腸神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)是導(dǎo)致功能性便秘的主要病理變化。5-HT、NO、SP、VIP 是調(diào)節(jié)腸道功能的重要神經(jīng)遞質(zhì)，通過興奮或抑制作用調(diào)節(jié)腸道運動［9-10］。

本研究首次采用大鼠腸神經(jīng)節(jié)消融術(shù)建立STC大鼠模型，探討腹部推拿對STC大鼠體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平及5-HT 受體表達的影響，結(jié)果表明，與模型組相比，推拿組大鼠糞便含水率升高，提示腹部推拿可能通過改變STC 大鼠腸道細胞通透性增加糞便含水率；推拿組大鼠體內(nèi)SP 水平升高，VIP及NOS 水平降低，首粒黑便排出時間縮短，腸推動率升高，提示腹部推拿可能通過刺激STC 大鼠胃腸道調(diào)節(jié)體內(nèi)相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)水平，進而改善大鼠胃腸道蠕動功能；推拿組大鼠結(jié)腸組織黏膜層及肌層染色深，偶見結(jié)腸絨毛上皮細胞脫落，細胞排列整齊，形態(tài)圓潤，細胞間隙縮小，提示腹部推拿有利于STC大鼠結(jié)腸組織細胞的恢復(fù)，改善STC大鼠結(jié)腸組織的病理學(xué)轉(zhuǎn)歸；推拿組大鼠5-HT3R、5-HT4R 水平升高，提示腹部推拿可能通過調(diào)節(jié)STC大鼠體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平，進而調(diào)節(jié)STC 大鼠結(jié)腸組織5-HT3R、5-HT4R 水平，從而改善STC 大鼠疾病狀態(tài)及疾病轉(zhuǎn)歸。

綜上所述，腹部推拿能夠改善STC 大鼠疾病狀態(tài)，同時調(diào)節(jié)其體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)及5-HT受體表達。