高效液相色譜法測定高油脂植物源性食品中紐甜含量

戴琨，公丕學(xué)，薛霞，趙慧男，劉艷明，祝建華

1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院（濟(jì)南 250101）；2.山東省食品藥品安全檢測工程技術(shù)研究中心（濟(jì)南 250101）

紐甜（neotame）是一種功能性甜味劑，特性優(yōu)良，結(jié)構(gòu)式如圖1所示，適合添加到多類食品中[1-5]。但人工合成甜味劑的安全性受到廣泛質(zhì)疑，各國采取嚴(yán)格限制使用的政策[6-9]。GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定多類食品中紐甜的最大使用量[10]，如加工堅果和籽類的最大使用量為0.032 g/kg。高油脂植物源性食品是一類油脂含量高的植物性食品，如炒貨、薯片均屬于此類食品。

圖1 紐甜的化學(xué)結(jié)構(gòu)

報道的紐甜檢測方法主要有高效液相色譜法[11-15]、液相色譜-質(zhì)譜法[16-19]等，使用液質(zhì)法檢測時，基質(zhì)效應(yīng)大，定量準(zhǔn)確性不夠，液相法能對目標(biāo)物進(jìn)行準(zhǔn)確定量。食品種類復(fù)雜多樣，對于基質(zhì)復(fù)雜的樣品，需采取加沉淀劑[20-21]、固相萃取[22-24]等有效的處理方法。高油脂植物源性樣品基質(zhì)復(fù)雜，處理過程選用固相萃取法以獲得較好的凈化效果，文獻(xiàn)報道使用較多的固相萃取（SPE）柱有C18、HLB等[22-24]，然而，處理高油脂類食品時此類SPE凈化效果不佳，因此選用一種合適的凈化方式處理此類食品很有必要。

試驗(yàn)建立固相萃取凈化-高效液相色譜法測定高油脂植物源性食品中的紐甜含量。考察不同提取條件、凈化方式對該類食品中紐甜的提取和凈化效果的影響，以獲得操作簡便、定量準(zhǔn)確的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紐甜標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%，曼哈格公司）；甲醇（色譜純，德國Merck公司）；乙腈（色譜純，德國Merck公司）；醋酸銨（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；磷酸（優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；冰乙酸（優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；三乙胺（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鈉（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；五香花生、糖炒花生、黑糖瓜子、奶油瓜子、薯片（均購于當(dāng)?shù)爻校?/p>

混合提取液：分別吸取0.8 mL甲酸和2.5 mL三乙胺，加水定容至1 L。

UltiMate 3000型高效液相色譜儀（配有DAD檢測器，美國Thermo Fisher Scientific公司）；N-EVAP型控溫氮吹儀（美國Organomation公司）；ME2002T型電子天平（德國Mettler Toledo公司）；3-18KS型高速冷凍離心機(jī)（德國Sigma公司）；MS-3基本型旋渦混合器（德國IKA公司）；SB-800DTD型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Milli-Q超純水機(jī)（美國Millipore公司）；固相萃取柱、Waters Atlantis T3色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國Waters公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紐甜標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取10.0 mg標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用混合提取液溶解并準(zhǔn)確定容至10.00 mL，充分搖勻，配制成1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用混合提取液稀釋，制成質(zhì)量濃度分別為0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0和100.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列工作溶液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 樣品的前處理

1.2.2.1 樣品提取

時政熱點(diǎn)的選擇應(yīng)該是正面向上的，要有積極的教育意義。青年學(xué)生長期在學(xué)校生活，對社會了解得不夠深入，有時面對未來的生活茫然不知所措，思想上往往有片面性和理想化的特點(diǎn)，有時還帶有主觀主義和個人主義傾向，價值觀的形成還不穩(wěn)定，極易受到外界影響。因此，正面的時政熱點(diǎn)案例的使用尤為重要，這就要求教師要多給學(xué)生講授積極向上的話題，通過大量正面素材的教育幫助學(xué)生樹立正確的世界觀、人生觀、價值觀和堅定的政治立場、政治觀念，從而樹立起正確的政治方向。

試驗(yàn)前處理優(yōu)化過程中使用的樣品為能夠代表高油脂植物源性食品的五香花生，稱取5 g（精確到0.01 g）樣品于50 mL離心管中，加入20 mL 30%甲醇水溶液，渦旋分散混勻，超聲波清洗器中超聲提取20 min后，用離心機(jī)以8000 r/min的轉(zhuǎn)速冷凍離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一支50 mL離心管中，用磷酸調(diào)節(jié)至pH 2后轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，定容待凈化。

1.2.2.2 樣品凈化

取PRiME MCX固相萃取柱，準(zhǔn)確移取10 mL待凈化液過固相萃取柱，控制流速不超過1 mL/min，待液體流盡后用5 mL 100 mmol/L甲酸銨（含2%甲酸）溶液淋洗，用5 mL甲醇淋洗，將小柱抽干，用5 mL甲醇（含5%氨水）洗脫，收集的洗脫液經(jīng)45 ℃氮吹至近干，用1 mL 50%甲醇水復(fù)溶，超聲10 min后，過0.22 μm微孔有機(jī)濾膜，濾液待上機(jī)檢測。

1.2.3 色譜條件

色譜柱采用Atlantis T3色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；流動相流速0.8 mL/min；檢測波長210 nm；進(jìn)樣體積10 μL。流動相A采用0.1%磷酸水溶液，流動相B采用乙腈，采用梯度洗脫程序，梯度條件見表1。

表1 流動相梯度程序

1.2.4 方法的線性范圍和檢出限

將紐甜標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液按濃度由低到高依次經(jīng)高效液相色譜儀進(jìn)行分析測定，以紐甜標(biāo)準(zhǔn)工作溶液質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以響應(yīng)峰面積（mAU·min）為縱坐標(biāo)，繪制紐甜標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，根據(jù)信噪比計算方法的檢出限和定量限。

選用具有代表性的高油脂植物源性食品進(jìn)行回收率和精密度試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)室檢測空白樣品為糖炒花生、黑糖瓜子、炸薯片，進(jìn)行添加回收率和精密度試驗(yàn)，以紐甜添加濃度0.2，2和10 mg/kg這3個水平，每個水平重復(fù)測定6次，分別計算回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過儀器配套的Chromeleon 7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集及色譜結(jié)果分析，采用Origin 8.0分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 提取溶液的選擇

試驗(yàn)考察不同提取溶液對五香花生中紐甜提取效率的影響，紐甜添加濃度2 mg/kg。在用提取液提取過程中，樣品中油脂的大量存在會影響到樣品的分散及目標(biāo)物的提取效果。選用混合提取液、甲醇水溶液、乙腈水溶液分別對樣品中紐甜進(jìn)行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用混合提取液提取時，提取液較渾濁，上層有較厚油脂層，難以除去，影響目標(biāo)物的提取效率和回收率；加入乙腈水溶液進(jìn)行提取時，樣品呈現(xiàn)糊狀，冷凍離心后不能分層；用甲醇水提取時，樣品混合均勻，冷凍離心后能夠分層，因此，選用甲醇水溶液作為樣品提取劑。試驗(yàn)進(jìn)一步考察5%，10%，20%，30%，40%和50%（V/V）甲醇水溶液的提取效果，結(jié)果如圖2所示。隨著甲醇比例提高，回收率升高，甲醇水溶液中甲醇體積分?jǐn)?shù)大于30%時，回收率下降。由圖1可見，紐甜的結(jié)構(gòu)中含有酯基，根據(jù)相似相溶原理，提高甲醇比例有利于提高回收率，而甲醇體積分?jǐn)?shù)提高，提取液中油脂等雜質(zhì)含量也隨之增加，干擾紐甜分離，影響定量。因此，選用30%甲醇水溶液作為提取溶劑。

圖2 不同比例甲醇水提取液對紐甜回收率的影響

2.1.2 凈化方式的選擇

由于高油脂食品基質(zhì)復(fù)雜，樣品提取液中油脂較多干擾紐甜檢測，需要進(jìn)行有效的凈化，并對目標(biāo)物進(jìn)行富集。固相萃取法快速、簡便、高效，因此，選用固相萃取柱對樣品提取液進(jìn)行凈化處理。試驗(yàn)比較HLB、C18、MCX、MAX、PRiME HLB、PRiME MCX這6種SPE柱的凈化效果，6種SPE柱的凈化方法見表2。

表2 6種SPE柱的凈化方法

經(jīng)SPE柱凈化并濃縮后，上機(jī)檢測，樣品的加標(biāo)回收率結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，使用HLB、MCX、PRiME MCX柱時紐甜回收率較高，而使用C18、MAX、PRiME HLB柱時效果較差。在使用C18柱進(jìn)行凈化時，同時比較甲醇水提取液和混合提取液的提取效率，回收率分別為40%和30%。由于樣品中脂肪、蛋白等雜質(zhì)含量較高，甲醇水溶液的提取效率稍高一些，但C18柱不能有效地去除提取液中雜質(zhì)，凈化效果較差，干擾較多且回收率較低。PRiME HLB柱是一種通用型的固相萃取柱，能去除磷脂、蛋白等雜質(zhì)，但回收率較低，推測原因是對目標(biāo)物有一定吸附。使用HLB柱時，回收率雖然較高，但上機(jī)檢測時雜質(zhì)干擾較多，影響目標(biāo)物的準(zhǔn)確定量，且對不同種類的其他樣品使用時，凈化效果存在差異，有的樣品凈化后檢測，雜質(zhì)峰的存在嚴(yán)重干擾目標(biāo)物的定量，效果較差。使用MCX柱時，凈化步驟較復(fù)雜，上樣速率較低，且上機(jī)檢測時目標(biāo)物附近干擾較多。而PRiME MCX是一款混合模式（反相和陽離子交換）固相萃取柱，雜質(zhì)去除效果較好，干擾少，回收率高，對各種樣品效果均較好，且不需活化，因此，選用PRiME MCX柱凈化該類樣品，能夠提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性。

圖3 紐甜通過不同SPE柱的回收率

2.1.3 上樣液pH的選擇

PRiME MCX是反相和離子交換混合模式固相萃取柱，紐甜的結(jié)構(gòu)中含有亞氨基和羧基，屬于兩性化合物，上樣液的pH會影響紐甜的存在形式，從而影響與SPE柱固定相的結(jié)合效率。因此，試驗(yàn)考察上樣液pH對紐甜回收率的影響，將樣品待凈化液分別調(diào)節(jié)至pH 1，2，3，5，7和9后，過柱凈化，回收率如圖4所示。結(jié)果顯示，pH 2時，回收率較高；pH 1時，回收率與pH 2時的回收率相當(dāng)，隨著pH升高，回收率逐漸下降，在酸性條件下，紐甜帶上正電荷，更易與柱子固定相結(jié)合，且更能有效地去除干擾雜質(zhì)，從而能夠提高目標(biāo)物的回收率?？紤]到環(huán)保因素及試驗(yàn)的操作簡便性，選擇上樣液pH 2。

圖4 上樣液pH對紐甜回收率的影響

2.1.4 洗脫條件的優(yōu)化

由于PRiME MCX柱基于強(qiáng)陽離子交換和反相吸附的功效，洗脫液選用含5%氨水的甲醇，將目標(biāo)物從SPE柱上有效地洗脫下來，試驗(yàn)考察洗脫液體積對紐甜回收率的影響，在凈化時，分別用1，3，5，7和9 mL含5%氨水的甲醇洗脫，紐甜回收率如圖5所示。結(jié)果表明，洗脫液體積5 mL時，目標(biāo)物被完全洗脫，繼續(xù)增大洗脫液體積，氮吹濃縮時間延長，而回收率略有下降，因此，確定洗脫液體積為5 mL。

圖5 不同體積洗脫液對紐甜回收率的影響

2.2 色譜條件的選擇

試驗(yàn)比較XBridge C18和Atlantis T3色譜柱對樣品中紐甜的分離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在分離復(fù)雜基質(zhì)樣品中紐甜時，Atlantis T3的保留更強(qiáng)，更易于目標(biāo)物和雜質(zhì)的分離，因此，選用Atlantis T3色譜柱進(jìn)行檢測，由于紐甜的最大吸收波長在210 nm左右，而甲醇的截止波長210 nm左右，乙腈的截止波長為190 nm左右，在用DAD檢測器檢測時，乙腈能降低基線噪音，減少干擾，且洗脫能力較強(qiáng)。因此，選用乙腈作為流動相。試驗(yàn)比較0.1%磷酸水溶液、0.1%乙酸水溶液體系作為流動相分離目標(biāo)物，由于試驗(yàn)中涉及的基質(zhì)較復(fù)雜，含有較多雜質(zhì)，采用梯度洗脫條件可以提高目標(biāo)物分離度、改善峰形，而用乙酸溶液進(jìn)行洗脫時，基線漂移較嚴(yán)重，磷酸溶液作為流動相，基線較穩(wěn)定，在低波長下，產(chǎn)生的基線波動較小，因此，采用含0.1%磷酸的水溶液作為流動相。在此色譜條件下，紐甜的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖、陽性樣品色譜圖見圖6和圖7。

圖6 紐甜標(biāo)準(zhǔn)溶液（5 μg/mL）的高效液相色譜圖

圖7 陽性樣品的高效液相色譜圖

2.3 方法的線性范圍和檢出限

以紐甜標(biāo)準(zhǔn)工作溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以響應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，在0.5～100.0 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，回歸方程為y=0.2497x+0.0018，線性相關(guān)系數(shù)為0.9999，線性良好。以信噪比S/N為3計算得到檢出限，結(jié)果為0.06 mg/kg，以信噪比S/N為10計算得到定量限，結(jié)果為0.2 mg/kg。

2.4 方法的回收率和精密度

按上述條件進(jìn)行空白樣品的添加回收率和精密度試驗(yàn)，所得到的平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見表3。

表3 添加回收率與精密度（n=6）

結(jié)果表明，紐甜的平均回收率在90%～96%，δRSD在0.9%～1.9%，該方法能夠滿足實(shí)際樣品的檢測需要。

2.5 實(shí)際樣品分析

采用建立的方法對50批次不同種類市售炒貨食品進(jìn)行紐甜的檢測，其中2個批次樣品中檢出紐甜，分別為五香奶油花生（紐甜含量4.0 mg/kg）和焗鹽味瓜子（紐甜含量10 mg/kg），均低于GB 2760—2014中規(guī)定的限量要求。

3 結(jié)論

建立高效液相色譜結(jié)合固相萃取法檢測高油脂植物源性食品中紐甜含量的分析方法。以甲醇水溶液為提取劑對樣品中的紐甜進(jìn)行提取，通過考察不同固相萃取凈化方法的效果，最終選用PRiME MCX固相萃取柱來凈化樣品提取液，經(jīng)Atlantis T3色譜柱分離，以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相進(jìn)行檢測，方法操作簡便，凈化效果好，回收率高，減少雜質(zhì)干擾，適用于不同種類高油脂植物源性食品中紐甜的檢測，具有普適性，提高結(jié)果準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，用于實(shí)際樣品的檢測，結(jié)果令人滿意，可為政府監(jiān)管提供技術(shù)支撐，為復(fù)雜基質(zhì)食品中紐甜的檢測提供良好的方法參考。