液相微萃取法快速檢測果蔬中噻菌靈殘留量

楊續(xù)金，王東清，任俌政，李立敏，楊楊

1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（呼和浩特 010018）；2.呼和浩特市綠林源農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司（呼和浩特 010020）

噻菌靈（TBZ）是一種高效、廣譜，廣泛用于水果、蔬菜防治真菌性病害的苯并咪唑類（BMZs）殺菌劑[1-3]。TBZ既可用于多種作物的真菌病害防治，也可用于果蔬的防腐保鮮，還可用于工業(yè)防霉劑及人、畜腸道的驅(qū)蟲藥劑，在農(nóng)藥、醫(yī)藥及工業(yè)領(lǐng)域有重要應(yīng)用[4-7]。TBZ經(jīng)常被用作水果和蔬菜采摘后入冷藏前噴灑，防止長時(shí)間存放和運(yùn)輸而導(dǎo)致的霉變，以提供反季節(jié)的配送[8]。TBZ在自然狀態(tài)下降解緩慢，具有較低的急性皮膚毒性，若在生產(chǎn)中過度使用，容易引起殘留量超標(biāo)，長期食入可能會(huì)引發(fā)免疫系統(tǒng)紊亂[9-10]，嚴(yán)重威脅消費(fèi)者健康。因此，世界各國都制定了TBZ的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，如GB 2763—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[11]規(guī)定香蕉、柑橘類水果中TBZ的最大殘留限量為10 mg/kg。歐盟（EU）和食品法典委員會(huì)（CAC）根據(jù)作物類型規(guī)定水果、蔬菜中TBZ的最大殘留0.05～15 mg/kg限量[12-13]。

TBZ在果蔬中含量低，需要一種合適的提取方法才能準(zhǔn)確可靠地分析其殘留量。液-液萃?。↙LE）、濁點(diǎn)萃?。–PE）[3,14-17]是經(jīng)典的提取方法，此外還有加壓液體萃?。≒LE）法、鹽析輔助均相液液萃?。⊿ALLE）法、液相微萃?。↙PME）法、固相微萃?。⊿PME）[3,18-21]等。LLE和CPE經(jīng)典的提取方法，僅限于與水互相不溶的有機(jī)溶劑作為萃取劑，只適合簡單基質(zhì)中低極性有機(jī)物的萃取，且存在有機(jī)溶劑用量大、操作步驟多、成本高等缺點(diǎn)；PLE法需要在高溫和高壓的條件下進(jìn)行，對提取設(shè)備的要求高；LPME是在液液萃取的基礎(chǔ)上發(fā)展的新型微量化溶劑提取過程，減少供體相中的雜質(zhì)對受體相的干擾，可以容納更大體積的受體相，具有操作簡單、快速、成本低、靈敏度高、穩(wěn)定性好、環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)。TBZ提取后，檢測的方法有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定分析、氣相色譜-質(zhì)譜儀測定分析、高效液相色譜法、表面增強(qiáng)拉曼光譜法、注射熒光檢測法[5,10,17,22-24]等。這些技術(shù)大多需要昂貴的設(shè)備，操作步驟多，需要精細(xì)的處理等，高效液相色譜法還對某些化合物的靈敏度較低，它們是共洗脫和不可逆吸附的峰尾，有些不能被檢測出來。試驗(yàn)采用紫外-可見分光光度計(jì)作為檢測技術(shù)，結(jié)合LPME提取，檢測TBZ殘留量僅需20 min左右，既省時(shí)又經(jīng)濟(jì)，可更簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確、可靠地分析果蔬基質(zhì)中TBZ殘留量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃瓜、圣女果、香蕉、橘子（呼和浩特市綠林源農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司）。

豬白細(xì)胞介素（Porcine interleukin，IL，GR級，Sigma公司）；Cu(NO3)2·3H2O（GR）、HNO3（GR）、乙腈（色譜級）、超純水（色譜級）（北京百靈威科技有限公司）；N-丙基乙二胺（色譜級，東莞康潤實(shí)驗(yàn)科技有限公司）；聚乙烯吡咯烷酮（GR，武漢華翔科潔生物技術(shù)有限公司）；鄰苯二甲酸氫鉀（GR）、氫氧化鈉（AR）、無水硫酸鎂（AR）、氯化鈉（AR）、甲醇（AR）、磷酸二氫鈉（AR）、檸檬酸（AR）、4.5 μm濾膜（北京康普匯維科技有限公司）；噻菌靈（純度≥99%，武漢東康源科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

破壁機(jī)（HX-PB965，佛山市海迅電器有限公司）；旋渦混合器（XH-C，常州金壇良友儀器有限）；pH計(jì)（ST3100，奧豪斯儀器（常州）有限公司）；離心機(jī)（AnkeTGL-16B，上海安亭科學(xué)儀器廠）；紫外可見分光光度計(jì)（Shimadzu UV-1800 PC，日本）。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理與制備

對蔬菜、水果先用蒸餾水初步清洗，再用超純水精細(xì)清洗后，用破壁機(jī)冷打狀態(tài)下將樣品打碎，稱取15 g樣品于50 mL帶蓋的離心管中，加入15 mL乙腈、3 g NaCl和12 g無水MgSO4用振蕩器高速振蕩2 min，在室溫、4500 r/min下離心5 min。用移液管分別取3份5 mL上清液加到20 mL離心管中，分別加入0.2 gN-丙基乙二胺和0.6 g無水MgSO4用振蕩器高速振蕩2 min，在室溫、4500 r/min下離心5 min后，用4.5 μm濾膜過濾得到TBZ提取液備用。

1.3.2 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制

表1 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制表[25]

1.3.3 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）緩沖液的配制

在100 mL容量瓶中加入32 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液后，加入1.021 g鄰苯二甲酸氫鉀用超純水定容，配成pH 5.5的PVP緩沖液備用。加入1.5 mg PVP后配成15 mg/L pH 5.5的PVP緩沖液備用。PVP具有優(yōu)異的溶解性和生物相容性[26]，理論上可以提高TBZ檢出的靈敏度，為考察其這一性能，探究在TBZ提取液一組添加PVP和另一組不添加的2組對照設(shè)計(jì)。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用乙腈溶解TBZ配制成200 mg/L的溶液，用乙腈逐步稀釋制成不同濃度梯度的TBZ標(biāo)準(zhǔn)溶液。

用超純水溶解Cu(NO3)2·3H2O配制成200 mg/L的溶液，用0.2 mol/L的HNO3溶液稀釋制成不同濃度梯度的Cu離子標(biāo)準(zhǔn)溶液[27]。

1.3.5 光波的選擇

選取TBZ標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度分別為1，10和20 mg/L這3個(gè)梯度和一個(gè)空白對照（IL和乙腈混合），按照1.3.6程序操作，在光波250～490 nm波長范圍內(nèi)測定吸光度，根據(jù)測定結(jié)果選取最大吸收波長[28]。

1.3.6 試驗(yàn)操作程序

取5 mL的TBZ提取液（或標(biāo)準(zhǔn)液，TBZ標(biāo)準(zhǔn)溶液依次配制40，80，160，320，640，1280，2560和5120 μg/L）于30 mL帶蓋的刻度離心管中，加入450 μL 5 mg/L的Cu離子標(biāo)準(zhǔn)溶液，室溫下反應(yīng)生成TBZCu絡(luò)合物形成后（約2 min），加入20 mg IL和400 μL乙腈萃取，加入超純水至15 mL，用振蕩器高速振蕩3 min，在室溫、3500 r/min下離心2 min后得到離心管底部的IL相，加入800 μL甲醇稀釋后，用紫外可見分光光度計(jì)在340 nm下進(jìn)行分光光度測定。試驗(yàn)空白值的測定為取5 mL超純水，重復(fù)上述操作。

1.3.7 IL添加量對TBZ提取率影響的設(shè)計(jì)

選擇1 mg/L的TBZ標(biāo)準(zhǔn)液作為考察對象，研究IL添加量分別為0，5，10，15，20和25 mg時(shí)對TBZ提取率的影響。以提取率高值為最佳，按式（1）計(jì)算。

式中：CIL為IL相中TBZ質(zhì)量濃度，mg/L；V1為IL相體積，800 μL；C標(biāo)準(zhǔn)為TBZ標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度，50 μg/L；V為TBZ標(biāo)準(zhǔn)液體積，5 mL。

1.3.8 乙腈添加量對TBZ提取率影響的設(shè)計(jì)

選擇1 mg/L的TBZ標(biāo)準(zhǔn)液作為考察對象，IL添加量20 mg，研究乙腈添加量0，100，200，300，400，500和600 μL對TBZ提取率的影響。提取率按式（1）計(jì)算。

1.3.9 溫度對TBZ提取率影響的設(shè)計(jì)

選擇1 mg/L的TBZ標(biāo)準(zhǔn)液作為考察對象，在IL添加量20 mg、乙腈添加量400 μL的條件下，研究萃取溫度10，20，30，40和50 ℃對TBZ提取率的影響。提取率按式（1）計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳吸收波長的確定

由圖1可知，TBZ標(biāo)準(zhǔn)溶液在波長340 nm和430 nm出現(xiàn)最大吸收峰，340 nm比430 nm處吸光度更大，表明在340 nm處檢測靈敏度更高。吸光度與TBZ質(zhì)量分?jǐn)?shù)相關(guān)性顯著，TBZ質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，吸光度越大。

圖1 不同光波下TBZ標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值

2.2 pH對TBZ提取率的影響

pH會(huì)影響到TBZ與金屬鹽的絡(luò)合，進(jìn)而會(huì)影響提取率的變化。為此，在微萃取過程中選擇pH進(jìn)行優(yōu)化。用磷酸氫二鈉-檸檬酸配制pH 3.4～8.0的緩沖液，研究pH對TBZ標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/L）提取率的影響。由圖2可知，在pH 3.4～5.4范圍內(nèi)，TBZ提取率顯著增加，提取率從51.4%增加到86.4%，在pH 5.4～5.6范圍內(nèi)TBZ提取率最高，隨著pH繼續(xù)升高，TBZ提取率開始下降，pH在7.2以上，TBZ提取率下降明顯，由此選擇pH 5.5下提取TBZ。

圖2 pH對TBZ標(biāo)準(zhǔn)溶液提取率的影響

2.3 IL添加量對TBZ提取率的影響

分散劑IL在水溶液中易形成微滴，并有助于將絡(luò)合物萃取到IL相。IL添加量較小時(shí)，相分離不完全，提取率較低。考察IL添加量對TBZ標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/L）提取率的影響，由圖3可知，IL添加可以顯著增加TBZ提取率，IL添加量從5 mg增加到20 mg時(shí)，相分離明顯增加，TBZ提取率明顯增加，IL添加量增加到20 mg以上時(shí)，提取率不再增加。

圖3 IL添加量對TBZ標(biāo)準(zhǔn)溶液提取率的影響

2.4 稀釋劑乙腈添加量對TBZ提取率的影響

乙腈有助于IL溶解其中，并促進(jìn)TBZ的絡(luò)合物一起進(jìn)入IL相。試驗(yàn)分析乙腈添加量在0～600 μL范圍內(nèi)對TBZ標(biāo)準(zhǔn)液提取率的影響。結(jié)果如圖4所示。乙腈添加量不足400 μL時(shí)，IL分散不好，相分離不完全，TBZ提取率較低。400 μL以下時(shí)，相分離清晰，TBZ提取率顯著提高。400 μL以上時(shí)，TBZ提取率不再增加。選擇乙腈添加量400 μL可以實(shí)現(xiàn)良好的相分離，得到較高的TBZ提取率。

圖4 乙腈添加量對TBZ提取率的影響

2.5 溫度對TBZ提取率的影響

溫度可以促進(jìn)TBZ絡(luò)合物溶于IL相中，試驗(yàn)考察萃取溫度在10～50 ℃范圍內(nèi)對TBZ提取率的影響。結(jié)果如圖5所示，溫度低于20 ℃，相分離非常低，導(dǎo)致提取率也較低，在40 ℃范圍內(nèi)，TBZ提取率隨溫度升高而增加，40～50 ℃范圍內(nèi)TBZ提取率不再增加，因此選擇最佳萃取溫度40 ℃。

圖5 溫度對TBZ提取率的影響

2.6 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）對TBZ提取率的影響

PVP具有優(yōu)異的溶解性和生物相容性，可以提高TBZ的檢出率。試驗(yàn)考察3個(gè)梯度的TBZ標(biāo)準(zhǔn)液（1，0.5和0.1 mg/L）一組分別添加2 mL pH 5.5的PVP緩沖液（試驗(yàn)組），另一組只添加2 mL pH 5.5鄰苯二甲酸氫鉀-氫氧化鈉緩沖液，不添加PVP（空白組）按照1.3.6的操作程序40 ℃進(jìn)行萃取，考察PVP對TBZ提取率的影響。結(jié)果如圖6所示，PVP的添加明顯提高3個(gè)梯度TBZ標(biāo)準(zhǔn)液的提取率，提取率較空白組提高9.3%。

圖6 聚乙烯吡咯烷酮對TBZ提取率的影響

2.7 對樣品中TBZ含量的檢出結(jié)果

取試驗(yàn)對象蔬菜（黃瓜、圣女果）、水果（香蕉、橘子），3個(gè)梯度的TBZ標(biāo)準(zhǔn)（5，1和0.1 mg/L）及空白組（超純水），按照1.3.1和1.3.6的操作程序，試驗(yàn)組、空白組均分別添加2 mL pH 5.5的PVP緩沖液（所有測試樣做5組平行試驗(yàn)，空白組做1組），40℃下萃取，340 nm下檢測吸光度。測定結(jié)果如表2所示，3個(gè)梯度的TBZ標(biāo)準(zhǔn)的精準(zhǔn)度均＞98%，且具有很好的穩(wěn)定性。4種蔬菜水果（黃瓜、圣女果、香蕉和橘子）中TBZ殘留量分別為0.043，2.361，6.487和5.548 mg/kg，檢測結(jié)果具有很好穩(wěn)定性。通過向樣品提供企業(yè)了解，除黃瓜樣品為本地來源，采摘后沒有使用過TBZ處理外，其他3種均在采摘后使用過TBZ，與實(shí)測結(jié)果對比基本吻合。對于沒有使用過TBZ處理的黃瓜樣品檢出微量TBZ殘留，推斷是其生長過程中土壤吸收所致。從檢測所用時(shí)間看，每個(gè)樣品需要的時(shí)間在15 min左右。

表2 樣品中TBZ的檢出結(jié)果

3 結(jié)論

試驗(yàn)研究液相微萃取技術(shù)借助IL和pH 5.5的PVP緩沖液提取樣品中TBZ，采用紫外-可見分光光度計(jì)作為檢測手段。結(jié)果表明，TBZ在pH 5.5、IL添加量20 mg、稀釋劑乙腈添加量400 μL和萃取溫度40 ℃條件下具有較高得率；PVP有助于提高TBZ得率；紫外-可見分光光度計(jì)在340 nm處檢測具有最高靈敏度。該方法有較好的精密度和良好的重現(xiàn)性，操作相對簡單，試劑消耗量低，用時(shí)少，幾乎任何實(shí)驗(yàn)室都可以使用；具有簡單、快速、易于使用和成本低的優(yōu)點(diǎn)。