UPLC-MS/MS同時測定動物源性食品中114種獸藥殘留

李曉芹，丁洪流 ，何新葉，王偉

1.蘇州市食品檢驗檢測中心（蘇州 215104）；2.蘇州市產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗院（蘇州 215104）

中國對畜禽產(chǎn)品、蛋奶制品等的需求日益增長，但違法用藥造成動物源性食品獸藥殘留量超標，動物性食品安全狀況不容樂觀[1-2]。食以安為先，國家不斷加大對食品安全的監(jiān)管力度。但現(xiàn)有標準[3-6]多按照類別進行獸藥殘留檢測，只能滿足一類或少數(shù)幾類獸藥的檢測，單一標準無法做到多種類藥物覆蓋[7]，導致檢測步驟繁瑣、檢驗周期過長、檢測成本偏高，從而降低監(jiān)管效率。對動物源性食品中未知風險實施有效監(jiān)控，需要建立盡可能全覆蓋的獸藥殘留篩查方法[8]。

動物源性食品基質復雜，同時獸藥殘留量含量甚微、極性差別大。因此，樣品前處理成為分析過程中耗時最長、產(chǎn)生誤差最多的一個環(huán)節(jié)，是實現(xiàn)獸藥殘留高通量快速分析必須要突破的難點[9]。液質聯(lián)用技術不斷進步，因其高靈敏度、高選擇性和抗干擾能力，推動獸藥殘留的分析從單一類別發(fā)展為跨種類高通量分析，同時降低對樣品前處理的要求[10]。試驗采用UPLC-MS/MS，通過一次提取凈化，同時測定動物源性食品中磺胺類、喹諾酮類、大環(huán)內酯類、硝基咪唑類等11類114種獸藥殘留。該方法前處理技術簡單，方法可靠，檢測成本低，為實驗室建立動物源性食品中獸藥多殘留檢測技術提供經(jīng)驗和參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液質聯(lián)用儀（I-Class Xevo TQ-XS，配電噴霧離子（ESI）源，美國Waters）；高速冷凍離心機（Allegra X-30R，美國貝克曼）；氮吹儀（N-EVAP型，美國Organomation）；數(shù)顯型渦旋混合儀（德國IKA）；超純水儀（美國密理博）。

乙腈（質譜級，德國Merck）；甲醇（質譜級，德國Merck）；甲酸（質譜級，日本TCI）；試驗用水為GB/T 6682規(guī)定的一級水；固相萃取柱（Oasis PRiME HLB，6 mL/200 mg，美國Waters）；標準物質（純度92.7%～100%，德國Dr.Ehrenstorfer或Witega）。

1.2 標準溶液的配制

分別準確稱取10 mg（精確至0.01 mg）標準物質，用甲醇溶解定容，配制成1000 μg/mL標準儲備液，棕色儲液瓶存儲，于-18 ℃保存，保存期1年。分別移取適量的標準儲備液，配制成10 μg/mL的混合標準溶液，于-18 ℃保存，保存期6個月。

1.3 樣品處理方法

1.3.1 對于魚肉等易分散的樣品

準確稱取2.5 g（精確至0.01 g）均質后的試樣置50 mL帶蓋塑料離心管中，加入10 mL 0.2%甲酸-水乙腈（20∶80，V/V）混合溶液，渦旋混勻提取1 min，超聲提取2 min，按8000 r/min離心3 min后，取3 mL上清液上固相萃取柱，準確移取2 mL濾液氮吹至近干，用初始流動相定容至0.5 mL，超聲溶解2 min，按10000 r/min離心5 min后取清液直接供質譜分析。需同時做空白試驗。

1.3.2 對于豬肉、蝦肉等不易分散的樣品

準確稱取2.5 g（精確至0.01 g）均質后的試樣置50 mL帶蓋塑料離心管中，先加入2 mL 0.2%甲酸水溶液，渦旋分散后加入8 mL 0.2%甲酸乙腈溶液。按照1.3.1“渦旋混勻提取1 min……”的步驟繼續(xù)提取凈化。

1.3.3 對于牛奶、雞蛋等含水量較大的樣品

準確稱取2 g（精確至0.01 g）搖勻后的試樣置50 mL帶蓋塑料離心管中，直接加入8 mL 0.2%甲酸乙腈溶液，按照1.3.1“渦旋混勻提取1 min……”的步驟繼續(xù)提取凈化。

1.4 基質加標標準工作曲線

稱取與試樣基質相應的陰性樣品（精確至0.01 g），加入適量的標準溶液，按照1.3的步驟和試樣一同進行提取和凈化。

1.5 色譜和質譜條件

1.5.1 液相條件

色譜柱，Waters Acquity UPLC BEH C182.1 mm×100 mm，1.7 μm；柱溫45 ℃；進樣體積2 μL；流速0.30 mL/min；流動相A為0.2%甲酸水溶液，流動相B為0.2%甲酸甲醇溶液。梯度洗脫條件：0 min 98% A，0.5 min 98% A，13 min 1% A，15 min 1% A，15.1 min 98% A，17 min 98% A。

1.5.2 質譜條件

ESI+模式掃描，MRM采集模式；毛細管電壓1.0 kV；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣溫度600 ℃；脫溶劑氣流速1000 L/h；錐孔氣150 L/h；碰撞氣流速0.15 mL/min。各化合物的離子對、錐孔電壓及碰撞能量等質譜參數(shù)見表1。

表1 114種化合物的MRM質譜采集參數(shù)及回歸方程

2 結果與討論

2.1 質譜參數(shù)優(yōu)化

通過泵直接將標液注射入離子源，根據(jù)分子質量和帶電方式，進行一級質譜分析，得到分子離子峰，確定各目標物的母離子，同時優(yōu)化錐孔電壓。對母離子進行二級質譜掃描，得到碎片離子信息，選取2～3個響應較高、穩(wěn)定的特征性子離子，同時優(yōu)化碰撞能量。

在進樣模式下，連接色譜柱，通過優(yōu)化毛細管電壓、離子源溫度、脫溶劑氣溫度、脫溶劑氣流速、錐孔氣流速等條件，選取合適的質譜條件。試驗發(fā)現(xiàn)，毛細管電壓對離子對豐度影響明顯。比較毛細管電壓在0.2～2.5 kV范圍內目標物的響應強度，結果發(fā)現(xiàn)毛細管電壓1.0 kV時，喹諾酮類、大環(huán)內酯類、β-受體激動劑和硝基咪唑類的標物響應強度整體較高，噪音低，磺胺類等其他化合物的響應強度可接受。

通過實際陰性樣品基質配標和溶劑配標得到的圖譜進行比較，選取干擾較小、信噪比最高的離子對進行監(jiān)測，確定為定量和定性離子對。

多種化合物同時檢測，采集通道增多，導致峰的采集點數(shù)變少，從而降低定量結果的準確度和重復性。根據(jù)待測物的保留時間（tR），進行分段采集（tR±0.5 min），以保證每個峰有足夠的采集點數(shù)。

2.2 液相條件優(yōu)化

2.2.1 流動相體系選擇

考察不同種類的流動相體系，結果發(fā)現(xiàn)加入乙酸銨使峰形更加尖銳，但同時信號整體降低，喹諾酮類拖尾嚴重。加入0.2%甲酸使得喹諾酮類拖尾現(xiàn)象明顯改善，可能是由于該酸性條件下喹諾酮類化合物溶解性更好。乙腈體系下色譜系統(tǒng)壓力適中，但部分目標物峰形略差，有略微前伸或拖尾現(xiàn)象存在。甲醇有更強的洗脫能力，得到的峰形尖銳，響應強度略有提高，但系統(tǒng)壓力比較高。因此，在滿足信噪比的前提下，采用0.2%甲酸水-0.2%甲酸甲醇體系，降低流動相流速，以0.3 mL/min流速梯度洗脫，柱壓適中，同時流動相更易配制，利于實驗室提高檢驗效率。在此流動相條件下，負模式響應差，因此只選取正模式下響應強度滿足要求的獸藥。

2.2.2 流動相梯度優(yōu)化

因同系物較多，例如磺胺甲氧嗪/磺胺間甲氧嘧啶/磺胺對甲氧嘧啶、磺胺二甲異惡唑/磺胺二甲惡唑、磺胺醋酰/磺胺脒、氟甲喹/惡喹酸、磺胺間二甲氧嘧啶/磺胺多辛、阿苯達唑砜/羥基甲苯咪唑、金剛乙胺/美金剛等，通過離子對不能完全區(qū)分，需優(yōu)化流動相梯度，使其達到基線分離，利用保留時間進行定性。

MRM離子流圖如圖1所示，所有的目標物均在11 min之前出峰，1針進樣的儀器分析時間17 min，縮短了檢測時間。

圖1 114種藥物MRM離子疊加圖

2.3 樣品前處理方法優(yōu)化

樣品前處理是獸藥殘留分析檢測過程中耗時最長、產(chǎn)生誤差最多的環(huán)節(jié)，直接決定整個分析檢測方法的可行性和周期[11]。

涉及跨種類多殘留檢測時，液液萃取方法簡單有效[12]，缺點是基質干擾比較大，難以準確定量，且對色譜柱和儀器污染也較嚴重。分散固相萃取也經(jīng)常被應用到獸藥檢測中[13-14]，但步驟較多，需要多次離心和轉移，試劑消耗量較大。試驗通過比較，選取Oasis PRiME HLB固相萃取柱進行樣品前處理，一步式凈化操作簡便，能夠得到較好的回收率，滿足日常分析要求。

乙腈是獸藥殘留檢測中最常用的提取溶劑，能夠提取出大多數(shù)的藥物，同時引入更少的雜質[15]。試驗比較純乙腈、乙腈水（80∶20和60∶40，V/V）溶液和不同的甲酸含量（0.1%，0.2%和1.0%）時的提取效果[16]。結果顯示：純乙腈不利于含水量少的樣品分散，樣品易成團；1%甲酸沉淀效果最好，但磺胺類藥物回收率偏低，0.2%甲酸溶液作為提取溶劑時，5類藥物整體回收率較高且比較穩(wěn)定，該結果和相關研究基本一致[17]。對于不易分散的樣品，如豬肉，建議先加入水溶液，因為水具有良好的滲透性，可以較好地使樣品分散。而水相占比提高使提取液混入更多的雜質，不利于凈化。因此選用0.2%甲酸-乙腈水（80∶20，V/V）混合溶液進行提取。超聲有助于樣品分散和目標物的提取。牛奶等液體樣品含水量大，直接加入0.2%甲酸乙腈溶液即可。

2.4 基質效應

動物源性食品中大量的蛋白和脂肪等進入提取液，凈化不完全，會影響化合物在離子源中的離子化，使化合物的響應出現(xiàn)增強或抑制，出現(xiàn)基質效應[18]?；|效應影響數(shù)據(jù)的準確性，因此需要評價目標物在不同基質中的基質效應[19]。

通過基質加標和溶劑配標進行比較，結果表明，采用試驗方法進行處理后，依然存在基質效應，尤其對喹諾酮類和磺胺胍、磺胺醋酰等藥物低濃度點影響較大。因此，最終采用基質匹配標準曲線進行定量，即標準工作液加入空白基質，和樣品一同前處理[20]。同時輔助同位素內標、降低上樣量等手段[15]降低基質效應對定量結果的影響。

2.5 方法學驗證

2.5.1 線性關系和定量限

分別在豬肉和魚肉的空白基質中，添加一定濃度的標準溶液，與空白試驗比較，獲得10倍以上信噪比，確定此添加濃度為試驗方法的最低定量限[21]。

將5個水平的標準溶液加入空白基質，提取、凈化后，得到系列混合基質標準工作液，上機測定。以各目標物的定量離子的響應值為縱坐標，以質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程。線性系數(shù)r2均大于0.99，各化合物在相應的濃度范圍內線性關系良好。114種獸藥的定量限、線性范圍見表2。

2.5.2 回收率與精密度

僅通過基質配標手段獲得的回收率，不同化合物回收率在40%～90%之間，可用作快速篩查，但定量會存在一定誤差。試驗方法通過標液加到陰性樣品中，和待測樣品一同進行前處理后得到的基質加標標準工作曲線將回收率匹配到合理范圍內[9]。

在豬肉、魚肉中分別添加定量限、2倍定量限（2 LOQ）和10倍定量限（10 LOQ）3個水平的混合標準溶液，每個添加水平進行6次平行測定。114種獸藥的定量限（測定低限）為0.2～2 μg/kg，線性范圍為0.05～100 μg/kg，回收率為65.4%～114.9%，相對標準偏差（SRSD，n=6）均為0.6%～12.9%，具有良好的重現(xiàn)性，具體見表2。

表2 11類藥物殘留的線性范圍、定量限、回收率范圍及相對標準偏差范圍

2.5.3 實際樣品的測定

實驗室購買相應萊克多巴胺質控樣品，使用試驗方法進行處理和檢測，最終結果在允許范圍內。魚肉糜中磺胺類藥物殘留能力驗證獲得滿意結果。除豬肉、魚肉樣品，在雞蛋、牛奶、蜂蜜樣品中進行加標，均獲得較穩(wěn)定的回收率。對采用國標方法檢測為陽性結果的樣品，采用試驗方法進行再次處理，結果基本一致。

3 結論

現(xiàn)有國家標準檢測獸藥殘留，只能進行單一或一類獸藥的分析，缺乏通用性和時效性，不能滿足對獸藥殘留高通量分析的需求。試驗建立同時測定動物源性食品中磺胺類、喹諾酮類、大環(huán)內酯類等11類114種常見獸藥殘留物的高通量篩查方法，減少繁瑣的預處理步驟，儀器分析時間縮短至17 min，節(jié)省分析時間，提高檢測效率，降低儀器成本。經(jīng)驗證，該方法能夠用于實驗室獸藥殘留的篩查工作，后續(xù)試驗以期擴充藥物種類，為實驗室獸藥殘留檢測技術進步提供參考。