頭花蓼中總黃酮的提取及對雞脯肉的抑菌效果

楊沛，劉碧林，楊洋，趙文婷，黃渝

1.重慶化工職業(yè)學(xué)院（重慶 401120）；2.太極集團西南藥業(yè)股份有限公司（重慶 400000）

頭花蓼，又名石莽草、四季紅，屬蓼科植物。主要分布在我國的云南、貴州、四川等地，是貴州省民間著名的常用草藥之一[1-2]，具有解毒止痛、消熱利尿、活血化瘀的功效。在貴州常用頭花蓼的地上部位治療泌尿系統(tǒng)感染、濕疹、風(fēng)濕、跌打損傷、腹瀉痢疾等癥狀，可謂是苗族日常生活中的必備藥[3-4]。頭花蓼的化學(xué)成分主要由揮發(fā)油、酚酸類、黃酮類化合物組成，其中，黃酮類物質(zhì)含量占比最大[5]。黃酮類化合物是一種天然的抑菌性物質(zhì)，且與動植物的親和性較高。有不少專家和學(xué)者研究黃酮類物質(zhì)的抑菌活性，陳鳳清等[6]利用超聲波輔助法從丑橘皮中提取總黃酮，并研究其對細菌和真菌的抑菌效果；王宇希[7]采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化提取丁香葉中黃酮類物質(zhì)的同時，通過體外抑菌試驗，研究黃酮類化合物對豬源性大腸桿菌的抑菌性。試驗以苗藥頭花蓼為原料，提取其中黃酮類物質(zhì)并研究其對雞脯肉的抑菌效果。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

頭花蓼（貴州威門藥業(yè)股份有限公司）；纖維素酶（河北吉捷生物科技有限公司）；無水乙醇（分析純，合肥新都化工有限公司）；石油醚（分析純，濟南廣宇化工有限公司）；蘆丁（工業(yè)純，珠海祥瑞化工有限公司）；HPD-826型大孔樹脂（西安瑞利奧萊化工有限公司）；NaNO2（分析純，西安藍翔化工有限公司）；試驗菌種（北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司）。

真空干燥箱（上海舍巖儀器有限公司）；HS-100恒溫箱（青島聚創(chuàng)環(huán)保設(shè)備有限公司）；SY-BS搖床（上海錦玟儀器設(shè)備有限公司）；ZFJ-20粉碎機（江陰市正尚機械有限公司）；CSB-10B超聲波清洗器（杭州艾普儀器設(shè)備有限公司）；L3-S紫外-可見分光光度儀（浙江賽德儀器設(shè)備有限公司）；DW-ADDR10高效液相色譜儀（上海軒儀儀器設(shè)備有限公司）；IG-50紅外光譜儀（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；BM-200生物顯微鏡（北京瑞宏誠科技發(fā)展有限公司）。

1.2 頭花蓼中總黃酮的提取

將頭花蓼的莖、葉采摘下來浸泡于蒸餾水中并洗凈，通風(fēng)自然曬干后于真空干燥箱中充分干燥，利用粉碎機碎成粉末。對粉末進行篩選，留取可通過0.250 mm孔徑篩子的粉末備用。

采用纖維素酶對粉末進行預(yù)處理，放入100 mL具塞錐形瓶中，加入適量乙醇作為溶劑放入搖床中充分混合2 h，放入超聲波清洗器中進行超聲提取3 h。過濾出濾渣，濾液放置于250 mL容量瓶中，用80%乙醇稀釋并定容。精確吸取10 mL容量瓶中溶液并蒸干，與水復(fù)溶后采用石油醚作為萃取劑萃取至溶液上層顯示無色時方可停止。分離除去石油醚層，取水相層即得試樣溶液。

1.3 總黃酮的測定

以蘆丁為標準品參照物，采用分光光度法測定總黃酮。將蘆丁加入乙醇中稀釋，用NaHCO3溶液調(diào)節(jié)溶液pH約9.0，加入NaNO2并經(jīng)Al(NO3)3顯色后，在510 nm波長下測定吸光度A。以蘆丁質(zhì)量濃度c為橫坐標，吸光度A為縱坐標進行線性擬合，得到回歸方程A=0.0114c-0.0235，相關(guān)系數(shù)r2=0.9994，在10～100 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)體現(xiàn)良好線性關(guān)系。吸光度與蘆丁質(zhì)量濃度的標準曲線如圖1所示。

圖1 蘆丁濃度-吸光度標準曲線

1.4 大孔樹脂純化總黃酮提取液

將HPD-826型大孔樹脂用90%乙醇浸泡1 d，充分溶脹后加入總黃酮提取液中，靜置吸附12 h。倒掉剩余的溶液，用去離子水洗凈大孔樹脂表面殘漬后浸入50%乙醇溶液中，設(shè)置搖床頻率80 r/min進行解吸6 h，測定解吸液的總黃酮。

1.5 黃酮提取物對雞脯肉的抑菌保鮮

1.5.1 菌懸浮液的制備[8-9]

將低溫下菌種接入液體培養(yǎng)基中，在搖床培養(yǎng)（40 ℃，180 r/min）下活化菌種。用接種環(huán)取少量活化菌種于無菌水中，稀釋一定倍數(shù)后用顯微鏡計數(shù)法計數(shù)，制成濃度為107CFU/mL的菌懸浮液進行備用。

1.5.2 黃酮提取物對微生物生長的抑制試驗

將雞脯肉絞碎搗爛呈糊狀后，菌懸浮液涂布于糊狀雞脯肉培養(yǎng)基表面。用浸泡在NaNO2溶液（0.005 g/mL）中直徑5 cm的濾紙片分別沾取不同濃度的黃酮提取物溶液，置于恒溫培養(yǎng)箱（40 ℃）48 h后，測定抑菌圈直徑、最小抑菌濃度、最低殺菌濃度來判定黃酮提取物對微生物的抑制生長作用。

抑菌圈大小的測定：參照文獻[10]，將圓形濾紙片放入滅菌箱中滅菌處理，分別放入不同濃度總黃酮提取液中浸泡15 min。將備用的菌懸浮液加入到規(guī)定菌種的培養(yǎng)皿表面，夾取浸泡總黃酮提取液的濾紙片于培養(yǎng)皿中。相同恒溫環(huán)境中培養(yǎng)菌種，每組試驗做3組平行試驗，培養(yǎng)48 h測量抑菌圈大小，最終結(jié)果以平均值計。

最小抑菌濃度（MIC）的測定[11]：將總黃酮提取液用無水乙醇稀釋成不同濃度的溶液，分別取不同濃度提取液于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，混合倒入相應(yīng)菌種培養(yǎng)基。完全凝固后分別加入1 mL菌懸浮液，于40 ℃培養(yǎng)48 h，依據(jù)菌種生長情況判斷各試驗組最小抑菌濃度。

最低殺菌濃度（MBC）的測定[12]：無菌條件下，向培養(yǎng)皿中加入PDA培養(yǎng)基，分別吸取不同濃度的總黃酮提取液加入培養(yǎng)基中。將待測菌種均勻涂布于培養(yǎng)基表面進行培養(yǎng)，若培養(yǎng)2 d仍不長菌，試驗組中出現(xiàn)這種情況的總黃酮提取液最低濃度即為最低殺菌濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外光譜分析

圖2為總黃酮提取液的紅外光譜分析圖。3285 cm-1為酚羥基O—H的伸縮振動吸收峰，2921 cm-1處為—CH2—的反對稱伸縮振動吸收峰，2851 cm-1處為—CH2—的對稱伸縮振動吸收峰，1614 cm-1處為C＝C結(jié)構(gòu)的伸縮振動峰，1517～1742 cm-1處為羧基和芳環(huán)骨架的伸縮振動吸收峰，1140～1300 cm-1處推測為苯?；Y(jié)構(gòu)上C—O和C—C的振動吸收峰，此結(jié)構(gòu)為黃酮所帶有的特征結(jié)構(gòu)，說明提取液中含有黃酮類物質(zhì)。

2.2 HPLC色譜分析

將經(jīng)大孔樹脂純化后的總黃酮提取液置于高效液相色譜儀中分析，結(jié)果如圖3所示。在保留時間2.2，3.8，30.7和47.1 min處分別出現(xiàn)一個吸收峰。與參考文獻[13-14]比對后，按照保留時間先后順序確定黃酮類物質(zhì)：陸地棉苷、槲皮素-3-O-2’’-沒食子?；?鼠李糖苷、槲皮素和山奈酚?？傸S酮提取量超過90%，純度較高。

圖3 總黃酮的HPLC圖譜

2.3 大孔樹脂的解吸條件分析

2.3.1 乙醇體積分數(shù)對解吸過程的影響

黃酮類物質(zhì)易溶于水、乙醇等極性溶劑，選用不同體積分數(shù)乙醇作為洗脫劑并測定其解吸率，結(jié)果如圖4所示。解吸率在乙醇體積分數(shù)30%～50%內(nèi)呈增大趨勢，而在50%～80%內(nèi)呈減小趨勢。乙醇體積分數(shù)50%時解吸率最大，為76%，故確定洗脫劑體積分數(shù)為50%。

圖4 洗脫劑濃度與大孔樹脂解吸率的關(guān)系曲線

2.3.2 搖床頻率對解吸過程的影響

搖床頻率的大小決定著黃酮類物質(zhì)擺脫大孔樹脂吸附束縛的能力，進而進入乙醇溶液的概率。通常情況下，搖床頻率越大，被大孔樹脂吸附的物質(zhì)越容易溢出進入到溶液體系中。搖床頻率過大容易導(dǎo)致大孔樹脂與容器發(fā)生碰撞而使得大孔樹脂或容器有所受損。因此，根據(jù)圖5綜合選擇搖床頻率為80 r/min最佳。

圖5 搖床頻率與大孔樹脂解吸率的關(guān)系曲線

2.4 黃酮提取物對雞脯肉的抑菌效果

2.4.1 總黃酮提取液對不同菌種的抑菌圈直徑

以金黃色葡萄球菌、黑曲霉、大腸桿菌、枯草桿菌4種微生物為施用對象，考察不同質(zhì)量濃度的總黃酮提取物對其抑菌圈直徑大小的測定結(jié)果，如表1所示。結(jié)果表明，總黃酮提取液對4種菌種均表現(xiàn)出一定抑制作用。其中，對金黃色葡萄球菌和黑曲霉的抑制作用明顯優(yōu)于大腸桿菌和枯草桿菌，并且其中對金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強。

表1 總黃酮提取液對不同菌種抑菌圈直徑測定結(jié)果

2.4.2 總黃酮提取液的最小抑菌濃度和最低殺菌濃度

試驗中的菌懸浮液主要組成為金黃色葡萄球菌、黑曲霉、大腸桿菌和枯草桿菌，總黃酮提取液作用于試驗菌株的效果如表2所示。頭花蓼黃酮類物質(zhì)對各種菌株的抑制作用較為明顯。其抑制效果順序為金黃色葡萄球菌＞黑曲霉＞枯草桿菌＞大腸桿菌，最小抑菌濃度分別為3.40，5.30，6.20和7.30 mg/mL。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌是雞脯肉日常冷藏過程中最常出現(xiàn)的腐敗菌種，總黃酮提取液對二者的最低殺菌濃度僅4.60和7.90 mg/mL，可以預(yù)見該黃酮提取液對雞脯肉在冷藏過程中具有良好的抑菌作用。

表2 頭花蓼黃酮的最小抑菌濃度和最低殺菌濃度測定結(jié)果

3 結(jié)論

以頭花蓼為試驗原料，采用纖維素酶——超聲波提取法提取頭花蓼中的黃酮類物質(zhì)，并用大孔樹脂進行純化。紅外光譜分析表明存在苯酰基結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)為黃酮所帶有的特征結(jié)構(gòu)，說明提取液中含有黃酮類物質(zhì)。經(jīng)HPLC色譜分析表明總黃酮提取液的化學(xué)組成主要為陸地棉苷、槲皮素-3-O-2’’-沒食子?；?鼠李糖苷、槲皮素和山奈酚，且純度超過90%。對影響大孔樹脂解吸率的乙醇體積分數(shù)和搖床頻率因素進行探討，確定洗脫劑乙醇的最佳體積分數(shù)50%，搖床頻率80 r/min。將黃酮提取物應(yīng)用于雞脯肉的抑菌保鮮，對雞脯肉冷藏過程中由于腐敗變質(zhì)出現(xiàn)的金黃色葡萄球菌、黑曲霉、大腸桿菌、枯草桿菌進行抑菌試驗。結(jié)果表明，黃酮提取物對金黃色葡萄球菌和黑曲霉的抑制作用明顯優(yōu)于大腸桿菌和枯草桿菌，其中對金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強，4種菌種均隨著黃酮質(zhì)量濃度增大而呈現(xiàn)抑菌圈直徑明顯減小。最小抑菌濃度分別為3.40，5.30，7.30和6.20 mg/mL，最低殺菌濃度分別為4.60，7.70，7.90和6.70 mg/mL，說明頭花蓼黃酮提取液對雞脯肉具有良好的抑菌作用。