植物乳桿菌+菊粉合生元緩解DSS 誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的研究

張 楨，高擎燏，崔雷鴻，朱曉峰，朱崇淼*，杭蘇琴*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，國家動物消化道營養(yǎng)國際聯(lián)合研究中心，江蘇省消化道營養(yǎng)與動物健康重點(diǎn)實驗室，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)消化道微生物研究室，江蘇南京 210095；2.南京致潤生物科技有限公司，江蘇南京 211200）

癥性腸病（Inflammatory Bowel Diseases，IBD）主要包括潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative Colitis，UC）和克羅恩病（Crohn's Disease，CD），其中UC 引起病變處黏膜充血、潰爛，臨床表現(xiàn)為腹瀉和血便[1]?？股刂委烾C 易出現(xiàn)耐藥性，長期服用抗生素可能增加CD 的患病概率[2]。因此，安全無副作用的微生態(tài)制劑受到極大關(guān)注。微生態(tài)制劑主要包括益生菌、益生元和合生元，其中益生菌能調(diào)節(jié)腸道菌群，而益生元可為益生菌提供營養(yǎng)底物[3]。研究表明，益生菌與益生元組合成的合生元能促進(jìn)腸道微生態(tài)平衡[4]，如嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌與菊粉組成的合生元能有效緩解小鼠結(jié)腸炎癥，并提高腸道有益菌屬比例[5-6]，但不同微生態(tài)制劑治療UC的效果有很大差異[7]。因此，有必要通過動物試驗對微生態(tài)制劑的療效進(jìn)行驗證。

本實驗室前期體外研究表明，植物乳桿菌L47+菊粉組合能夠提高體外模擬豬結(jié)腸發(fā)酵環(huán)境中有益菌屬的比例和短鏈脂肪酸的水平[8]，因此推測該組合可能有緩解UC 的作用。葡聚糖硫酸鈉（Dextran Sulfate Sodium，DSS）誘導(dǎo)的結(jié)腸炎是國際公認(rèn)并被廣泛應(yīng)用的實驗性UC 動物模型，其病理改變和人體結(jié)腸炎臨床癥狀及其相似。因此，本研究利用DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠探究植物乳桿菌L47+菊粉合生元對結(jié)腸炎的作用，為其將來應(yīng)用于生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及預(yù)處理 32 只體重（39.79±0.23）g 的8 周齡雄性ICR 小鼠購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場。菊粉的純度≥90%，聚合度為32～34；DSS 的分子量為40 000。菊粉和DSS 均購自青島源葉生物有限公司。植物乳桿菌L47+菊粉合生元制備：將實驗室自行分離保存于-20℃的植物乳桿菌菌株接種于MRS 培養(yǎng)基中，37℃?zhèn)鞔? 次后于6 000 r/min 離心15 min，收集菌體并重懸至含2%菊粉的無菌水中（109CFU/mL），用于后續(xù)小鼠灌胃。

1.2 試驗設(shè)計 本試驗在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院動物房進(jìn)行，將32 只小鼠隨機(jī)分為對照組、DSS 組、合生元組及合生元+DSS 組，每組8 只，飼喂基礎(chǔ)飼料，自由飲水，適應(yīng)期7 d 后開始正式試驗。對照組和DSS組小鼠每日灌胃200 μL 生理鹽水，合生元組與合生元+DSS 組小鼠每日灌胃200 μL 合生元溶液；第15 天開始在DSS 組與SD 組小鼠飲水中添加3% DSS（w/v），第21 天，小鼠禁食6 h 后斷頸處死，采集血液、結(jié)腸組織以及結(jié)腸食糜等樣品，用于指標(biāo)測定和分析。

1.3 生長性能及組織器官測定

1.3.1 生長性能 每日16:00 對小鼠稱重，記錄給料量和剩料量，計算每日采食量。

1.3.2 結(jié)腸長度和重量 處死小鼠后，剪取從盲腸末端至肛門整段結(jié)腸腸段，測定長度并稱重，做好記錄。

1.3.3 脾臟重量 處死小鼠后，剪取脾臟，稱重并記錄。

1.4 小鼠結(jié)腸組織學(xué)形態(tài)評分 剪取小鼠結(jié)腸腸段約0.5 cm，用生理鹽水清洗干凈，于4%多聚甲醛中固定，72 h 內(nèi)進(jìn)行包埋以及石蠟切片[9]。對固定的結(jié)腸腸段進(jìn)行常規(guī)HE 染色（武漢塞維爾公司），于正置顯微鏡下對結(jié)腸狀態(tài)觀察和評分，評分標(biāo)準(zhǔn)[10-11]如表1 所示。

表1 小鼠結(jié)腸形態(tài)組織學(xué)評分

1.5 小鼠結(jié)腸菌群的定量分析和代謝產(chǎn)物測定

1.5.1 結(jié)腸菌群的定量分析 使用實時熒光定量PCR 絕對定量結(jié)腸食糜微生物中總菌、乳酸桿菌和大腸桿菌的數(shù)量，所用微生物的引物序列如表2 所示（上海凌恩生物有限公司），反應(yīng)條件和反應(yīng)體系嚴(yán)格按照說明書操作。

表2 菌群熒光定量PCR 和TLR4 基因引物序列

1.5.2 微生物代謝產(chǎn)物SCFA 的測定 參照秦為琳[12]的方法使用氣相色譜（Shimadzu GC-2014，日本）檢測樣品中短鏈脂肪酸（Short Chain Fatty Acid，SCFA）濃度。

1.6 小鼠結(jié)腸組織TLR4 及血清中炎癥因子含量的測定

1.6.1 TLR4 基因表達(dá)的測定TLR4基因和持家基因引物序列如表2 所示，反應(yīng)條件和反應(yīng)體系嚴(yán)格按照公司提供的說明書進(jìn)行。每個樣本重復(fù)測定3 次，取CT 的平均值，根據(jù)公式2-ΔΔCT計算各基因的相對表達(dá)量。

1.6.2 血清炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的測定 采屠宰前眼眶靜脈血，室溫靜置4 h，3000 r/min 離心15 min，取上層血清，分裝至1.5 mL 離心管中，-20℃冰箱保存。嚴(yán)格按照試劑盒（南京奧青生物有限公司）說明書測定血清中IL-6、IL-8、IL-1β及TNF-α含量。

1.7 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS 24.0 的單因素方差分析（One-Way ANOVA）比較差異顯著性。采用GraphPad prism 8.0.2 軟件作圖。P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 合生元對小鼠生長性能的影響 如圖1 所示，與對照組相比，DSS 組小鼠體重和采食量均降低（P＜0.05），體重下降率超過7%，采食量下降超過2 g/d；與DSS組相比，合生元+DSS 組小鼠的體重和采食量均升高（P＜0.05）。

圖1 合生元對小鼠生長性能的影響

如表3 所示，與對照組和合生元組相比，DSS 組、合生元+DSS 組小鼠結(jié)腸長度均縮短（P＜0.05），而合生元+DSS 組小鼠結(jié)腸長度較DSS 組增加（P＜0.05）；結(jié)腸重量各組之間差異不顯著；相較于對照組，DSS組小鼠脾臟平均重量增加了0.12 g（P＜0.05），合生元組、合生元+DSS 組小鼠脾臟重量較DSS 組均下降（P＜0.05）。

表3 合生元對小鼠結(jié)腸長度、結(jié)腸和脾臟重量的影響

2.2 合生元對小鼠結(jié)腸組織學(xué)形態(tài)的影響 由圖2 可知，對照組與合生元組小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞絨毛發(fā)育較好，隱窩和腺體正常，未發(fā)生炎癥細(xì)胞浸潤；與對照組相比，DSS 組小鼠結(jié)腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，杯狀細(xì)胞壞死，隱窩消失；與DSS 組相比，合生元+DSS 組小鼠結(jié)腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)的受損狀況得到緩解，可見少量炎癥細(xì)胞浸潤，黏膜組織結(jié)構(gòu)相對完整。

圖2 合生元對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜組織形態(tài)的影響

如表4 所示，對照組與合生元組小鼠平均結(jié)腸組織學(xué)評分分別為0.2 和0.1，均未出現(xiàn)明顯組織學(xué)損傷，DSS 組小鼠組織學(xué)評分升高到3.3（P＜0.05），表明DSS 組小鼠結(jié)腸組織受到嚴(yán)重?fù)p傷；與DSS 組相比，合生元+DSS 組小鼠結(jié)腸組織學(xué)評分下降至2.1（P＜0.05）。

表4 合生元對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織形態(tài)組織學(xué)評分的影響

2.3 合生元對小鼠結(jié)腸食糜菌群和代謝產(chǎn)物的影響 由表5 可見，各組小鼠結(jié)腸總菌數(shù)量無顯著差異；與對照組相比，DSS 組小鼠結(jié)腸乳酸桿菌數(shù)量降低（P＜0.05），大腸桿菌數(shù)量增加（P＜0.05）；與DSS 組相比，合生元+DSS 組小鼠結(jié)腸乳酸桿菌數(shù)量有所提升（P＞0.05），大腸桿菌數(shù)量降低（P＜0.05）。

表5 合生元對小鼠結(jié)腸菌群和短鏈脂肪酸的影響

與對照組相比，DSS 組小鼠結(jié)腸食糜中丁酸以及總短鏈脂肪酸濃度下降（P＜0.05）；與DSS 組相比，合生元+DSS 組小鼠結(jié)腸食糜的乙酸、丁酸以及總短鏈脂肪酸濃度上升（P＜0.05）。

2.3 合生元對小鼠結(jié)腸組織TLR4基因表達(dá)及血清炎癥因子的影響 由表6 可知，經(jīng)DSS 刺激后，DSS 組小鼠結(jié)腸組織中TLR4基因的相對表達(dá)量較對照組顯著升高；與DSS 組相比，合生元+DSS 組小鼠結(jié)腸組織中TLR4基因的相對表達(dá)量顯著下降。與對照組相比，DSS 組小鼠血清中IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α含量均顯著增加；與DSS 組相比，合生元+DSS 組的IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α含量均顯著下降。

表6 合生元對小鼠結(jié)腸組織TLR4 基因表達(dá)量和血清炎癥因子含量的影響

3 討 論

Kim 等[17]指出，無論使用抗生素還是其他藥物，對結(jié)腸炎小鼠的影響首先會反映在小鼠的體重、采食量上，因此本研究首先關(guān)注小鼠體重和采食量的變化。本研究結(jié)果顯示，DSS 組小鼠體重下降率達(dá)7%，而合生元+DSS 組小鼠體重下降率為4.5%左右，且采食量較DSS 組提高近1 g/d，這表明植物乳桿菌L47+菊粉能夠緩解DSS 所引起的體重與采食量降低。而且植物乳桿菌L47+菊粉能顯著改善DSS 所導(dǎo)致的結(jié)腸縮短。賀慶芝等[18]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸長度與結(jié)腸炎嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，這可能是因為結(jié)腸炎引起的結(jié)腸充血和病變而導(dǎo)致結(jié)腸縮短。相比于對照組，DSS 處理顯著提高了脾臟重量。脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，可能與DSS 激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，從而導(dǎo)致脾臟功能活躍和其重量增加[19]，而植物乳桿菌L47+菊粉則緩解了這一癥狀。此外，小鼠結(jié)腸組織切片結(jié)果顯示，SD 組結(jié)腸組織學(xué)評分顯著低于DSS 組，這表明植物乳桿菌L47+菊粉對DSS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸黏膜損傷具有保護(hù)作用。Yang 等[20]研究表明，植物乳桿菌能夠顯著改善Escherichia coli K88攻毒造成小腸絨毛高度縮短、隱窩深度增加等腸黏膜損傷的問題，這也本研究結(jié)果一致。

結(jié)腸炎可導(dǎo)致腸道菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)。本研究菌群定量結(jié)果顯示，與對照組相比，DSS 組結(jié)腸乳酸桿菌數(shù)量顯著降低，大腸桿菌數(shù)量顯著升高；而合生元+DSS 組乳酸桿菌數(shù)量較DSS 組顯著提高，大腸桿菌數(shù)量降低，說明植物乳桿菌L47+菊粉組合促進(jìn)了有益菌的增殖，抑制了病原菌的生長。合生元可通過多種途徑抑制腸道病原菌的增殖，其中包括促進(jìn)乳酸菌增殖而產(chǎn)生大量乳酸降低pH 形成一個抑制病原菌如大腸桿菌等生長的酸性環(huán)境，從而保護(hù)動物腸道健康[21]。此外，Vinolo 等[22]研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸炎可引起腸道短鏈脂肪酸濃度下降。本研究結(jié)果顯示，合生元+DSS 組乙酸、丁酸以及總短鏈脂肪酸濃度顯著高于DSS 組，說明植物乳桿菌L47+菊粉能夠調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)短鏈脂肪酸的生成。這可能與乳酸菌數(shù)量增加有關(guān)，因為乳酸菌除了產(chǎn)生乳酸還可以促進(jìn)SCFAs 的產(chǎn)生，其中包括乳酸含量的增加為丁酸產(chǎn)生菌提供了底物來源，從而促進(jìn)丁酸含量增加[23-24]。

腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)受到Toll-like 受體（Toll-like Receptors，TLRs）的調(diào)控，它們在微生物病原和調(diào)節(jié)先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。其中TLR4 是研究最為廣泛的受體之一，它主要通過識別大腸桿菌等革蘭氏陰性菌外膜的結(jié)構(gòu)成分LPS 而激活炎癥信號通路，其中最主要的是以NF-kB 為中心的炎癥信號通路[25]。被激活的NF-κB 調(diào)控一系列免疫炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，觸發(fā)腸道炎癥介質(zhì)如IL-1、IL-2、IL-6、IL-8 以及TNF-α、IFN-γ、黏附分子蛋白等細(xì)胞因子，導(dǎo)致腸道黏膜組織炎癥損傷[26]。研究表明，TLR4在正常人體腸道黏膜中少量表達(dá)，但在UC 患者或UC 模型小鼠的腸黏膜中其表達(dá)大幅提高[27]。本研究結(jié)果顯示，相比于DSS 組，合生元+DSS 組TLR4 的mRNA 表達(dá)上調(diào)，血液促炎因子IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α水平降低，這表明植物乳桿菌L47+菊粉能減輕腸道黏膜的炎癥反應(yīng)，可能與植物乳桿菌L47+菊粉引起結(jié)腸短鏈脂肪酸濃度的改變有關(guān)。眾多研究均表明短鏈脂肪酸具有抗炎作用。Tedelind 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，短鏈脂肪酸可以抑制人結(jié)腸細(xì)胞系TLR4介導(dǎo)的NF-κB 激活，其抗炎作用為丁酸＞丙酸＞乙酸；Fukuda 等[29]也發(fā)現(xiàn)乙酸可緩解小鼠大腸桿菌攻毒所引起的腸道炎癥。

綜上所述，植物乳桿菌L47+菊粉可能是通過提高小鼠結(jié)腸乳酸桿菌數(shù)量及短鏈脂肪酸濃度，抑制大腸桿菌等病原菌的生長，降低TLR4基因的相對表達(dá)以及IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α等促炎因子的分泌，從而一定程度緩解小鼠結(jié)腸炎癥，具有應(yīng)用于生產(chǎn)實踐的潛力。