響應(yīng)面法優(yōu)化提高藥桑葉綠茶中γ-氨基丁酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的殺青工藝

郭紅梅，梁雎，劉志剛，李海峰，胡西旦·買買提，任紅松

新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院吐魯番農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所（吐魯番 838000）

藥桑（medicine mulberry）屬薔薇目（Rosales）?？疲∕oraceae）桑屬（MorusL.）黑桑種（M.nigraL.）[1]，是新疆珍稀的藥食兼用桑樹品種資源，體細(xì)胞染色體倍數(shù)為22倍體[2]。與其他桑葉品種相比，藥桑含有更高的營(yíng)養(yǎng)成分和次生物質(zhì)藥理活性[1]。桑葉綠茶是我國(guó)桑葉食品加工的主要形式，可有效保存桑葉的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)成分[3]。其中，γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是桑葉中重要的活性成分[4]，是動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有降血壓、提高肝腎功能、抗衰老、抗疲勞、促進(jìn)睡眠、治療糖尿病等作用[5-9]。同時(shí)γ-氨基丁酸是一種與逆境脅迫有關(guān)的非蛋白氨基酸，在吐魯番極端高溫干燥的脅迫下，可導(dǎo)致其大量生成[10]。20世紀(jì)80年代，日本開(kāi)發(fā)出了高質(zhì)量分?jǐn)?shù)GABA的綠茶，并將茶葉中GABA在1.5 mg/g以上稱為GABAron茶，同時(shí)具有茶葉和GABA的保健功效[11]，在日本形成了穩(wěn)定的消費(fèi)群體[12]。在我國(guó)GABA茶發(fā)展迅速，具有廣泛的市場(chǎng)前景[12]。邊偉等[13]研究了對(duì)不同殺青方式制備高質(zhì)量分?jǐn)?shù)GABA桑葉茶的影響。黃亞輝等[14]制備了達(dá)GABAron茶標(biāo)準(zhǔn)的茗豐茶，并開(kāi)展臨床降壓試驗(yàn)，取得了非常顯著的降壓效果。Chen等[15]利用采自臺(tái)灣的青心烏龍茶制備了高質(zhì)量分?jǐn)?shù)GABA（3 mg/g）茶葉，提出此GABA茶可降低高血壓引起的心臟異常。王子瑞等[16]以大葉種茶鮮葉為主要原料，加工成γ-氨基丁酸普洱茶，GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到2.5 mg/g以上。

桑葉茶加工工藝主要繼承茶葉加工工藝，難以體現(xiàn)桑葉綠茶的品質(zhì)特征，有針對(duì)性的工藝研究仍有很大空間[17-18]。孫慶磊等[19]指出鮮葉品質(zhì)（老嫩、含水量）、溫度、時(shí)間、投葉量是綠茶殺青工藝的主要影響因素。其中殺青前的鮮葉含水量由攤放階段決定。倪德江等[20]認(rèn)為鮮葉攤晾的時(shí)間為5～8 h，邊偉等[13]試驗(yàn)認(rèn)為攤放3 h以上，內(nèi)含物質(zhì)充分水解，攤放葉的水浸出物濃度有明顯的升高。葉玉龍[21]認(rèn)為生產(chǎn)中以鮮葉含水量至70%左右為攤放適度。

滾筒殺青是國(guó)內(nèi)應(yīng)用最為廣泛的方式，能大規(guī)模連續(xù)機(jī)械運(yùn)作，生產(chǎn)應(yīng)用較多。但滾筒殺青對(duì)人工操作技術(shù)的要求很高[22]，制茶工序關(guān)鍵參數(shù)待挖掘[23]。王彬等[24]在以殺青時(shí)間為單因素的試驗(yàn)中，一次大量投葉。張啟利等[25]指出6CS-40型滾筒殺青機(jī)從進(jìn)葉到出葉的時(shí)間為60 s，在制茶實(shí)踐中是保證鮮葉殺青勻透的最少時(shí)間。楊秀榮[26]結(jié)合茶葉內(nèi)含物質(zhì)檢測(cè)分析與感官評(píng)審結(jié)果，認(rèn)為最佳殺青條件為140 ℃，55 s。范作卿等[27]試驗(yàn)總結(jié)出滾筒殺青255 ℃，30 s得到的桑葉茶DNJ濃度最高。倪德江等[20]認(rèn)為滾筒殺青應(yīng)在固定殺青溫度的條件下，勻速小撮投葉，使鮮葉在滾筒的翻滾、拋灑、推進(jìn)中均勻地吸收熱量、蒸發(fā)水分，達(dá)到鮮葉迅速萎軟殺熟的目的。

經(jīng)厭氧處理的GABA茶因?yàn)橛忻黠@的異味限制其推廣[12]，現(xiàn)行茶葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)常綜合桑葉活性物質(zhì)指標(biāo)和感官評(píng)定的結(jié)果來(lái)評(píng)價(jià)[13,26]。為挖掘吐魯番市桑樹資源，選取吐魯番地產(chǎn)和引種栽培的主要桑樹品種為試驗(yàn)材料，結(jié)合吐魯番藥桑葉品質(zhì)特點(diǎn)，以殺青溫度、殺青時(shí)間、鮮葉含水量和投葉量為因素，研究藥桑葉綠茶GABA的形成及茶葉感觀品質(zhì)的最優(yōu)滾筒殺青參數(shù)，旨在制備兼顧高質(zhì)量分?jǐn)?shù)GABA和感觀品質(zhì)的藥桑綠茶，促進(jìn)桑葉茶產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)樣本

藥桑鮮葉由吐魯番市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范園區(qū)提供，2019年5月采摘，選取從頂芽向下2～6片新鮮桑葉。

1.1.2 儀器與設(shè)備

6CS-40型滾筒殺青機(jī)、6CR-40型揉捻機(jī)（浙江綠峰機(jī)械有限公司）；6CCGQ-50雙鍋曲毫炒干機(jī)（浙江上洋機(jī)械有限公司）；EL-PH7.0 pH計(jì)（廈門恩萊自動(dòng)化科技有限公司）；離心機(jī)Sigma3K15（德國(guó)）；TLG-01樣品粉碎機(jī)（北京天利恒誠(chéng)科技有限公司）；JA1203B電子天平（上海菁海儀器有限公司）；DZKW-S-4電熱恒溫水?。ū本┦杏拦饷麽t(yī)療儀器有限公司）；UV754N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；DHG-9070電熱恒溫干燥箱（上海鴻都電子科技有限公司）；水分測(cè)定儀（上海禾工科學(xué)儀器有限公司）；比色皿、移液管、臺(tái)秤（精度g）、秒表、茶樣罐等。

1.1.3 主要試劑

硼酸、重蒸酚、三氯化鋁、GABA標(biāo)準(zhǔn)樣品，上海麥克林生化科技有限公司；丙酮，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鉀，天津永晟精細(xì)化工有限公司；甲醇，北京化工廠；乙醇，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司；所有試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 攤放工藝處理

試驗(yàn)在吐魯番市高昌區(qū)室溫25～30 ℃條件下攤放，相對(duì)濕度32%～35%。鮮葉攤放厚度3～5 cm，每0.5 h翻勻一次，抖去葉片水分，于不同時(shí)段（0，1，2，3，4，5，6和7 h）取樣測(cè)定鮮葉含水量及GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)。用隸屬函數(shù)法[28]對(duì)測(cè)定的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，消除不同指標(biāo)間量綱差異。

式中：Xij為第i個(gè)樣品第j個(gè)指標(biāo)的檢測(cè)值；Xmax和Xmin分別為第j項(xiàng)指標(biāo)的最大值和最小值；Yij為經(jīng)轉(zhuǎn)化后的隸屬函數(shù)值；將各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值作為原始值進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。綜合GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)和鮮葉含水量的隸屬函數(shù)值計(jì)算綜合評(píng)分。權(quán)重分配GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)占0.5，含水量占0.5。

1.2.2 殺青工藝處理

1.2.2.1 殺青標(biāo)準(zhǔn)的及各因素水平的確定

以殺青葉葉色暗綠、青草氣消失而具有香氣、葉脈折而不斷、葉質(zhì)柔軟、緊握成團(tuán)及松手散開(kāi)為感官品質(zhì)依據(jù)，考察不同殺青條件下的各因素水平。在殺青時(shí)間單因素試驗(yàn)中，將1.2.1小節(jié)優(yōu)化處理之后的材料稱取5 kg一次性投葉，考察在固定溫度下不同處理時(shí)間的殺青質(zhì)量。采用二次殺青的方法延長(zhǎng)殺青時(shí)間，在達(dá)到考察的殺青時(shí)間時(shí)改變滾筒傾角提前出葉。在殺青溫度和投葉量單因素試驗(yàn)中，采用均速小撮的方式投葉，達(dá)到殺青勻透的目的。

1.2.2.2 殺青工藝對(duì)藥桑葉綠茶GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響的單因素試驗(yàn)

將1.2.1小節(jié)優(yōu)化處理之后的材料混勻進(jìn)行滾筒殺青處理。得到殺青工藝處理參數(shù)：殺青溫度（固定條件：投葉量36 kg/h，殺青時(shí)間160 s）230，240，250，260和270 ℃；殺青時(shí)間（固定條件：殺青溫度240 ℃，投葉量36 kg/h）100，130，160，190和220 s；投葉量（固定條件：殺青時(shí)間160 s，殺青溫度240℃）24，30，36，42和48 kg/h。殺青結(jié)束后按綠茶標(biāo)準(zhǔn)工藝加工成茶，對(duì)試驗(yàn)樣品進(jìn)行感觀評(píng)審和GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定。用1.2.1 小節(jié)中的隸屬函數(shù)法對(duì)測(cè)定的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，綜合GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)和感官評(píng)分的隸屬函數(shù)值計(jì)算綜合評(píng)分。權(quán)重分配GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)占0.5，感官評(píng)分占0.5。

1.2.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

通過(guò)單因素試驗(yàn)，確定響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和水平。采用中心組合試驗(yàn)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取3個(gè)主要影響因子的水平為自變量，以其藥桑葉綠茶綜合評(píng)分為響應(yīng)值，采用三因素三水平的響應(yīng)面法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，得出藥桑葉綠茶的最優(yōu)殺青工藝，并驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的有效性。響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平及編碼

1.2.3 檢測(cè)方法

1.2.3.1 GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)

γ-氨基丁酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用夏玉玲等[29]的方法。

1.2.3.2 感官評(píng)分

感官品質(zhì)評(píng)定按照GB/T 23776—2018《茶葉感官審評(píng)方法》[30]的要求進(jìn)行，評(píng)價(jià)藥桑葉茶的感官品質(zhì)。由10位鑒評(píng)專業(yè)人員組成鑒評(píng)小組，分別稱取3 g藥桑葉茶，加入150 mL沸水沖泡4 min，倒出茶湯，依次評(píng)審藥桑葉茶的干茶外形、湯色、香氣、滋味、葉底。各項(xiàng)目以100分計(jì)，總分參照茶葉審評(píng)加權(quán)法計(jì)算，按照外形25%、香氣25%、湯色10%、滋味30%、葉底10%、計(jì)算總分，取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理和圖表繪制使用Microsoft Excel 2010與Design-Expert.V 8.0.6.1，方差分析使用SPSS 19.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 攤晾時(shí)間對(duì)藥桑葉綠茶綜合評(píng)分的影響

由圖1可以看出，攤晾時(shí)間小于3 h，綜合評(píng)分隨著攤晾時(shí)間的增加而逐漸升高；大于3 h時(shí)，綜合評(píng)分隨著攤晾時(shí)間的增加而逐漸降低。主要是由于當(dāng)攤晾時(shí)間較短時(shí)，葉片內(nèi)含物質(zhì)水解不充分。葉片含水量高，殺青葉具有水悶氣，從而影響殺青葉質(zhì)量。當(dāng)攤晾時(shí)間超過(guò)3 h時(shí)，葉片大量失水，以致殺青葉葉緣干枯卷曲，造成后期揉捻中葉片斷碎，成型困難。因此，選擇攤晾時(shí)間3 h為適宜的條件。

圖1 攤晾時(shí)間對(duì)藥桑綠茶綜合評(píng)分的影響

2.1.2 殺青溫度對(duì)藥桑葉綠茶綜合評(píng)分的影響

由圖2可知，當(dāng)殺青投葉量和殺青時(shí)間為定值（36 kg/h，160 s）時(shí)，綜合評(píng)分隨著殺青溫度的增加而增大。當(dāng)殺青溫度為240 ℃時(shí)，綜合評(píng)分出現(xiàn)最大值，隨后繼續(xù)提高殺青溫度，綜合評(píng)分逐漸降低。這是因?yàn)闅⑶鄿囟仍?30～270 ℃范圍內(nèi)，隨著殺青溫度的升高，葉片感觀品質(zhì)得到提高，茶湯更加鮮醇濃郁，香氣顯露。當(dāng)殺青溫度超過(guò)260 ℃時(shí)，殺青葉略顯硬脆，感觀綜合評(píng)分開(kāi)始下降。隨著殺青溫度的升高，內(nèi)含物質(zhì)GABA逐漸降低。因此，選取殺青溫度230，240和250 ℃ 3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖2 殺青溫度對(duì)藥桑綠茶綜合評(píng)分的影響

2.1.3 殺青時(shí)間對(duì)藥桑葉綠茶綜合評(píng)分的影響

由圖3可知，當(dāng)殺青溫度和投葉量為定值（240℃，36 kg/h）時(shí)，綜合評(píng)分隨著殺青時(shí)間的延長(zhǎng)而增大。當(dāng)殺青時(shí)間為160 s時(shí)，綜合評(píng)分出現(xiàn)最大值，隨后繼續(xù)延長(zhǎng)殺青時(shí)間，綜合評(píng)分呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。這是因?yàn)殡S著殺青時(shí)間的延長(zhǎng)，殺青更加充分，殺青葉萎軟暗綠，感觀潤(rùn)澤，香氣高強(qiáng)。感官評(píng)分也隨之提高，當(dāng)殺青時(shí)間超過(guò)為190 s時(shí)，殺青葉含水量過(guò)低，感觀評(píng)分逐漸降低。隨著殺青時(shí)間的延長(zhǎng)，內(nèi)含物質(zhì)GABA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)先升高后逐漸降低。當(dāng)殺青時(shí)間為160 s時(shí)，GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到峰值。因此，選取殺青時(shí)間130，160和190 s 3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖3 殺青時(shí)間對(duì)藥桑綠茶綜合評(píng)分的影響

2.1.4 投葉量對(duì)藥桑葉綠茶綜合評(píng)分的影響

由圖4可知，當(dāng)殺青溫度和殺青時(shí)間為定值（240℃，160 s）時(shí)，綜合評(píng)分隨著投葉量的增大而提高。當(dāng)投葉量為36 kg/h時(shí)，綜合評(píng)分出現(xiàn)最大值，隨后繼續(xù)增大投葉量，綜合評(píng)分呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。這是因?yàn)殡S著投葉量的增加，殺青葉青綠色消失，葉片柔軟有清香。當(dāng)投葉量超過(guò)42 kg/h后，葉片出現(xiàn)花雜，熟葉中夾雜青綠葉，殺青不均不透，感觀評(píng)分也隨之降低。隨著投葉量的升高，內(nèi)含物質(zhì)GABA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)先升高后逐漸降低，當(dāng)投葉量為36 kg/h時(shí)，GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到峰值。因此，選取投葉量30，36和42 kg/h 3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖4 投葉量對(duì)藥桑葉綠茶綜合評(píng)分的影響

2.2 藥桑葉綜合評(píng)分響應(yīng)面法試驗(yàn)

2.2.1 藥桑葉綜合評(píng)分?jǐn)M回歸模型的建立

按照中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。將所得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design-Expert軟件進(jìn)行多元回歸擬合，得到以GABA為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程：Y=0.87-0.054A+5×10-3B+6.25×10-3C+0.015AB-2.5×10-3AC+0.09BC-0.08A2-0.053B2-0.13C2。

表2 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2.2 試驗(yàn)結(jié)果的方差顯著性分析

由表3可以看出，回歸模型方差分析表明回歸模型顯著（p＜0.01），回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果R2為0.9977，說(shuō)明此模型與數(shù)據(jù)擬合度很高。方差分析表中失擬p值為0.6507，大于0.05，說(shuō)明此模型可以充分解釋響應(yīng)中的變異，模型擬合度很高，試驗(yàn)誤差小?？梢杂么四Ｐ蛯?duì)滾筒殺青制取藥桑葉綠茶的綜合評(píng)分進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

表3 回歸模型方差分析

在該模型中，模型項(xiàng)F值為339.48，說(shuō)明該模型是有意義的。由表3數(shù)據(jù)可知，在一次項(xiàng)中A（殺青溫度）為顯著，在交互項(xiàng)中AB和BC存在顯著交互作用，在二次項(xiàng)中A（殺青溫度）、B（殺青時(shí)間）和C（投葉量）的二次項(xiàng)表現(xiàn)為極顯著，表明殺青溫度、殺青時(shí)間和投葉量之間的相互作用對(duì)綜合評(píng)分有一定影響，交互作用顯著。由F檢驗(yàn)結(jié)果的顯著性分析可知，各因素對(duì)反應(yīng)的貢獻(xiàn)率，影響顯著性由大到小依次為A＞C＞B，即殺青溫度＞投葉量＞殺青時(shí)間。

2.2.3 響應(yīng)曲面分析

殺青溫度、殺青時(shí)間、投葉量及其交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響如圖5～圖7所示。

圖5 殺青溫度和殺青時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分影響的等高線與響應(yīng)面圖

圖6 殺青溫度和投葉量對(duì)綜合評(píng)分影響的等高線與響應(yīng)面圖

圖7 殺青時(shí)間和投葉量對(duì)綜合評(píng)分影響的等高線與響應(yīng)面圖

由圖5可以看出，當(dāng)投葉量一定時(shí)，藥桑葉綠茶的感官評(píng)分隨殺青溫度的升高和殺青時(shí)間的增加先升高后降低。由圖6可以看出，當(dāng)殺青時(shí)間一定時(shí)，隨著另外兩個(gè)因素的變化，藥桑葉綠茶感官評(píng)分呈現(xiàn)先不斷增加后下降的趨勢(shì)。由圖7可以看出，當(dāng)殺青溫度一定時(shí)，藥桑葉綠茶的感官評(píng)分隨殺青時(shí)間和投葉量的增加呈現(xiàn)升高后降低的趨勢(shì)。

運(yùn)用Design-Expert 8.0.5軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化分析，滾筒殺青制取高質(zhì)量分?jǐn)?shù)GABA藥桑葉綠茶的最佳條件為殺青溫度236.65 ℃、殺青時(shí)間145.49 s、投葉量33.11 kg/h。在此條件下預(yù)測(cè)的感官評(píng)分為0.88。為檢驗(yàn)響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)條件，將工藝條件修正為殺青溫度240 ℃、殺青時(shí)間145 s、投葉量33 kg/h。在最佳工藝下制備的藥桑葉綠茶湯色黃亮，滋味鮮醇，清新宜人。綜合評(píng)分實(shí)際值為0.89分GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)4.2 mg/g，比加工前的3.3 mg/g增加了27.27%，達(dá)到了高質(zhì)量分?jǐn)?shù)GABA綠茶的標(biāo)準(zhǔn)，具有一定的保健作用。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和應(yīng)用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法建立的二次回歸模型，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出高質(zhì)量分?jǐn)?shù)藥桑葉綠茶殺青的最佳工藝條件：殺青溫度240 ℃、殺青時(shí)間145 s、投葉量33 kg/h。試驗(yàn)結(jié)合茶葉GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)檢測(cè)分析與感官評(píng)審結(jié)果，研究了影響桑葉綠茶GABA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)茶葉感觀品質(zhì)的加工參數(shù)，制備了兼顧高GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)和感觀品質(zhì)的桑葉綠茶，為藥桑葉綠茶的實(shí)際生產(chǎn)提供了一定的依據(jù)。