QuEChERS-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定海參中敵敵畏

張玲，丁洪流，紀(jì)麗君，葉湖 ，山珊，吳翠玲

1.蘇州市食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心（蘇州 215104）；2.蘇州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院（蘇州 215104）；3.安捷倫科技（中國(guó)）有限公司（北京 100102）

海參齊名于魚(yú)翅、燕窩和人參，被公認(rèn)為世界八大珍品之一，含有生物活性物質(zhì)，如皂苷、不飽脂肪酸和蛋白質(zhì)[1-2]，是一種低脂肪、高蛋白食物。其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，具有延緩性腺衰老、提高記憶力、抗腫瘤及防止動(dòng)脈硬化等作用。隨著海參營(yíng)養(yǎng)價(jià)值知識(shí)的普及，海參也作為一道菜品逐漸進(jìn)入百姓的餐桌。正是由于海參在市場(chǎng)上十分走俏，即產(chǎn)生了行業(yè)亂象，已有調(diào)查表明海參產(chǎn)品良莠不齊，消費(fèi)者對(duì)其難辨優(yōu)劣，商家為了獲取暴利，加膠基加糖現(xiàn)象已成了行業(yè)公開(kāi)的秘密。另外，養(yǎng)殖環(huán)境對(duì)海參的品質(zhì)有較大決定作用，央視“3·15晚會(huì)”曝光了海參養(yǎng)殖中使用敵敵畏現(xiàn)象的普遍性，海參養(yǎng)殖戶(hù)在池塘中加入敵敵畏，其目的是清理池塘中的螃蟹、魚(yú)蝦等生物，而海參對(duì)敵敵畏的抗藥性較強(qiáng)，不會(huì)被藥死。按照我國(guó)農(nóng)藥管理?xiàng)l例規(guī)定，農(nóng)藥使用者不得擴(kuò)大農(nóng)藥的使用范圍，而敵敵畏的使用范圍顯然不包括海參養(yǎng)殖。敵敵畏具有高效、快速、廣譜性等特點(diǎn)，是目前應(yīng)用最為廣泛的有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑[3]，可用于農(nóng)作物殺蟲(chóng)，但應(yīng)有安全間隔期，一般規(guī)定在農(nóng)作物收獲前7 d停止用藥。GB 2763—2019[4]對(duì)敵敵畏這種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法的具體規(guī)定為谷物按照GB 23200.113[5]、GB/T 5009.20[6]、SN/T 2324[7]方法檢測(cè)；油料和油脂按照GB 23200.113[5]、GB/T 5009.20[6]方法檢測(cè)；蔬菜、水果按照GB 23200.8[8]、GB 23200.113[5]、GB/T 5009.20[6]、NY/T 761[9]方法檢測(cè)；調(diào)味料按照GB 23200.113[5]方法檢測(cè)。另外，對(duì)敵敵畏的檢測(cè)方法研究還有氣質(zhì)聯(lián)用法[10-11]、液質(zhì)聯(lián)用法[12]等。以上這些方法更多見(jiàn)諸于對(duì)蔬菜、水果、谷物、油料和油脂等的檢測(cè)。由于海參具有豐富的蛋白質(zhì)，比果蔬等農(nóng)藥殘留分析更為復(fù)雜，在現(xiàn)行農(nóng)殘分析標(biāo)準(zhǔn)中未見(jiàn)針對(duì)海參中敵敵畏的檢測(cè)方法。

QuEChERS是一種在農(nóng)產(chǎn)品方面檢測(cè)的快速樣品前處理技術(shù)[13]，具有操作簡(jiǎn)單、環(huán)保經(jīng)濟(jì)和適用范圍廣等特點(diǎn)。此次試驗(yàn)旨在建立一種基于QuEChERS前處理的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（High performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，HPLCMS/MS）測(cè)定海參中敵敵畏方法，為執(zhí)法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海參樣品（市售）；敵敵畏（質(zhì)量濃度為100 μg/mL，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司）；QuEChERS萃取試劑盒（EN 15662，安捷倫科技有限公司）；Captiva EMR-Lipid固相萃取柱（200 mg，3 mL，安捷倫科技有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)Thermo Fisher公司）；甲酸、甲酸銨（質(zhì)譜級(jí)，蘇州精密化學(xué)科技有限公司）；試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

AgilentQQQ-6470、高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；Mili-Q型超純水儀（美國(guó)密理博公司）；ME204E電子天平（梅特勒-托利多集團(tuán)）；Multi Reax自動(dòng)渦旋儀（德國(guó)Heidolph公司）；MD200-1氮吹儀（杭州奧盛儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精密稱(chēng)取敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶液配制成質(zhì)量濃度為10 μg/mL的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

空白樣品提取液：用不含敵敵畏殘留的樣品，按照1.3.2制備空白樣品提取液。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：精密吸取適量工作溶液，用甲醇溶液稀釋成質(zhì)量濃度為5，10，20，50和100 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 樣品前處理

稱(chēng)取5 g（精確到0.001 g）鮮海參樣品，置于50 mL離心管中，加入3 mL水，加陶瓷均質(zhì)子渦旋1 min；加入10 mL乙腈，振蕩3 min，加入Bond Elut QuEChERS EN萃取鹽包，劇烈振蕩1 min，以8000 r/min低溫離心10 min，取2.4 mL乙腈提取液，置于15 mL離心管中，加0.6 mL水渦旋，過(guò)Captiva EMR-Lipid柱，重力自流，接收流出液，抽干小柱，合并接收液于15 mL離心管中，收集流出液在30 ℃條件下氮吹至小于1 mL，用乙腈定容至1 mL，過(guò)0.22 μm濾膜上機(jī)分析。

1.3.3 測(cè)定條件

1.3.3.1 液相色譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 SB-C18（2.7 μm，3.0 mm×100 mm）；流動(dòng)相A：0.1%（V/V）甲酸-2 mmol/L乙酸銨；流動(dòng)相B：0.1 %（V/V）甲酸-乙腈。梯度洗脫程序：0 min 80% A，4.0 min 10% A，6.0 min 10% A，6.5 min 80% A，9 min 80% A；流速：400 μL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

離子化方式：正離子源噴霧（Positive electrospray ionization，ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Multi reaction monitor，MRM）采集模式；干燥器溫度250 ℃，干燥器流速7 L/min，霧化器電壓30 psi，鞘氣溫度325 ℃，鞘氣流速11 L/min，碰撞能量3500 V，噴嘴電壓500 V。

1.4 數(shù)據(jù)處理

定性分析：在相同的色譜條件和質(zhì)譜條件下，對(duì)照敵敵畏物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品定性離子以及出峰時(shí)間，對(duì)樣品中敵敵畏物質(zhì)進(jìn)行定性分析。

定量分析：通過(guò)不同敵敵畏物質(zhì)定量離子的峰面積，根據(jù)敵敵畏物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程，計(jì)算樣品中敵敵畏成分的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

取敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)品，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式進(jìn)行子離子優(yōu)化。質(zhì)譜條件見(jiàn)1.3.3.2。母離子為M+1，液相部分只連接兩通進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1，以響應(yīng)信號(hào)最高的作為定量離子，響應(yīng)信號(hào)次之的作為定性離子。

表1 敵敵畏多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式的質(zhì)譜參數(shù)

2.2 流動(dòng)相的選擇及洗脫梯度的優(yōu)化

采用水及乙腈作為流動(dòng)相，敵敵畏色譜峰呈現(xiàn)矮胖的形狀，而采用乙酸銨及乙腈為流動(dòng)相，目標(biāo)物峰形尖銳，由于是采用正離子電離模式，在流動(dòng)相中加入0.1%甲酸會(huì)更加有利于目標(biāo)物離子化[14]，因此確定以0.1%（V/V）甲酸-2 mmol/L乙酸銨溶液（A）和0.1%（V/V）甲酸-乙腈（B）作為流動(dòng)相。流動(dòng)相洗脫梯度優(yōu)化的最終結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，4 min內(nèi)敵敵畏目標(biāo)物出峰（圖1），出峰時(shí)間為3.989 min。

表2 梯度洗脫程序

圖1 敵敵畏物質(zhì)的定量離子色譜圖

2.3 固相萃取柱的選擇

試驗(yàn)對(duì)樣品的凈化采用Captiva EMR-Lipid固相萃取柱。試驗(yàn)采用乙腈對(duì)海參中大量的蛋白物質(zhì)進(jìn)行提取和沉淀，對(duì)比了Bond Elut PPL和Captiva EMR-Lipid兩類(lèi)固相萃取柱的凈化和保留效果，以加標(biāo)回收率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。結(jié)果顯示，Captiva EMR-Lipid固相萃取柱的吸附及凈化能力較好，能夠有效地將海參樣品中的色素及脂肪吸附，不僅有效地去除了對(duì)目標(biāo)化合物的干擾物，還確保了待測(cè)組分較少的損失，能夠在保證良好凈化效果的同時(shí)使操作過(guò)程更簡(jiǎn)單。

2.4 檢測(cè)方法的線(xiàn)性關(guān)系和檢出限

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)在5～100 ng/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，敵敵畏線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)值為0.998，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖2。以信噪比大于3為檢出限，檢出限為5 μg/kg。

表3 敵敵畏的線(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

圖2 敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.5 方法回收率及精密度

選用鮮海參陰性樣品，對(duì)其添加不同濃度敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，加標(biāo)回收試驗(yàn)的3個(gè)水平加標(biāo)量分別為10，20和40 μg/kg，每個(gè)水平重復(fù)6次測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果顯示，加標(biāo)回收率在80%～89%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.78%～3.56%（n=6），方法精密度及準(zhǔn)確度均較高。海參樣品加標(biāo)質(zhì)譜圖譜見(jiàn)圖3。

表4 敵敵畏的加標(biāo)回收率結(jié)果（n=6）

圖3 敵敵畏成分加標(biāo)質(zhì)譜圖譜

2.6 樣品應(yīng)用

為了進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)方法的實(shí)用性，將其他市售干制海參及新鮮海參按照所優(yōu)化的條件進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均未檢出。今后將進(jìn)一步加大抽樣量并擴(kuò)大抽樣樣品品類(lèi)，對(duì)新建方法進(jìn)行充分驗(yàn)證。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)采用QuEChERS前處理的方法，提高了海參中敵敵畏物質(zhì)農(nóng)藥殘留定量的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性。試驗(yàn)利用液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)，該方法簡(jiǎn)單易行、可操作、準(zhǔn)確靈敏、基質(zhì)干凈以及減少儀器污染，既提高工作效率，又節(jié)約勞動(dòng)成本，可為海參中敵敵畏物質(zhì)農(nóng)藥殘留的檢測(cè)提供科學(xué)客觀(guān)、準(zhǔn)確可靠的方法。