核桃青皮中多酚類物質(zhì)的分離純化及其抗氧化性

李曉華

新疆石河子職業(yè)技術(shù)學(xué)院（石河子 832000）

核桃青皮，也稱青龍衣，是包裹在核桃外部的一層綠色果皮，是核桃的主要副產(chǎn)品之一，作為中藥材、保健品成分、食品添加劑使用[1]。核桃青皮含有鉀、鈣、鎂、鐵等多種礦質(zhì)元素，并呈現(xiàn)高鉀低鈉的特點(diǎn)，含有多種揮發(fā)油和脂肪酸，具有防止血管硬化、預(yù)防高血壓和冠心病、抵御衰老和血管結(jié)石等保健功效，醫(yī)學(xué)上將其應(yīng)用于抗腫瘤、抗菌的臨床應(yīng)用[2-3]。由于核桃青皮的醫(yī)療保健功效優(yōu)異，市場(chǎng)上處于供不應(yīng)求的狀態(tài)，如何更加有效地提取核桃青皮中有用成分尚有待研究。

試驗(yàn)旨在提取純度較高的青皮多酚類物質(zhì)，通過大孔樹脂與分離純化方式的有效結(jié)合達(dá)到試驗(yàn)?zāi)康?，并在此基礎(chǔ)上研究分析青皮多酚的抗氧化性。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

青皮核桃（阿克蘇溫宿縣）；大孔樹脂（杭州鑫膜實(shí)業(yè)有限公司）；無水乙醇（成都化夏化學(xué)試劑有限公司）；甲苯（蘇州誠(chéng)享化學(xué)材料有限公司）；碳酸氫鈉（濟(jì)南坤豐化工有限公司）。

BSD-YX3600型立式搖床培養(yǎng)箱（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；LC210型高效液相色譜儀（上海儀電分析儀器有限公司）；PGZ-978型離心機(jī)（蘇州優(yōu)格曼機(jī)械有限公司）；UV-2204型紫外可見分光光度計(jì)（上海析譜儀器有限公司）。

1.2 大孔樹脂的粗提取[4-5]

將極性大孔樹脂用無水乙醇浸泡至充分溶脹，用蒸餾水洗滌溶脹大孔樹脂至沒有乙醇?xì)馕稌r(shí)停止。

稱取一定量干燥核桃青皮，反復(fù)幾次研碎、烘干操作，以過0.150 mm篩青皮干燥粉末為標(biāo)準(zhǔn)。向青皮粉末中倒入足量甲苯，塞緊塞子后置于搖床培養(yǎng)箱中，設(shè)置環(huán)境溫度35 ℃，頻率30次/min。12 h后取出，少量多次淋洗大孔樹脂緩慢吸附，至大孔樹脂滴落尾液呈淡綠色或無色時(shí)停止，用高效液相色譜儀測(cè)定吸附提取液中多酚類物質(zhì)的含量。

1.3 青皮多酚的純化[6]

大孔樹脂吸附的成分中除了多酚以外，還有大量的色素和脂肪酸，為進(jìn)一步提高提取純度，需對(duì)洗脫液進(jìn)行再次純化。將吸附飽和的大孔樹脂濕法裝入層析柱中，無水乙醇作為洗脫液以1.0 mL/min的洗脫流速進(jìn)行洗脫。洗脫液收集于錐形瓶中，緩慢滴加5%NaHCO3溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）至溶液約pH 6.50，離心分離沉淀物，取上清液備用。將上清液置于-20 ℃的恒溫冰箱中3 d，取出后迅速分離結(jié)晶物與上清液，重復(fù)3次冷凍分離結(jié)晶物操作后的清液即為純度較高的青皮多酚溶液。

1.4 抗氧化能力測(cè)定方法

1.4.1 抗氧化性

采用硫氰酸鐵比色法進(jìn)行測(cè)定[7]。取500 mg吐溫-20和青皮多酚樣品加磷酸鉀緩沖液定容至100 mL制備青皮多酚乳濁液，以青皮多酚標(biāo)準(zhǔn)品與磷酸鉀緩沖液配制的混合液為空白對(duì)照。在一定溫度下避光培養(yǎng)7 d后采用硫氰酸鹽法測(cè)定其氧化程度，于波長(zhǎng)520 nm處測(cè)其吸光度。

1.4.2 還原性

采用鐵氰酸鉀還原法測(cè)定青皮多酚的還原能力。在1.0 mL樣品溶液中滴入磷酸鹽緩沖液和鐵氰化鉀溶液，在70 ℃水浴條件下加熱30 min，加入少量的三氯乙酸溶液后靜置至室溫，補(bǔ)加去離子水和氯化鐵溶液，靜置一段時(shí)間后于710 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。設(shè)置空白管為對(duì)照并調(diào)零，測(cè)定的吸光度越大則青皮多酚還原能力越強(qiáng)。

1.5 試驗(yàn)中的其他分析測(cè)試

1.5.1 高效液相色譜分析

流動(dòng)相選用無水乙醇-水體系，流動(dòng)相比例3∶1。設(shè)置進(jìn)樣量10 μL，流速0.5 mL/min，分離時(shí)間45 min，檢測(cè)波長(zhǎng)356 nm，AUFs=0.02，柱溫30 ℃，色譜柱型號(hào)采用安捷倫Eclipse Plus C18（6.5 mm×300 mm）。

1.5.2 紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定吸光度

取青皮多酚標(biāo)準(zhǔn)品，梯度配制成不同濃度的青皮多酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次測(cè)定其吸光度后，繪制濃度-吸光度擬合曲線，擬合度需大于99%。對(duì)試驗(yàn)提取的不同濃度青皮多酚純化液進(jìn)行吸光度測(cè)定，并與擬合曲線比對(duì)，確定測(cè)定的準(zhǔn)確度，準(zhǔn)確度精度±5%。

2 結(jié)果與討論

2.1 青皮多酚的液相色譜分析

圖1為試驗(yàn)中大孔樹脂吸附的青皮多酚液相色譜圖，圖2為分離結(jié)晶物后的青皮多酚液相色譜圖?？梢钥闯觯瑘D1中的物質(zhì)組成成分復(fù)雜，有效的青皮多酚含量占比不超過50%，不具備過多的應(yīng)用價(jià)值，應(yīng)進(jìn)行合適的純化處理提高青皮多酚的含量。圖2則可以很明顯發(fā)現(xiàn)出峰的保留時(shí)間集中在20～30 min，此區(qū)間內(nèi)的物質(zhì)含量總和超過80%，且與青皮多酚純品的保留時(shí)間基本一致，判定此區(qū)間內(nèi)的物質(zhì)成分為青皮多酚類物質(zhì)（綠原酸、阿魏酸、芥子酸、兒茶素、楊梅酮、胡桃醌等），同時(shí)說明分離純化的試驗(yàn)效果頗佳，達(dá)到純化要求。

圖1 大孔樹脂吸附的粗提取青皮多酚液相色譜圖

圖2 青皮多酚分離純化后的液相色譜圖

2.2 淋洗流速對(duì)大孔樹脂吸附性能的影響

不同淋洗流速條件下大孔樹脂吸附量的變化曲線如圖3所示。從總體趨勢(shì)上可以看出，淋洗流速小于3.0 mL/min時(shí)，大孔樹脂的最終吸附量比較可觀，吸附性能良好，基本符合試驗(yàn)實(shí)際要求且工作效率較高。足夠的吸附量能夠提升分離純化的試驗(yàn)效果，對(duì)于后續(xù)試驗(yàn)結(jié)果分析有益?？紤]到試驗(yàn)總時(shí)長(zhǎng)和分離的多酚含量，確定淋洗流速以2.0 mL/min為宜。

圖3 淋洗流速與大孔樹脂吸附量的關(guān)系曲線

2.3 pH對(duì)純化過程中離心沉淀物的影響

青皮多酚中的糖類物質(zhì)在弱酸性條件下易與脂肪酸結(jié)合后沉降，生成酸性沉降物。青皮多酚為多元酚結(jié)構(gòu)，在弱酸性條件下能保持完好的分子狀態(tài)，而堿性條件下會(huì)促進(jìn)鹽結(jié)構(gòu)的形成，破壞青皮多酚的活性。因而選擇弱酸性的條件有利于青皮多酚的純化。圖4為pH與離心沉淀物質(zhì)量的關(guān)系曲線，過酸或過堿的環(huán)境下均能產(chǎn)生較多的沉淀物，青皮多酚在酸性較強(qiáng)的環(huán)境下結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，可能會(huì)與其他堿性有機(jī)物相結(jié)合，在堿性條件下則會(huì)生成鹽結(jié)晶。綜合考慮試驗(yàn)情況，確定純化時(shí)的pH 6.50。

圖4 pH與沉淀物質(zhì)量的關(guān)系曲線

2.4 青皮多酚的抗氧化性分析

2.4.1 抗氧化性和還原性

青皮多酚在一定條件下氧化可產(chǎn)生有機(jī)氧化物，這些氧化物能夠?qū)e2+氧化成Fe3+。通過測(cè)定Fe3+與SCN—形成絡(luò)合物的吸光度可表征青皮多酚的自氧化能力，如圖5所示。

圖5 青皮多酚的抗氧化性測(cè)試曲線

隨著時(shí)間延長(zhǎng)，吸光度增大。這表示隨著時(shí)間延長(zhǎng)，青皮多酚的自氧化物濃度增大，氧化程度加重，所以一般情況下青皮多酚溶液應(yīng)在低溫下貯存以防止其氧化而失去生物活性。

以吸光度評(píng)價(jià)還原性是表征有機(jī)物抗氧化能力的其中一項(xiàng)指標(biāo)[9]。圖6為青皮多酚對(duì)Fe3+還原能力的關(guān)系曲線?？梢钥闯?，還原Fe3+的能力與青皮多酚濃度呈正相關(guān)，符合理論實(shí)際的同時(shí)，說明青皮多酚的抗氧化能力有限，易受到氧化物的影響。

圖6 青皮多酚的還原性測(cè)試曲線

2.4.2 青皮多酚的質(zhì)量濃度-吸光度曲線

試驗(yàn)純化的青皮多酚經(jīng)紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)在625 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰。根據(jù)稀釋后不同質(zhì)量濃度青皮多酚所測(cè)定的吸光度A，可繪制出質(zhì)量濃度-吸光度擬合曲線。如圖7所示，在一定的濃度范圍內(nèi)，濃度與吸光度之間呈線性關(guān)系，即青皮多酚質(zhì)量濃度的增大對(duì)應(yīng)相應(yīng)吸光度亦會(huì)增大，青皮多酚的質(zhì)量濃度與其吸光度呈正比，又因質(zhì)量濃度與其抗氧化性呈正比，進(jìn)而推出青皮多酚的抗氧化性與吸光度呈正比。

圖7 青皮多酚的質(zhì)量濃度-吸光度擬合曲線

3 結(jié)論

以青皮核桃為原料，對(duì)粗碎烘干的核桃青皮溶解液采用大孔樹脂初次提取，洗脫大孔樹脂吸附液后，離心分離沉淀物和多次低溫結(jié)晶純化所得青皮多酚類物質(zhì)上清液。對(duì)影響初提取的淋洗流速因素和影響純化過程的pH因素進(jìn)行探討分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低淋洗流速有助于獲得足夠的青皮多酚提取液，確定淋洗流速2.0 mL/min適宜，而pH的過酸或過堿環(huán)境下產(chǎn)生較多的沉淀物會(huì)影響實(shí)際提取到的青皮多酚含量，經(jīng)過綜合考慮確定pH 6.50。用高效液相色譜測(cè)定提取液中的青皮多酚含量，將粗提取液與純化液對(duì)比之后發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)的純化過程比較有效，能夠?qū)⑶嗥ざ喾宇愇镔|(zhì)純度提升至80%以上。試驗(yàn)還對(duì)青皮多酚的抗氧化性在抗氧化和還原性2個(gè)方面進(jìn)行探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)青皮多酚的自氧化物會(huì)隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增多，體現(xiàn)為所測(cè)得的吸光度增大。同時(shí)，還原性測(cè)定顯示青皮多酚的抗氧化能力有限，正常情況下需低溫條件下貯存以防止自氧化。試驗(yàn)分離純化青皮多酚的試驗(yàn)過程效果良好，并能在一定程度上論證青皮多酚的弱抗氧化能力。