藍(lán)萼香茶菜總二萜對(duì)實(shí)驗(yàn)性兔心肌缺血相關(guān)蛋白的影響?

劉明潔

內(nèi)蒙古民族大學(xué)，內(nèi)蒙古 通遼028000

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是一種高致死性疾病，通常由病理性冠狀動(dòng)脈閉塞引起［1］。急性心肌梗死（AMI）是冠心病的危險(xiǎn)心臟事件［2］，通常由動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂或斑塊侵蝕及隨后的血栓形成造成部分或完全冠狀動(dòng)脈閉塞引起。溶栓、冠脈介入手術(shù)、冠脈搭橋術(shù)等是AMI再灌注的有效治療方法［3-4］，有證據(jù)［5］顯示再灌注后出現(xiàn)的損傷表現(xiàn)為心律失常、無復(fù)流現(xiàn)象、心肌頓抑及心肌細(xì)胞壞死等，于缺血前施用預(yù)處理以及其他干預(yù)措施，以保護(hù)心臟免受I/R 損傷，并且早期再灌注可能會(huì)降低缺血對(duì)心肌的損傷程度。

藍(lán)萼香茶菜的莖、葉中主要含有藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丙素等。藍(lán)萼香茶菜具有健胃、清熱解毒、活血作用［6］。現(xiàn)代研究［7］發(fā)現(xiàn)全草對(duì)心血管有一定作用，藍(lán)萼香茶菜還具有與劑量相關(guān)的心肌保護(hù)作用。藍(lán)萼香茶菜二萜類化合物是藍(lán)萼香茶菜的主要化學(xué)成分，研究表明其二萜類化合物之一藍(lán)萼甲素具有保護(hù)心肌、改善微循環(huán)等作用，其乙醇提取液能減輕MI/RI，保護(hù)心?。?］。臨床研究［9］證實(shí)藍(lán)萼香茶菜制劑治療冠心病效果顯著。本研究探討TD預(yù)處理對(duì)實(shí)驗(yàn)性兔MI/RI動(dòng)物模型相關(guān)蛋白的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物健康日本大耳白兔18 只，雄性，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，由沈陽藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（遼）2009-0002。

1.2 藥物與試劑實(shí)驗(yàn)藥物TD 由解放軍第202醫(yī)院臨床藥理基地提供；肝素鈉（上海三杰生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：090201，規(guī)格：1 g/瓶）；戊巴比妥鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：6900183，規(guī)格：5 g/瓶）。

1.3 儀器MP100十六道生理儀（美國Stoelting公司）；JEM-1200EM透射電鏡（日本電子株式會(huì)社）。

1.4 方法

1.4.1 MI/RI 動(dòng)物模型的建立與分組［7］健康日本大耳白兔18 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 天后，隨機(jī)分為3組，每組6只，假手術(shù)組（Sham組），缺血/再灌注組（I/R組），藍(lán)萼香茶菜總二萜組（TD組）。術(shù)前7天Sham 組和I/R 組給予5 mL/（kg·d）蒸餾水灌胃，TD組灌胃TD［2.38 mg/（kg·d）］。各組于第7 天灌胃1 h 后于兔耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉30 mg/kg，麻醉后行氣管插管及左頸總動(dòng)脈插管，假手術(shù)組麻醉開胸后，于冠狀動(dòng)脈前降支（LAD）穿線，但不結(jié)扎線。I/R 組開胸后，于LAD 穿線并收緊結(jié)扎線，缺血40 min后松開結(jié)扎線并再灌注180 min，TD組處理同I/R組。

1.4.2 血清丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測 各組分別于再灌注180 min時(shí)采集動(dòng)脈血，待測SOD活性和MDA含量。

1.4.3 心肌組織MDA、SOD、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和Caspase 3 活性檢測 各組再灌注180 min 結(jié)束后，取缺血區(qū)心肌組織，嚴(yán)格按試劑盒說明書測定SOD、MDA、GSH-Px和Caspase 3的活性。

1.4.4 心肌組織病理學(xué)檢查 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取缺血心肌組織制作成光鏡、電鏡標(biāo)本，觀察并拍照。

1.4.5 Bcl-2 和Bax WB 法檢測各組心肌細(xì)胞相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清SOD活性和MDA含量變化情況再灌注180 min 時(shí)，與Sham 組相比，I/R 組血清MDA 含量升高（P＜0.05），SOD 活性降低（P＜0.05）。Sham組MDA 和SOD 與TD 組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與I/R 組比較，TD 組MDA 含量降低（P＜0.05），SOD活性升高（P＜0.05）。見表1。

表1 3組兔血清MDA活性和SOD含量變化情況（±s）

表1 3組兔血清MDA活性和SOD含量變化情況（±s）

注：*表示與Sham 組比較，P＜0.05；#表示與I/R 組比較，P＜0.05

組別Sham組I/R組TD組兔數(shù)6 6 6 MDA（nmol/mL）1.98±0.62 6.48±2.99*2.05±0.69#SOD（U/mL）40.17±3.25 27.03±6.06*38.39±2.02#

2.2 光鏡下兔心肌組織變化情況HE 染色顯示：Sham 組兔心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，心肌纖維排列規(guī)則，組織間隙正常；I/R 組兔心肌纖維紊亂且有斷裂；TD 組兔心肌纖維排列基本規(guī)則，間隙較正常稍寬。見圖1。

圖1 光鏡下各組兔心肌組織結(jié)構(gòu)（HE×400）

2.3 電鏡下兔心肌組織變化情況電鏡顯示：Sham 組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，排列整齊，肌絲無明顯改變，肌節(jié)清晰可見，Z 線清楚，線粒體形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整，線粒體整齊排列在肌原纖維之間，且方向與肌絲縱向一致，心肌細(xì)胞核呈長橢圓型，核仁清楚，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻。I/R 組心肌細(xì)胞水腫，肌膜破損，心肌纖維排列模糊，紊亂，部分肌絲斷裂、溶解，Z 線不清，線粒體嚴(yán)重腫脹，嵴斷裂，空泡化；TD 組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷程度明顯減輕，呈現(xiàn)好轉(zhuǎn)趨勢(shì)，心肌細(xì)胞輕度水腫，肌膜較完整，線粒體輕度腫脹，嵴較清楚結(jié)構(gòu)較完整；與I/R組相比，TD組心肌電鏡下結(jié)構(gòu)明顯好轉(zhuǎn)。見圖2。

圖2 電鏡下各組兔心肌組織結(jié)構(gòu)（×5000）

2.4 心肌組織MDA含量、SOD、GSH-Px及Caspase 3活性變化情況再灌注180 min，與Sham 組比較，TD組、I/R組心肌組織中MDA含量、Caspase-3活性升高（P＜0.05），SOD和GSH-Px活力降低（P＜0.05）。與I/R組比較，TD組心肌組織中MDA含量、Caspase-3活性降低（P＜0.05），SOD 和GSH-Px 活力升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組兔心肌組織中MDA含量、SOD和GSH-Px活力變化情況（±s）

表2 各組兔心肌組織中MDA含量、SOD和GSH-Px活力變化情況（±s）

注：*表示與Sham組比較，P＜0.05；#表示與I/R組比較，P＜0.05

組別Sham組I/R組TD組兔數(shù)666 MDA（nmol/mg）0.97±0.19 3.91±1.10*1.15±0.22*#SOD（U/mg）80.56±15.67 47.50±10.23*75.52±11.63*#GSH-Px 22.35±4.32 9.09±2.55*19.70±6.63*#Caspase-3 14.73±4.06 65.61±13.49*20.52±3.66*#

2.5 心肌Bax 和Bcl-2 蛋白表達(dá)的比較與Sham 組相比，I/R 組Bcl-2 表達(dá)下降，Bax 表達(dá)增加（P＜0.05）；與I/R 組相比，TD 組Bcl-2 蛋白表達(dá)增加，Bax 表達(dá)降低（P＜0.05），表明TD 能上調(diào)Bcl-2表達(dá)，下調(diào)Bax表達(dá)，見圖3。

圖3 Western blot檢測Bcl-2和Bax的表達(dá)

3 討論

心肌缺血致心肌收縮功能減弱，且由于心肌細(xì)胞壞死和凋亡導(dǎo)致心肌損傷。MI/RI 是心臟手術(shù)后心功能受損的一個(gè)重要原因［10］。AMI 主要治療目標(biāo)是減少心肌損傷和心肌重構(gòu)，增加心臟修復(fù)，通過血運(yùn)重建迅速灌注梗死心肌，然而血運(yùn)重建所致血管內(nèi)皮損傷和炎癥會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞功能障礙即MI/RI［11］。再灌注損傷包括再灌注引起的心肌細(xì)胞損傷、微血管損傷、心肌頓抑和再灌注心律失常，早期再灌注可減少心梗面積，但最終因再灌注引起室性心律失常可能是罕見的［12-13］。

氧自由基（ROS）是心肌缺血或再灌注損傷的重要發(fā)病機(jī)制之一。SOD歧化O2-為H2O2，GSH-Px雖不能直接清除ROS，但可清除H2O2和脂質(zhì)過氧化物，抑制ROS 的生成反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，I/R組心肌SOD 和GSH-Px 活力降低，TD 組可升高心肌SOD 和GSH-Px 活力，說明TD 可提高心肌SOD 和GSH-Px活性。本研究結(jié)果顯示：心肌缺血40 min，再灌注180 min 后，I/R 組心肌MDA 含量增加，SOD活性降低，說明MI/RI 后，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物增多，間接反映ROS 生成增加。TD 組SOD 活性升高，MDA 含量降低，提示TD 能抑制再灌注時(shí)ROS 增加而導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，增強(qiáng)心肌抗氧化能力，起到保護(hù)MI/RI的作用，且TD預(yù)處理對(duì)增強(qiáng)心肌抗氧化能力，減輕脂質(zhì)過氧化損傷有明顯作用，說明TD 能減少再灌注時(shí)氧自由基生成。TD 能降低血清MDA 并增加SOD，說明TD對(duì)再灌注時(shí)ROS 的減少起重要作用。

心肌細(xì)胞凋亡已被確認(rèn)為MI/RI 中的一個(gè)重要機(jī)制［14］，因此，抑制心肌細(xì)胞凋亡可減輕I/R 損傷。MI/RI 時(shí)，心肌石蠟切片HE 染色后光鏡下結(jié)構(gòu)顯示：I/R 組心肌細(xì)胞排列紊亂，部分區(qū)域心肌纖維斷裂。電鏡下顯示超微結(jié)構(gòu)明顯受損，主要表現(xiàn)為I/R 組肌膜破損，心肌纖維排列模糊、紊亂，部分肌絲斷裂、溶解，Z 線不清，線粒體嵴斷裂，空泡化形成。TD 組心肌損傷程度明顯減輕，提示TD 預(yù)處理能明顯減輕心肌組織損傷，對(duì)心肌有保護(hù)作用。本研究結(jié)果表明MI/RI激活Caspase 3并上調(diào)Bax，而TD 可抑制Bax 和Caspase 3 的產(chǎn)生。Caspase 3 是凋亡級(jí)聯(lián)中“效應(yīng)”蛋白酶關(guān)鍵作用點(diǎn)，在細(xì)胞凋亡的死亡受體和內(nèi)在線粒體通路中起重要作用。Bcl-2 是位于線粒體外膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的抗凋亡蛋白，Bcl-2 過表達(dá)可減少心肌細(xì)胞凋亡和缺血/再灌注損傷的心梗面積［15］。

I/R 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的發(fā)病機(jī)制有多種因素。本研究結(jié)果顯示，TD 可以增加抗凋亡蛋白Bcl-2，抑制促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，還可抑制ROS產(chǎn)生，能增加心肌組織的抗氧化能力，提示該藥對(duì)心肌細(xì)胞有保護(hù)作用。