聚乙二醇改性聚乳酸神經(jīng)導(dǎo)管修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損

羅 東，史振偉，王 玉，孫 琦，黃轉(zhuǎn)青，程曉清，馬 玥，楊 飛，張 瑩，王聰聰，許文靜，徐風(fēng)華

1 解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院醫(yī)療保障中心 藥劑科藥學(xué)基礎(chǔ)研究室，北京 100853；3 解放軍總醫(yī)院 骨科研究所，北京 100853

周圍神經(jīng)損傷(peripheral nerves injury，PNI)會(huì)導(dǎo)致受支配區(qū)域感覺和運(yùn)動(dòng)功能障礙，甚至導(dǎo)致終身殘疾，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，其臨床常見體征和癥狀有麻木、刺痛、搏動(dòng)、灼熱、劇烈疼痛等[1-2]。目前，自體神經(jīng)移植仍是臨床治療周圍神經(jīng)損傷的首選方法，同時(shí)也是研究其替代治療措施的“金標(biāo)準(zhǔn)”[3]。但自體神經(jīng)來源有限，且存在增加創(chuàng)傷、遺留供區(qū)感覺障礙、神經(jīng)束支對(duì)合及匹配不佳等缺點(diǎn)[4]。為了滿足大間隙修復(fù)的臨床需求，解決自體神經(jīng)移植的限制，基于組織工程的神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管(nerve guidance conduit，NGC)開始發(fā)展起來，該方法通過植入天然、合成或半合成生物材料的NGC 來治療周圍神經(jīng)缺損[5-6]。聚乳酸(poly lactic acid，PLA) 具有良好的生物相容性、良好的生物降解性和熱塑性，其在神經(jīng)再生組織工程中的應(yīng)用引起了人們的極大關(guān)注[7]。但其代謝中間產(chǎn)物乳酸在局部堆積會(huì)導(dǎo)致局部pH 值下降，同時(shí)其親水性差，細(xì)胞吸附率低，不利于細(xì)胞表面黏附，這都會(huì)影響神經(jīng)損傷的修復(fù)再生。研究表明，細(xì)胞外酸性pH 可刺激巨噬細(xì)胞NLRP3 炎性小體活化和IL-1β 分泌，周圍神經(jīng)損傷常伴隨局部酸中毒、缺血和炎癥，而局部酸中毒又會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)缺血和炎癥的發(fā)生[8-9]。聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG) 是一種常見的醇類水凝膠材料，在神經(jīng)再生領(lǐng)域也有廣泛應(yīng)用[10]。用聚乙二醇制備的水凝膠有著良好的親水性和生物相容性，其分子鏈含有羥基和醚鍵，因此能與含羧基、羥基的水溶性分子通過分子間的氫鍵形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[11-12]。本研究利用PEG 改善PLA 導(dǎo)管親水性能，誘導(dǎo)免疫耐受，減輕免疫反應(yīng)，同時(shí)防止PLA 中間降解產(chǎn)物乳酸在導(dǎo)管內(nèi)聚集，維持神經(jīng)再生局部微環(huán)境穩(wěn)定，探討其作為神經(jīng)修復(fù)支架的可能性。

材料與方法

1試劑及儀器 聚乳酸(η=0.8 dL/g，相對(duì)分子質(zhì)量1×105，山東省醫(yī)療器械研究所)；二氯甲烷(國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司)；PEG3000(Fluka 公司)；丙烯酰氯(TCI 公司)；三乙胺(Sigma-Aldrich)；帶線縫合針(上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品公司)；甲苯胺藍(lán)染料(北京化學(xué)試劑有限公司)，小鼠來源NF200 單克隆抗體(Sigma-Aldrich 公司)，山羊抗小鼠IgG/Alexa Fluor?488(Abcam 公司)，兔來源抗S100 多克隆抗體(Sigma-Aldrich 公司)，山羊抗兔IgG/Alexa Fluor?594(Abcam 公司)，兔來源抗CD31 多克隆抗體(Servicebio 公司)，山羊抗小鼠CY3(Servicebio公司)，山羊抗兔IgG/Alexa Fluor?488(Servicebio公司)，DAPI 染色劑(北京百奧科技有限公司)；RSC96 細(xì)胞(上海雅吉生物有限公司)。SU-8200 型掃描電子顯微鏡(日立公司)；SHY-2A 型水浴恒溫振蕩器(江蘇金壇國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)；Catwalk XT 10.5 小動(dòng)物步態(tài)分析儀(Noldus 公司)；RM2016 病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)；JB-P5 型包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)；Donatello 脫水機(jī)(DIAPATH 公 司)；ECLIPSE C1 型熒光顯微鏡(Nikon 公司)；108 AUTO/SE 型離子濺射儀(廣州競(jìng)贏化工科技有限公司)。

2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠30 只，10 周齡，體質(zhì)量250～300 g，用于構(gòu)建大鼠坐骨神經(jīng)10 mm 缺損動(dòng)物模型，由斯貝福(北京) 生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0010，經(jīng)過解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)，嚴(yán)格執(zhí)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序，飼養(yǎng)于自動(dòng)供應(yīng)食水、12 h 光照/黑暗循環(huán)條件的塑料鼠籠中。

3PLA 神經(jīng)導(dǎo)管的制備 采用溶劑揮發(fā)法制備PLA 導(dǎo)管。稱取20 mg 聚乙二醇溶于1 mL 二氯甲烷中，攪拌均勻后加入280 mg 聚乳酸，再次攪拌均勻。將不銹鋼模具(直徑1.5 mm、長(zhǎng)80 mm)垂直浸入溶液30 s 后提出，室溫放置，待溶劑揮發(fā)后，從不銹鋼模具上取下，制備成內(nèi)徑1.5 mm、壁厚0.2 mm、長(zhǎng)14 mm 的PLA 導(dǎo)管。封裝后經(jīng)γ 射線輻射滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4PEGDA 的合成 稱取3 g PEG3000 于反應(yīng)器中，加入20 mL 甲苯攪拌使PEG3000 完全溶解，密封，通入氮?dú)獗Ｗo(hù)。向其中滴加555 μL 三乙胺和325 μL 丙烯酰氯，38℃水浴，攪拌過夜。將反應(yīng)液過濾，濾液用50 mL 的4℃冷乙醚重結(jié)晶。濾餅在38℃水浴溶解后，冷卻至室溫，再用50 mL 的4℃冷乙醚重結(jié)晶2 次。將濾餅常溫避光干燥24 h，得到白色產(chǎn)物，避光-20℃保存。

5PEG-PLA 神經(jīng)導(dǎo)管的制備 稱取PEGDA 0.5 g溶于1 mL 純凈水中，待完全溶解后，再向其中加入100 μL 的APS 溶液(50 mg/mL)和50 μL 的TEMED溶液(20%，pH 7.4)，反應(yīng)30 s，用移液槍將尚未完全膠凝的溶液垂直注入PLA 導(dǎo)管，旋轉(zhuǎn)PLA 導(dǎo)管，使溶液在管壁均勻分布。干燥24 h。PBS 洗3 次，每次5 min。封裝后經(jīng)γ 射線輻射滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

6掃描電鏡觀察導(dǎo)管的結(jié)構(gòu)和形態(tài) 將PLA 神經(jīng)導(dǎo)管和PEG-PLA 神經(jīng)導(dǎo)管沿矢狀位切開，修剪成矩形小塊，將兩種移植物的內(nèi)外側(cè)分別用導(dǎo)電膠固定于SU82000 型掃描電鏡的標(biāo)本金屬底座上，108 AUTO/SE 型離子濺射儀中氬氣填充密閉條件下噴金。將固定有標(biāo)本的金屬底座移至顯微鏡掃描電鏡內(nèi)，調(diào)整坐標(biāo)及焦距，真空條件下5 kV電壓對(duì)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)并記錄照片。

7細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)將單純PLA 和PEG-PLA 神經(jīng)導(dǎo)管分別放入含有體積分?jǐn)?shù)10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，棄去導(dǎo)管，得到預(yù)處理的DMEM 培養(yǎng)基。設(shè)置Control 組(未處理的DMEM 培養(yǎng)基)、PEG-PLA 組(PEG-PLA 預(yù)處理DMEM 培養(yǎng)基)和PLA 組(PLA 預(yù)處理DMEM 培養(yǎng)基)，每組5 個(gè)復(fù)孔，將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)培養(yǎng)期的RSC96 細(xì)胞以2.5 × 105/mL 的濃度接種于60Co 消毒的96 孔板中，每孔200 μL 細(xì)胞懸液，于5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。過夜，待細(xì)胞貼壁后，更換為上述對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)1 d、3 d 和5 d。于各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)向每孔加入20 μL 的CCK-8 溶液，37℃孵育1 h 后，將96 孔板置于微量孔板分光光度計(jì)中，測(cè)定各孔在450 nm 處的吸光度值。

8動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)方法 SD 大鼠30 只隨機(jī)分為自體神經(jīng)移植組(ANG)、聚乙二醇改性聚乳酸神經(jīng)導(dǎo)管組(PEG-PLA)、聚乳酸神經(jīng)導(dǎo)管組(PLA)，每組10 只。電子天平稱量SD 大鼠體質(zhì)量，3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg 體質(zhì)量)進(jìn)行麻醉。角膜反射確定麻醉可靠后于大鼠右后肢備皮，常規(guī)消毒鋪巾。取右后肢后外側(cè)縱行切口，長(zhǎng)約2.5 cm，逐層切開皮膚、皮下、肌層，暴露坐骨神經(jīng)，直尺測(cè)量下切除7 mm 坐骨神經(jīng)，坐骨神經(jīng)斷端回縮，最終形成10 mm 坐骨神經(jīng)缺損，以8-0帶針縫合線分別在坐骨神經(jīng)近、遠(yuǎn)端橋接縫合移植物，確認(rèn)橋接物縫合可靠，0.9%氯化鈉注射液沖洗術(shù)區(qū)，止血充分后以3-0 手術(shù)縫合線逐層縫合肌層和皮膚，碘伏消毒切口后等待麻醉蘇醒。麻醉蘇醒后按分組分籠飼養(yǎng)于自動(dòng)供應(yīng)食水、12 h光照/黑暗循環(huán)條件的塑料鼠籠中。

9再生神經(jīng)免疫熒光染色 術(shù)后第2 周每組隨機(jī)選取5 只大鼠腹腔注射過量3%戊巴比妥鈉處死，充分暴露并完整切取再生神經(jīng)。切取的移植段再生神經(jīng)行10 μm 厚縱行冰凍切片，冰凍丙酮固定15 min，PBS 洗3 遍，每遍5 min。然后置于含10%山羊血清的PBS 中，在室溫條件下阻斷非特異性抗原2 h。切片用小鼠來源抗NF200 單克隆抗體(與PBS 按1∶200 稀釋)和兔來源抗S100 多克隆抗體(與PBS 按1∶200 稀釋) 作為一抗在4°C濕盒中孵育過夜。第2 天，去除多余一抗，切片用PBS 洗3 遍，每遍5 min，然后用山羊抗小鼠IgG/Alexa Fluor?488(與PBS 按1∶200 稀釋)和山羊抗兔IgG/Alexa Fluor?594(與PBS 按1∶200 稀釋)作為二抗在常溫避光條件下孵育1 h。去除多余二抗后，PBS 洗3 遍，每遍5 min，切片再用DAPI 工作液常溫避光條件下孵育5 min，蒸餾水清洗后水性封片劑封片。術(shù)后第12 周每組大鼠坐骨神經(jīng)取材后行CD31/NF200 免疫熒光染色。

10大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)評(píng)價(jià) 術(shù)后4 周、8 周和12 周(每組5 只大鼠)中，使用Catwalk 步態(tài)分析系統(tǒng)評(píng)估運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。將大鼠放在走道板上，讓其向前走。當(dāng)腳趾接觸踩踏表面時(shí)，將顯示實(shí)時(shí)運(yùn)動(dòng)圖像和3D 足跡。從每組的足跡中測(cè)量腳趾的長(zhǎng)度和寬度以及靜態(tài)坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(sciatic nerve function index，SFI)。SFI=0 表示運(yùn)動(dòng)功能正常，SFI=-100 表示運(yùn)動(dòng)功能完全損傷。

11大鼠腓腸肌濕重分析和組織學(xué)評(píng)價(jià) 術(shù)后12 周，各組大鼠腹腔注射過量3%戊巴比妥鈉處死，取材各組大鼠雙側(cè)腓腸肌，立即稱重以術(shù)側(cè)腓腸肌與正常側(cè)腓腸肌濕重的比值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，所得數(shù)據(jù)用于計(jì)算腓腸肌濕重恢復(fù)率；然后取腓腸肌肌腹用4%多聚甲醛固定2 h，石蠟包埋并行腓腸肌肌腹橫斷面10μm 厚石蠟切片。切片常規(guī)脫蠟復(fù)水，以改良Masson 染色試劑盒進(jìn)行染色，常規(guī)脫水、透明、封片。每組隨機(jī)選取5 個(gè)視野，測(cè)量腓腸肌纖維平均橫截面積。

12統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS23.0 軟件進(jìn)行，計(jì)量資料以表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1PEG-PLA 神經(jīng)導(dǎo)管掃描電鏡下形態(tài) 掃描電鏡照片顯示新制備的PEG-PLA 神經(jīng)導(dǎo)管外壁質(zhì)地緊密，無微孔(圖1A)。而其內(nèi)壁有質(zhì)地疏松，呈軸向取向性的排列整齊的紋路(圖1B)。而PLA 神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)外壁均為致密無微孔的結(jié)構(gòu)(圖1C)。

圖1 PEG-PLA 和PLA 神經(jīng)導(dǎo)管電鏡 A：PEG-PLA 和PLA 神經(jīng)導(dǎo)管外壁；B：PEG-PLA 神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)壁；C：PLA 神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)壁Fig.1 Scanning electron microscope of PEG-PLA nerve conduit A:PEG-PLA and PLA nerve conduit outer wall;B:PEG-PLA nerve conduit inner wall;C:PLA nerve conduit inner wall

2神經(jīng)導(dǎo)管材料對(duì)RSC96 細(xì)胞增殖的影響 各組1 d、3 d、5 d 時(shí)在450 nm 處的吸光度值(OD value)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，未處理的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的RSC96 細(xì)胞(對(duì)照組) 與PLA 神經(jīng)導(dǎo)管預(yù)處理組和PEG-PLA 神經(jīng)導(dǎo)管預(yù)處理組的細(xì)胞增殖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明PEGPLA 神經(jīng)導(dǎo)管預(yù)處理的RSC96 細(xì)胞可以正常增殖。見表1。

表1 神經(jīng)導(dǎo)管材料對(duì)RSC96 細(xì)胞增殖的影響(n=5)Tab.1 Effect of nerve conduit on the proliferation of RSC96 cells in the three groups (n=5)

3大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)評(píng)價(jià) Catwalk 步態(tài)分析提示，術(shù)后12 周，PEG-PLA 組的足趾分離程度較PLA 組明顯改善，接近自體神經(jīng)移植組(圖2)。各組手術(shù)側(cè)足趾(右側(cè))與地面的接觸面積均較正常側(cè)(左側(cè))減小。同時(shí)可見各組大鼠傷側(cè)后足(右后足，RH) 受力重心均有不同程度后移，其中PLA 組RH 足印不明顯，足跟部受力面積增加，重心后移程度大于PEG-PLA 組和ANG 組。PEGPLA 組大鼠RH 足趾寬度及中間足趾寬度均較對(duì)側(cè)減小，而足印長(zhǎng)度加大，且足趾受力強(qiáng)度較對(duì)側(cè)(LH) 明顯降低。而ANG 組大鼠RH 足趾寬度及中間足趾寬度接近對(duì)側(cè)(LH)，足印長(zhǎng)度亦無明顯加大，足趾受力強(qiáng)度略低于對(duì)側(cè)(LH)。三組術(shù)后4 周SFI 均接近-100，表明術(shù)后神經(jīng)功能惡化。隨著神經(jīng)再生，單純PLA 組和PEG-PLA 組在第8 周和第12 周SFI 有所提高，但均明顯低于ANG組，單純PLA 組低于PEG-PLA 組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見圖3。

圖2 術(shù)后12 周各組大鼠3D 步態(tài)足印Fig.2 At 12 weeks after operation,the 3D gait footprints of rats in each group were observed

圖3 術(shù)后4 周、8 周、12 周各組坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(aP＜0.05)Fig.3 Sciatic nerve function index of each group at 4,8 and 12 weeks after surgery (aP＜0.05)

4腓腸肌肌肉濕重恢復(fù)率 各組術(shù)側(cè)與健側(cè)腓腸肌大體觀對(duì)比圖(圖4)可見，單純PLA 組和PEGPLA 組術(shù)側(cè)肌肉萎縮嚴(yán)重，與健側(cè)差距明顯；PEGPLA 組術(shù)側(cè)與健側(cè)間差距接近ANG 組。腓腸肌肌肉濕重恢復(fù)率由高到低依次為ANG 組(51.08±8.68)%、PEG-PLA組(31.74±6.56)%、PLA組(18.96±2.75)%，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖5 左)。

圖4 術(shù)后12 周大鼠腓腸肌大體觀Fig.4 Gross view of gastrocnemius muscle in rats at 12 weeks after surgery

5腓腸肌肌 纖維 橫截面積 Masson 染色 可見PLA 組術(shù)側(cè)腓腸肌肌纖維纖細(xì)，排列不規(guī)則，且紅染的肌纖維間有大量的藍(lán)染膠原纖維，橫截面積明顯小于其他兩組；PEG-PLA 組和ANG 組腓腸肌肌纖維形態(tài)排列較為規(guī)整，但PEG-PLA 組橫截面積小于ANG 組(圖6)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示各組腓腸肌肌纖維橫截面積由高到低依次為(圖5 右)。

圖5 腓腸肌濕重恢復(fù)率(左)和腓腸肌肌纖維橫截面積(右)(aP＜0.05；bP＜0.01)Fig.5 Gastrocnemius muscle wet weight ratio (left) and mean cross-sectional area of gastrocnemius muscle fiber (right) (aP＜0.05;bP＜0.01)

圖6 術(shù)后12 周大鼠腓腸肌肌肉橫截面Masson 染色Fig.6 Masson staining of cross section of gastrocnemius muscle in rats at 12 weeks after operation

6術(shù)后移植段神經(jīng)組織免疫熒光染色 術(shù)后2 周移植段神經(jīng)免疫熒光染色可見NF200 陽(yáng)性的再生神經(jīng)纖維被標(biāo)記為綠色熒光，S100 陽(yáng)性的施萬細(xì)胞被標(biāo)記為紅色熒光。雖然兩組神經(jīng)再生效果都低于ANG 組，但仍可見PEG-PLA 組的神經(jīng)再生效果優(yōu)于單純PLA 組。表明聚乙二醇改性聚乳酸神經(jīng)導(dǎo)管改善了單純PLA 導(dǎo)管的神經(jīng)修復(fù)效果(圖7)。術(shù)后12 周各組大鼠移植段中段端再生神經(jīng)的橫斷面CD31/NF200 免疫熒光染色結(jié)果：NF200陽(yáng)性的再生神經(jīng)纖維被標(biāo)記為紅色熒光，CD31 陽(yáng)性的血管內(nèi)皮細(xì)胞被標(biāo)記為綠色熒光。PEGPLA 組的神經(jīng)纖維密度以及血管內(nèi)皮細(xì)胞的密度明顯高于PLA 組，接近ANG 組。其中，PEG-PLA組ANG 組的血管化程度接近，但三組再生神經(jīng)纖維的數(shù)量卻有所不同，從高到低依次為ANG 組、PEG-PLA 組、PLA 組(圖8)。

圖7 術(shù)后2 周各組移植段再生神經(jīng)的免疫熒光染色Fig.7 Results of immunofluorescence staining of regenerated nerve in each group at 2 weeks after surgery

圖8 術(shù)后12 周，各組移植段再生神經(jīng)中段的免疫熒光染色結(jié)果。免疫熒光染色可見NF200 陽(yáng)性的再生神經(jīng)纖維被標(biāo)記為紅色熒光，CD31 陽(yáng)性的血管內(nèi)皮細(xì)胞被標(biāo)記為綠色熒光Fig.8 Immunofluorescence staining results of the middle segment of regenerated nerve in each group at 12 weeks after operation.Immunofluorescence staining showed that NF200-positive regenerated nerve fibers were marked with red fluorescence and CD31-positive vascular endothelial cells were labeled with green fluorescence

討論

隨著社會(huì)的發(fā)展，各類交通事故和建筑事故高發(fā)，使得周圍神經(jīng)損傷在臨床上越來越普遍，周圍神經(jīng)的再生速度緩慢，且損傷后效應(yīng)器和感受器的功能迅速喪失，這種功能喪失往往會(huì)隨著神經(jīng)損傷修復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)而最終不可逆轉(zhuǎn)。周圍神經(jīng)損傷一直是臨床上的“世界性難題”[13]。

周圍神經(jīng)損傷發(fā)生后短時(shí)間內(nèi)就會(huì)發(fā)生瓦勒氏變性，由于神經(jīng)纖維的連續(xù)性被中斷，神經(jīng)元軸突斷裂，血運(yùn)循環(huán)障礙，導(dǎo)致?lián)p傷平面營(yíng)養(yǎng)代謝障礙，損傷部位遠(yuǎn)端神經(jīng)纖維最終發(fā)生潰變[14]。同時(shí)施萬細(xì)胞經(jīng)蛋白酶途徑降解髓鞘蛋白，神經(jīng)纖維脫髓鞘，大量巨噬細(xì)胞通過血管聚集到神經(jīng)損傷部位，與施萬細(xì)胞吞噬變性髓鞘的碎片，引發(fā)炎癥反應(yīng)[15]。巨噬細(xì)胞在這一時(shí)期一方面由于吞噬作用產(chǎn)生了大量炎性因子，促進(jìn)炎癥發(fā)生，另一方面分泌活性因子將促進(jìn)施萬細(xì)胞的增殖，加快了早期變性髓鞘的清除[16]。另外神經(jīng)損傷后血-神經(jīng)屏障被破壞，神經(jīng)相關(guān)性抗原經(jīng)附近淋巴結(jié)產(chǎn)生特異性抗體，這些抗體最終進(jìn)入血液循環(huán)引起免疫反應(yīng)[17]。而炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)在早期都不利于神經(jīng)再生修復(fù)。

聚乳酸是目前周圍神經(jīng)組織工程應(yīng)用最廣泛的一種可降解材料[18]。但其親水性差，聚乙二醇是一種常見的醇類水凝膠材料，用聚乙二醇制備的水凝膠在有著良好的親水性和生物相容性[13]。

用聚乙二醇改性PLA 神經(jīng)導(dǎo)管，改善PLA 神經(jīng)導(dǎo)管的親水性，提高PLA 的生物相容性，有利于細(xì)胞表面黏附。PEG 水凝膠減少了PLA 的降解中間產(chǎn)物乳酸與神經(jīng)再生微環(huán)境的接觸，維持了神經(jīng)再生微環(huán)境的穩(wěn)定。用聚乙二醇修飾材料可以減少材料對(duì)體內(nèi)補(bǔ)體系統(tǒng)的活化，誘導(dǎo)抗原特異性免疫耐受同時(shí)聚乙二醇有穩(wěn)定蛋白的作用[19]。聚乙二醇還有促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷修復(fù)再生的潛力[20]。

本研究利用溶劑揮發(fā)法制備PLA 神經(jīng)導(dǎo)管支架，并用聚乙二醇雙丙烯酸酯(PEGDA)通過化學(xué)交聯(lián)的方式在導(dǎo)管內(nèi)壁形成PEG 水凝膠，構(gòu)建聚乙二醇改性聚乳酸神經(jīng)導(dǎo)管，并用其修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PEG-PLA 神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)壁質(zhì)地疏松，具有取向性排列整齊的紋路和生物相容性。坐骨神經(jīng)支配大腿后側(cè)以及整個(gè)小腿，因此坐骨神經(jīng)損傷會(huì)引起大腿后側(cè)和小腿的肌肉萎縮，表現(xiàn)為大鼠足下垂和足趾變形，反映在足印上即足趾間距離減小、重心改變和足印延長(zhǎng)[21-22]。術(shù)后大鼠運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)中，PEG-PLA 組和ANG組大鼠足趾間距離減小、重心后移和足印延長(zhǎng)的程度明顯低于PLA 組，提示PEG-PLA 組和運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)明顯優(yōu)于PLA 組，接近ANG 組。PEGPLA 組坐骨神經(jīng)功能指數(shù)雖高于和PLA 組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。分析原因可能是神經(jīng)導(dǎo)管由于不含有任何生物活性物質(zhì)，如神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，而神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在調(diào)節(jié)各種細(xì)胞活動(dòng)如細(xì)胞的增殖、分化、成熟等的過程中扮演了重要的角色[23]。而導(dǎo)管僅是神經(jīng)再生的物理通道，所以其修復(fù)的效果并不令人滿意。PEG-PLA 組的移植段神經(jīng)再生情況、腓腸肌肌肉濕重恢復(fù)率以及Masson 染色等結(jié)果均明顯優(yōu)于PLA 神經(jīng)導(dǎo)管組，更接近自體神經(jīng)移植的修復(fù)效果。各組步態(tài)分析結(jié)果、SFI、腓腸肌濕重恢復(fù)率、移植段神經(jīng)再生情況以及Masson 染色結(jié)果均接近同類研究。

綜上所述，我們認(rèn)為PEG-PLA 神經(jīng)導(dǎo)管具有良好的組織相容性，是一種較為理想的神經(jīng)導(dǎo)管。在今后的實(shí)驗(yàn)中我們將以PEG-PLA 導(dǎo)管負(fù)載神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子并修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損。