高濃度蔗糖乙醇分批發(fā)酵過程

劉明，伍時(shí)華，龍秀鋒，易弋，趙雪梅

1.廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院（柳州 545006）；2.廣西科技大學(xué)廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（柳州 545006）

廣西盛產(chǎn)甘蔗，甘蔗主要用來生產(chǎn)白砂糖，副產(chǎn)物甘蔗糖蜜主要用于發(fā)酵生產(chǎn)酒精，可加工成食用酒精、醫(yī)用酒精和燃料乙醇[1]等產(chǎn)品。醫(yī)用酒精是新冠肺炎疫情防控的重要物資，用量劇增。蔗糖酒精發(fā)酵用的釀酒酵母能分泌蔗糖水解酶，在細(xì)胞外水解蔗糖生成果糖和葡萄糖[2]，酵母細(xì)胞在胞內(nèi)利用葡萄糖和果糖經(jīng)糖酵解途徑生成丙酮酸，在無氧條件下丙酮酸經(jīng)氧化脫羧和加氫還原轉(zhuǎn)化為乙醇。葡萄糖與果糖共用一套膜運(yùn)輸和酶催化體系，但由于膜運(yùn)輸和酶親和力的差異，酵母葡萄糖利用率大于果糖利用率[3-4]。

甘蔗汁和甘蔗糖蜜乙醇發(fā)酵的文獻(xiàn)有很多，模擬甘蔗汁發(fā)酵下果糖和葡萄糖利用的差異性研究[5-7]，不同濃度甘蔗原汁發(fā)酵和調(diào)整甘蔗汁總糖濃度進(jìn)行高濃度乙醇發(fā)酵研究[8-11]，不同菌株對甘蔗糖蜜乙醇發(fā)酵比較和可行性研究[12-14]，甘蔗糖蜜在不同工藝下高產(chǎn)酒精[15-17]等方面，但是鮮有從過程中探究蔗糖乙醇發(fā)酵過程規(guī)律的文獻(xiàn)，因此研究高濃度蔗糖乙醇發(fā)酵過程中酵母、乙醇、糖類過程中的變化就顯得比較有意義。試驗(yàn)研究高質(zhì)量濃度（260 g/L）蔗糖乙醇分批發(fā)酵過程中酵母生長、乙醇生成、總糖消耗的規(guī)律，為實(shí)現(xiàn)甘蔗糖蜜和甘蔗汁高濃度乙醇發(fā)酵生產(chǎn)提供試驗(yàn)研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

釀酒酵母GJ2008（Saccharomycescerevisiae，廣西科技大學(xué)發(fā)酵工程研究所保藏，適用于蔗糖高濃度乙醇發(fā)酵）。

1.1.2 培養(yǎng)基

一（二）級種子培養(yǎng)基：葡萄糖20（40）g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，pH自然。

蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖260 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，pH自然。

以上培養(yǎng)基均使用高壓蒸汽115 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑與原料

葡萄糖、果糖（AR級，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；蔗糖、硫酸（西隴科學(xué)股份有限公司）；乙腈、乙醇（安徽時(shí)聯(lián)特種溶劑有限公司）；酵母粉、蛋白胨（BR級，廣東環(huán)凱微生物科技公司）；蔗糖（市售）。

1.1.4 儀器與設(shè)備

HITACHI高效液相色譜分析儀、HIMAC大容量冷凍離心機(jī)（日本株式會社日立制作所）；BIOTECH-5BG×5-9400五聯(lián)5 L發(fā)酵罐（上海保興生物設(shè)備公司）；LDZH-100KBS立式壓力滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；BX43生物顯微鏡（奧林巴斯有限公司）；ZWYR-C2402觸控二疊加搖床（上海智誠分析儀器制造有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子培養(yǎng)方法

將實(shí)驗(yàn)室保存的釀酒酵母GJ2008菌種斜面接一環(huán)至一級種子培養(yǎng)基（50 mL三角瓶裝液量30 mL）中，按150 r/min搖床32 ℃培養(yǎng)12 h，取菌液離心去上清，用無菌水稀釋成10倍濃縮菌懸液。將一級種子濃縮菌懸液接至二級種子培養(yǎng)基（500 mL三角瓶裝液量300 mL）中，按150 r/min搖床32 ℃培養(yǎng)8 h后離心去上清，用無菌水稀釋菌泥成10倍濃縮菌懸液。

1.2.2 發(fā)酵方法

將二級種子濃縮菌懸液接至5 L發(fā)酵罐（3 L裝液量）發(fā)酵培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)速150 r/min，發(fā)酵溫度32 ℃，微通氧80 mL/min。

1.3 檢測分析方法

酵母細(xì)胞數(shù)的測定采用血球計(jì)數(shù)板法。

液相色譜檢測糖條件：流動(dòng)相為V乙腈∶V超純水=75∶25（色譜純），流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，柱溫30 ℃，示差折光檢測器溫度35 ℃。

液相色譜檢測乙醇條件：流動(dòng)相采用5 mmol/L硫酸溶液，流速0.6 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，柱溫35 ℃；示差折光檢測器溫度40 ℃。所有上機(jī)樣品均經(jīng)超純水稀釋至合適倍數(shù)經(jīng)0.45 μm濾膜過濾至進(jìn)樣瓶中。

1.4 計(jì)算公式

式中：葡萄糖或果糖減少量=前次取樣葡萄糖或果糖實(shí)測值+取樣間隔時(shí)間內(nèi)蔗糖水解增加的葡萄糖或果糖的量-當(dāng)時(shí)取樣葡萄糖或果糖實(shí)測值

2 結(jié)果與分析

2.1 高濃度蔗糖乙醇分批發(fā)酵過程曲線

從0 h開始每隔3 h從5 L發(fā)酵罐中取發(fā)酵液樣品測定蔗糖、果糖、葡萄糖、乙醇濃度以及酵母細(xì)胞數(shù)，繪制260 g/L蔗糖乙醇分批發(fā)酵過程曲線見圖1。

圖1 260 g/L蔗糖乙醇分批發(fā)酵過程曲線

蔗糖乙醇發(fā)酵過程，蔗糖快速水解產(chǎn)生葡萄糖和果糖，酵母細(xì)胞利用葡萄糖和果糖進(jìn)行生長繁殖和無氧代謝生成乙醇，總糖消耗的實(shí)質(zhì)是葡萄糖和果糖消耗。圖1中殘葡萄糖和殘果糖先升高后降低，是由葡萄糖和果糖的蔗糖水解生成量與同期消耗量的多少決定。葡萄糖和果糖生成量大于消耗量則表現(xiàn)為殘?zhí)橇可?，反之降低。發(fā)酵0～15 h酵母快速生長，同期蔗糖快速水解；發(fā)酵6～30 h總糖大量消耗，同期乙醇大量生成；發(fā)酵至30 h，殘葡萄糖量已很低，但殘果糖量相對較高。要更深入探究蔗糖水解、葡萄糖和果糖消耗、酵母生長、乙醇生成的規(guī)律及總糖消耗、酵母生長和乙醇生成的相互關(guān)系，需要進(jìn)一步分析和討論。

2.2 高濃度蔗糖乙醇分批發(fā)酵酵母生長規(guī)律

依據(jù)圖1作圖數(shù)據(jù)計(jì)算發(fā)酵過程不同時(shí)間段的酵母生長速率，結(jié)合酵母生長曲線，得到圖2。

結(jié)合圖2的生長速率，260 g/L蔗糖乙醇分批發(fā)酵過程的酵母生長曲線可分為快速生長期（0～15 h）和穩(wěn)定期（15～39 h，27 h后酵母細(xì)胞數(shù)略有下降）。從0 h的細(xì)胞濃度（1.4×107個(gè)/mL）和0～3 h的酵母生長速率（1.23×107CFU/（mL·h））可知，0～3 h細(xì)胞生長較快，這主要與所接種的二級種子處于快速生長后期，酵母細(xì)胞繁殖能力強(qiáng)有關(guān)。細(xì)胞在6～9 h達(dá)到最大生長速率5.27×107CFU/（mL·h），發(fā)酵過程細(xì)胞濃度最大值為4.23×108CFU/mL，明顯比常規(guī)酒精厭氧發(fā)酵細(xì)胞數(shù)（1.2×108～1.5×108CFU/mL）高，這主要與試驗(yàn)采用微通氧（通風(fēng)量80 mL/min）發(fā)酵技術(shù)有關(guān)。高濃度乙醇發(fā)酵過程連續(xù)或間歇微通氧，可使酵母細(xì)胞產(chǎn)生更多的能量，細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)得以合成和更新，大幅提高酵母濃度，細(xì)胞活力得以維持，增強(qiáng)酵母生產(chǎn)乙醇的能力，明顯縮短發(fā)酵時(shí)間。

圖2 260 g/L蔗糖乙醇分批發(fā)酵過程酵母生長曲線及其生長速率圖

2.3 高濃度蔗糖乙醇分批發(fā)酵乙醇生成規(guī)律

依據(jù)圖1作圖數(shù)據(jù)計(jì)算發(fā)酵過程不同時(shí)間段的乙醇生成速率，結(jié)合乙醇生成曲線，得到圖3。

由圖3可知，260 g/L蔗糖乙醇分批發(fā)酵過程中6～30 h是乙醇生成主要階段（對發(fā)酵終了生成的乙醇量占比92.69%），6～15 h乙醇加速生成（占比59.16%），15～30 h乙醇降速生成（占比37.28%），12～15 h乙醇生成速率最大達(dá)到6.7 g/（L·h）。此外，0～3 h和36～39 h的乙醇生成量很少（占比0.25%和0.1%），3～6 h和30～36 h共9 h的乙醇生成量較少（占比6.96%）。結(jié)合2.2的酵母生長規(guī)律分析，得知高濃度蔗糖乙醇分批發(fā)酵過程乙醇生成與酵母生長偶聯(lián)，而且相當(dāng)一部分的總糖需要在酵母生長穩(wěn)定期轉(zhuǎn)化為乙醇。

圖3 260 g/L蔗糖乙醇分批發(fā)酵過程乙醇生成曲線及其速率圖

2.4 高濃度蔗糖乙醇分批發(fā)酵蔗糖水解、果糖和葡萄糖消耗規(guī)律

依據(jù)圖1殘蔗糖、殘果糖和殘葡萄糖數(shù)據(jù)，計(jì)算并繪制發(fā)酵過程蔗糖水解、果糖和葡萄糖消耗曲線和不同時(shí)間段的蔗糖水解、果糖和葡萄糖消耗速率得到圖4和圖5。將發(fā)酵過程分為四個(gè)區(qū)間進(jìn)行蔗糖水解、葡萄糖和果糖消耗對比，結(jié)果如表1。

表1 糖類物質(zhì)區(qū)間變化表

圖4 蔗糖水解、果糖和葡萄糖消耗曲線圖

圖5 蔗糖水解、果糖和葡萄糖消耗速率圖

綜合表1和圖4、圖5進(jìn)行分析可知，蔗糖水解主要集中在發(fā)酵0～15 h（占比92.29%），說明酵母在快速生長期大量釋放蔗糖水解酶。期間0～3 h蔗糖水解較多（占比22.58%），水解速率（18.65 g/（L·h））較高，這是由于接種的二級種子細(xì)胞不僅繁殖能力強(qiáng)，而且成熟的酵母細(xì)胞能夠迅速釋放蔗糖水解酶到胞外水解蔗糖生成葡萄糖和果糖。葡萄糖消耗主要集中在3～27 h（占比91.43%），同期果糖消耗占比為77.37%，果糖消耗同比低14.06%，并且葡萄糖平均消耗速率（4.61 g/（L·h））大于果糖平均消耗速率（3.53 g/（L·h））。發(fā)酵終了殘葡萄糖只有1.46 g/L，而殘果糖13.49 g/L。結(jié)果表明，高濃度蔗糖乙醇發(fā)酵過程，酵母細(xì)胞對葡萄糖的消耗大于對果糖的消耗。有關(guān)果糖利用不徹底的原因分析，與發(fā)酵條件中葡萄糖濃度[19]、乙醇[3]、溫度[4]等的影響有關(guān)。更與酵母細(xì)胞己糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)對葡萄糖和果糖的親和力不同相關(guān)，這是造成發(fā)酵過程中葡萄糖消耗速率高于果糖消耗速率的重要原因[20]。發(fā)酵后期如何提高果糖消耗，降低殘果糖量，值得進(jìn)一步深入研究。

2.5 高濃度蔗糖乙醇分批發(fā)酵過程酵母生長、總糖消耗、乙醇生成的關(guān)系分析

依據(jù)圖4果糖和葡萄糖消耗數(shù)據(jù)和圖1中酵母生長、乙醇生成數(shù)據(jù)計(jì)算并繪制圖6和圖7。

糖醇轉(zhuǎn)化率是生成的乙醇對所消耗的總糖（葡萄糖+果糖）的百分比，理論值為51.1%，實(shí)際糖醇轉(zhuǎn)化率越高，說明消耗的總糖轉(zhuǎn)化為乙醇越多。酵母細(xì)胞消耗的總糖用于菌體生長、維持菌體生命活動(dòng)、代謝產(chǎn)生乙醇、CO2及高級醇等產(chǎn)物，因此，發(fā)酵全過程的實(shí)際糖醇轉(zhuǎn)化率（48%）要低于理論值，但不同發(fā)酵時(shí)間段的糖醇轉(zhuǎn)化率會有所不同。試驗(yàn)檢測的是酵母細(xì)胞外發(fā)酵液中的殘葡萄糖、殘果糖濃度和乙醇濃度，細(xì)胞外的葡萄糖和果糖進(jìn)入細(xì)胞經(jīng)無氧代謝轉(zhuǎn)化成乙醇和乙醇排出到細(xì)胞外需要一定時(shí)間。分析圖6和圖7，結(jié)合前面的酵母生長、乙醇生成和蔗糖水解、葡萄糖與果糖消耗規(guī)律分析可知，260 g/L蔗糖乙醇分批發(fā)酵0 h-6 h糖醇轉(zhuǎn)化率尚低（21.8%），耗糖主要用于細(xì)胞快速生長，合成并釋放蔗糖水解酶到細(xì)胞外快速水解蔗糖；發(fā)酵6～30 h是乙醇生成的主要階段，糖醇轉(zhuǎn)化率高（46.72%），12～15 h的糖醇轉(zhuǎn)化率最高（63.36%），15～21 h的糖醇轉(zhuǎn)化率超過50%；發(fā)酵30～39 h的糖醇轉(zhuǎn)化率從37.0%較快降低到14.59%，這9 h的糖醇轉(zhuǎn)化率偏低（30.53%）。全發(fā)酵過程酵母消耗總糖252.36 g/L，產(chǎn)生乙醇111.17 g/L，糖醇轉(zhuǎn)化率為44%。發(fā)酵后期糖醇轉(zhuǎn)化率偏低，是導(dǎo)致全發(fā)酵過程糖醇轉(zhuǎn)化率偏低的重要原因。

圖6 260 g/L蔗糖乙醇分批發(fā)酵過程酵母生長、乙醇生成、總糖消耗折線圖

圖7 260 g/L蔗糖乙醇分批發(fā)酵過程酵母生長、乙醇生成、總糖消耗速率圖

2.6 高濃度蔗糖乙醇分批發(fā)酵發(fā)酵效果分析

將圖1數(shù)據(jù)按照1.4中公式處理并計(jì)算得到表2。

總糖發(fā)酵效率反映糖醇轉(zhuǎn)化實(shí)際值對理論值的百分比，是評價(jià)乙醇發(fā)酵效果的重要指標(biāo)，與發(fā)酵終了的乙醇濃度和殘總糖濃度密切相關(guān)?？偺菨舛纫欢〞r(shí)，發(fā)酵得到的乙醇濃度越高、殘總糖越低，總糖發(fā)酵效率就越高，發(fā)酵效果就更好。由表2可知，蔗糖水解率（98.89%）和葡萄糖利用率（98.91%）很高，葡萄糖利用率比果糖利用率（89.92%）高出8.99%；總糖發(fā)酵效率（80.5%）偏低（未達(dá)到90%），這主要與耗糖發(fā)酵效率（86.19%）偏低（未達(dá)到92%～95%）、總糖利用率（93.39%）偏低（未達(dá)到98%）和乙醇質(zhì)量濃度（111.1 g/L）偏低（未達(dá)到125 g/L）有關(guān)。殘總糖（17.86 g/L）偏高（大于5 g/L），主要是殘果糖（13.49 g/L）偏高（占?xì)埧偺堑?5.5%），其次是殘蔗糖（2.89 g/L，相當(dāng)總糖3.03g/L，占比17%），會導(dǎo)致總糖利用率偏低。我們正在研究高濃度蔗糖乙醇分批發(fā)酵過程釀酒酵母細(xì)胞活性（細(xì)胞數(shù)及存活率）和發(fā)酵活力（耗糖能力和乙醇生成能力）及其提高策略，努力提高發(fā)酵終了乙醇濃度和糖醇轉(zhuǎn)化率。

表2 260 g/L蔗糖乙醇分批發(fā)酵結(jié)果

3 結(jié)論

開展260 g/L蔗糖乙醇5 L罐分批發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果表明，酵母生長分為快速生長期（0～15 h）和穩(wěn)定期（15～39 h）；蔗糖快速水解主要集中在0～15 h，從15 h緩慢水解到27 h停止水解；葡萄糖消耗主要集中在3～27 h，整個(gè)發(fā)酵過程葡萄糖利用率（98.91%）比果糖利用率（89.92%）高8.99%，發(fā)酵終了殘葡萄糖（1.46 g/L）少而殘果糖（13.49 g/L）較多；發(fā)酵6～30 h是乙醇生成（占比92.69%）主要階段，糖醇轉(zhuǎn)化率高（46.72%），而發(fā)酵后期（30～39 h）糖醇轉(zhuǎn)化率（30.53%）偏低，是導(dǎo)致全發(fā)酵過程糖醇轉(zhuǎn)化率（44%）偏低的重要原因。因此，高濃度蔗糖乙醇分批發(fā)酵要提高發(fā)酵效率，一要設(shè)法提高果糖利用率，降低殘果糖濃度，二要設(shè)法提高發(fā)酵后期糖醇轉(zhuǎn)化率。