黑小麥芽抗氧化活性成分提取及其抗氧化能力研究

劉瑞，于章龍 ，孫元琳，何永吉，周素梅，張慧林

1.運城學(xué)院生命科學(xué)系/特色農(nóng)產(chǎn)品加工山西省重點實驗室（運城 044000）；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花研究所（運城 044000）；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西功能食品研究院（太原 030031）；4.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所（北京 100193）

現(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)研究表明，食物的天然顏色與其營養(yǎng)功能密切相關(guān)，顏色愈深，其營養(yǎng)愈豐富，結(jié)構(gòu)愈平衡合理[1]。黑色食品與普通食品相比，不但具有較高的營養(yǎng)價值，而且富含抗氧化物質(zhì)，可改善體質(zhì)，延緩衰老。黑小麥以其自然性、營養(yǎng)性、功能性和科學(xué)性愈來愈受到人們的關(guān)注。黑小麥麥粒中含有豐富的淀粉、脂肪、蛋白質(zhì)、多種維生素、食物纖維、大量礦質(zhì)元素和稀有微量元素，黑小麥麥粒中14%～20%含蛋白質(zhì)[2]；18種氨基酸總含量高于普通小麥40%；賴氨酸含量為0.4%，高于普通小麥50%左右[3]。研究表明，黑小麥中含有黃酮、多糖和多酚等多種活性成分物質(zhì)，在清除自由基、抗衰老、治療心腦血管疾病、降血脂降血壓、降低血糖等方面表現(xiàn)出十分多樣的藥理活性作用[4-6]。隨著“健康中國戰(zhàn)略”的實施，人類對食品的生理功能和營養(yǎng)價值要求越來越高，而發(fā)芽谷物因其營養(yǎng)價值提高、功能成分富集以及原有害物質(zhì)或抗營養(yǎng)物質(zhì)降低或消除等多種有利變化，發(fā)芽谷物的開發(fā)利用正在引起國內(nèi)外廣泛關(guān)注并成為研究熱點[7-8]。通過多種有機溶劑，復(fù)配出不同極性的提取劑，對黑小麥芽進行萃取，并對黑小麥芽提取物中的總酚進行測定，通過不同的體外抗氧化活性評價方法評價提取物的抗氧化活性，通過相關(guān)性分析篩選出具有較高活性的組分，為后期分離純化提供研究基礎(chǔ)。本研究為黑小麥綜合應(yīng)用于疾病的輔助治療和膳食營養(yǎng)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

運黑14207種子，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花研究所提供；福林酚試劑（Folin-Ciocalteu），美國Sigma公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

SCIENTZ真空冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；JYL-C010干磨粉碎機，九陽股份有限公司；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；KS-100AL超聲波清洗機，深圳潔康洗凈電器有限公司；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；UV-9000S型可見-紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料預(yù)處理

稱取100 g運黑14207種子，用300 mL蒸餾水在25℃下浸泡8 h。撈出瀝干，均勻鋪灑在底部有孔的發(fā)芽盒中，于25 ℃暗處發(fā)芽，發(fā)芽期間每天澆水3次，每次澆水量為300 mL，待麥芽長約為2 cm時結(jié)束發(fā)芽。將收獲的麥芽裝于自封袋中，置于-80 ℃的冰箱中冷凍24 h，然后進行真空冷凍干燥24 h。將干燥好的麥芽置于干磨粉碎機中粉碎處理，麥芽粉裝于自封袋中于4 ℃的冰箱冷藏備用。

1.2.2 溶劑配制及萃取

分別配制50%，75%和100%乙醇、甲醇和丙酮溶液，以蒸餾水為對照。稱取10 g麥芽粉，與提取溶劑按照料液比1∶10（g/mL）混合，在40 kHz功率超聲波輔助提取30 min，期間用玻璃棒間歇攪拌，經(jīng)抽濾，將濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中除去有機溶劑，獲得提取液，并置于平面皿中，真空冷凍干燥，稱其質(zhì)量并計算得率（Extract yield，EY）。凍干樣品密封包裝4℃冷藏備用。

式中：凍干樣質(zhì)量，g。

1.2.3 提取物中總酚測定

總酚（TP）測定采用Folin-Ciocalteu試劑法[9]，結(jié)果以每毫升溶液中沒食子酸（GAE）當量表示樣品中總酚。準確移取100 μL樣液、500 μL菲林試劑和6 mL蒸餾水于試管中，以1400 r/min振蕩1 min，對照樣為純水。然后加入2 mL 15% Na2CO3溶液，繼續(xù)以1400 r/min振蕩0.5 min，然后用蒸餾水定容至10 mL。避光靜置2 h，然后在750 nm處測定吸光度。以沒食子酸作標準曲線，并求得回歸方程y=0.001x+0.0228（R2=0.9963）。式中，x為沒食子酸質(zhì)量濃度（mg GAE/mL），y為吸光度。

總酚提取能力（TPEC），即溶劑提取總酚的能力，按式（2）進行計算。

1.2.4 提取物對DPPH自由基清除能力測定

提取物的DPPH自由基清除能力測定參考Zhu等[10]方法，并稍作改進，清除能力以半數(shù)抑制率IC50值計。將DPPH用75%乙醇配制成0.04 mg/mL溶液，將樣品用75%乙醇分別配制成0.3，0.6，1.2，1.8，2.4和4 mg/mL的溶液，然后將兩者等比例混合，避光靜置30 min，在517 nm處測定吸光度。樣品對DPPH清除率I按照式（3）計算。

式中：A為樣品的吸光度；A1為陽性空白（無DPPH溶液）的吸光度；A0為陰性空白（無樣品溶液）的吸光度。

抗氧化物提取能力（AECDPPH）按照式（4）計算，其含義為用DPPH法評價該溶劑對樣品中抗氧化物的提取能力，其值越高，說明該溶劑提取抗氧化物能力越強。

1.2.5 提取物對ABTS自由基清除能力測定

ABTS自由基清除能力測定參考Re等[11]方法，并稍作修改。取20 mL 7 mmol/L的ABTS水溶液和0.352 mL 140 mmol/L過硫酸鉀水溶液混合避光過夜放置，然后用PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）將混合液稀釋至吸光度=0.700±0.002，制備得到ABTS自由基溶液。取6 mL ABTS自由基溶液，分別與4 mL不同質(zhì)量濃度（30，60，120，180，240和400 μg/mL）的樣品液混合，靜置6 min后，在420 nm處測定吸光度。清除率、IC50（ABTS）和AECABTS計算方法同1.2.4小節(jié)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)，得到半數(shù)抑制率IC50值，采用鄧肯氏方差分析判定差異顯著性（p＜0.05），相關(guān)性分析采用Pearson模式。

2 試驗結(jié)果及分析

2.1 不同溶劑對麥芽提取物得率的影響

溶劑提取是天然產(chǎn)物分離提取中較為常用的方法，即根據(jù)相似相溶的原理，從原料中提取極性與之相近的物質(zhì)，然后除去溶劑得到純物質(zhì)。研究采用不同極性的溶劑對原料進行一次性提取，可從原料中篩選出某種極性的物質(zhì)。得率體現(xiàn)了某種溶劑可提取出的可溶性物質(zhì)的多少，得率高則提示樣品中易溶于該溶劑的物質(zhì)成分含量較高[12]。從圖1可以看出，蒸餾水提取物得率為18.77%，顯著高于其余有機溶劑提取物得率（p＜0.05），50%甲醇組次之，100%丙酮組最低，為2.08%。強極性溶劑提取得率比弱極性高，因為黑小麥發(fā)芽過程中可溶性蛋白、總氨基酸和必需氨基酸的濃度增加，這與張雨薇等[13]探討發(fā)芽對蕎麥蛋白質(zhì)和氨基酸的影響結(jié)果一致。而對于極性較弱的丙酮溶劑，只有少量的油脂和葉綠素溶出，所以其得率最低。

圖1 不同溶劑對麥芽提取物得率的影響

2.2 不同溶劑對麥芽提取物總酚及總酚提取能力的影響

總酚（TP）是以沒食子酸當量體現(xiàn)總酚的質(zhì)量分數(shù)。從圖2可以看出，在10種溶劑提取物中，100%乙醇提取物中總酚的質(zhì)量分數(shù)最大，為3.8 mg GAE/100 mg，50%甲醇提取物次之，50%丙酮提取物總酚的質(zhì)量分數(shù)最低，為1.95 mg GAE/100 mg。由此可知，黑麥芽中多酚具有較高極性。Szwajgier等[14]研究表明，小麥發(fā)芽后酚酸含量，特別是阿魏酸含量顯著增加。且一般而言，具有較高極性的溶劑提取酚類化合物的效率也更高[15]。

圖2 不同溶劑對麥芽提取物總酚質(zhì)量分數(shù)的影響

總酚提取能力是結(jié)合得率和提取物中總酚質(zhì)量分數(shù)考察溶劑的提取效果。從圖3可以看出，對比10種溶劑對麥芽的總酚提取能力的影響，75%乙醇處理組黑麥芽總酚提取能力最高，為41.07，且75%乙醇、50%甲醇和蒸餾水對黑麥芽總酚提取能力的影響無顯著性差異（p＞0.05）。100%丙酮處理組黑麥芽總酚提取能力最小，為5.82。Gan等[16]對發(fā)芽黑小麥的研究結(jié)果表明，發(fā)芽3～8 d可顯著提高黑小麥可溶性和結(jié)合性提取物的抗氧化活性和總酚質(zhì)量分數(shù)，可溶性提取物主要是黃酮類，結(jié)合性提取物主要是阿魏酸和香豆酸。

圖3 不同溶劑對麥芽樣品總酚提取能力的影響

2.3 不同溶劑對麥芽提取物DPPH自由基清除能力及抗氧化物提取能力的影響

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的以氮原子為中心的自由基，若樣品能將其清除，則提示樣品具有降低自由基有效濃度，以及中斷脂質(zhì)過氧化鏈式反應(yīng)的作用[17]。DPPH自由基清除率以IC50值表示，其值越低，表明自由基清除能力越強。由圖4可以看出，純有機溶劑提取物均表現(xiàn)出較強的DPPH自由基清除能力，且顯著高于其余處理組（p＜0.05），且此次研究中不同體積分數(shù)的甲醇和乙醇溶液所對應(yīng)的提取物表現(xiàn)出高于蒸餾水提取物的DPPH自由基清除能力（p＜0.05）。前人研究也表明，60%乙醇處理的花生殼提取物DPPH自由基清除率高于蒸餾水處理組[18]。

圖4 不同溶劑對麥芽提取物DPPH自由基清除能力的影響

抗氧化物提取能力（AECDPPH）是綜合得率和提取物DPPH自由基清除能力評價不同溶劑對抗氧化物的提取效果，其值越高，表明溶劑對抗氧化物的提取效果越好。由圖5可以看出，10種溶劑中75%乙醇提取物的AEC值較高，為11.37，說明其提取效果較好。75%乙醇與蒸餾水對黑麥芽抗氧化物的提取效果的影響無顯著性差異（p＞0.05）。

圖5 不同溶劑對基于DPPH法評價抗氧化物提取能力的影響

2.4 不同溶劑對麥芽提取物ABTS自由基清除能力及抗氧化物提取能力的影響

在有供氫能力的抗氧化劑（如酚類物質(zhì)）存在下，ABTS自由基與之反應(yīng)，變成沒有顏色的ABTS。ABTS自由基脫色試驗是一種用于評價生物樣品抗氧化活性的方法[19]。ABTS自由基清除能力以IC50值表示，其值越低，表明ABTS自由基清除能力越強。由圖6可以看出，10種溶劑中100%甲醇提取物ABTS自由基清除率較高，其IC50值為0.05 mg/mL，50%乙醇次之?？芍?00%甲醇和50%乙醇提取物ABTS自由基清除能力較強。

抗氧化物提取能力（AECABTS）是以ABTS法評價不同溶劑對黑麥芽抗氧化物的提取能力，其值越高，表明提取效果越好。由圖7可以看出，10種溶劑中50%乙醇對基于ABTS法的抗氧化物的提取能力較強，AEC為170.00，且50%乙醇、75%乙醇和蒸餾水組的AEC值無顯著性差異（p＞0.05）。結(jié)合圖6可知，基于ABTS評價方法，50%乙醇提取物ABTS自由基清除能力較高，且抗氧化物提取能力也較強。

圖6 不同溶劑對麥芽提取物ABTS自由基清除能力的影響

圖7 不同溶劑對基于ABTS法評價抗氧化物提取能力的影響

2.5 相關(guān)性分析

為了研究黑小麥麥芽提取物多酚質(zhì)量分數(shù)及抗氧化性之間的關(guān)系，對各項指標進行相關(guān)性分析，結(jié)果如表1所示?？偡淤|(zhì)量分數(shù)（TP）與總酚提取能力（TPEC）具有顯著相關(guān)性，TP與DPPH、ABTS清除率都具有顯著的負相關(guān)，說明黑小麥芽多酚具有明顯的抗氧化作用。此研究結(jié)果與Siddhuraju等[20]研究結(jié)果一致。此外，TP與AECDPPH具有顯著的相關(guān)性，說明提取物的抗氧化性主要來源于多酚，TPEC與AECDPPH具有顯著的正相關(guān)，說明溶劑對總酚提取能力的水平與對抗氧化物質(zhì)提取能力一致，此研究結(jié)果與Chen等[21]研究結(jié)果一致，且考慮到DPPH法操作簡單、方便快捷，因此更適于黑小麥麥芽提取物抗氧化活性的評價。

表1 相關(guān)性分析

3 結(jié)論

對運黑14207黑小麥芽的不同極性提取物的得率、總酚質(zhì)量分數(shù)、抗氧化能力和相關(guān)性分析進行研究。在10種溶劑中，75%乙醇處理組黑小麥芽多酚類物質(zhì)提取能力較高，且與蒸餾水處理組之間無顯著性差異（p＞0.05）?；贒PPH自由基清除能力，純有機溶劑提取物對DPPH自由基清除率較高，就抗氧化物提取能力而言75%乙醇組最高（11.37），且與蒸餾水處理組之間無顯著性差異（p＞0.05）。基于ABTS自由基清除能力，100%甲醇溶劑提取物和50%乙醇溶劑提取物對ABTS自由基清除率較強，其ABTS IC50值分別為0.05和0.058 mg/mL，就抗氧化物提取能力而言，50%乙醇組最高（170.00），且與蒸餾水處理組之間無顯著性差異（p＞0.05）。綜上比較，考慮到蒸餾水的成本低、安全性高，且對于總酚及抗氧化物質(zhì)的提取能力均較高，故其更適合作提取劑。根據(jù)相關(guān)性分析，酚類物質(zhì)對黑小麥芽提取物的抗氧化性起主導(dǎo)作用，DPPH法更適合作為評價黑小麥芽提取物抗氧化能力的快速檢測方法。