miR-129-5p調(diào)控MC3T3-E1細胞成骨分化的體外研究

趙長銘，黃 萌，王振寧，徐璐璐

1解放軍總醫(yī)院研究生院，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心 口腔正畸科，北京 100853

骨代謝過程中，許多小分子蛋白或RNA 通過對有分化潛能的干細胞發(fā)揮調(diào)控作用，進而影響骨骼發(fā)育和重塑。越來越多的實驗研究表明microRNAs 參與調(diào)控干細胞增殖、成骨分化過程，并發(fā)揮重要調(diào)控作用[1-4]。最近一項研究顯示，進行體育鍛煉后人血清中microRNAs(miR-129-5p、miR-21-5p 和miR-378-5p)表達增加[5]。用鍛煉后的血清培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細胞，發(fā)現(xiàn)對成骨分化有抑制作用的PTEN 和SMAD7 蛋白表達下調(diào)，相關(guān)成骨分化基因表達上調(diào)。我們前期的實驗發(fā)現(xiàn)，在小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化7 d、14 d 后的miR-129-5p 表達水平均顯著上調(diào)(P＜0.05)。Liu 等[6]報道m(xù)iR-129-5p 通過調(diào)控BMP2 基因促進肝癌的增殖和轉(zhuǎn)移。而人滑膜間充質(zhì)干細胞來源的miR-129-5p 通過靶向hMGB1 減輕IL-1 誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎[7]。對miR-129-5p 研究主要集中在腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移及免疫調(diào)控方面，其在成骨分化和骨形成過程中的作用和機制尚不清楚。因此，本研究探究miR-129-5p 對MC3T3-E1 細胞成骨分化的影響，通過Targetscan 軟件預(yù)測并篩選出miR-129-5p 的潛在靶基因，并進一步研究其作用靶點及具體調(diào)控機制，為骨發(fā)育和骨重塑提供理論支持。

材料和方法

1細胞和試劑 α-MEM 培養(yǎng)基(Gibco，美國)；特級胎牛血清(Gibco，美國)；磷酸鹽緩沖液PBS(Gibco，美國)；青鏈霉素混合液(Gibco，美國)；0.25% 胰蛋白酶(Gibco，美國)；MC3T3-E1 細胞(購自中國科學院上海生科院細胞資源中心；RIPA 裂解液(索萊寶，北京)；小鼠成骨分化誘導(dǎo)液、茜素紅染色液(賽業(yè)生物，北京)；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo，美國)；qRT-PCR 試劑盒(Roche，瑞士)；慢病毒miR-129-5p mimic、inhibitor、control 和慢病毒助轉(zhuǎn)劑HitransG A 25x(吉 凱，北 京)；mRNA 引物10 μm(生工生物，北京)；Runx2 抗體(Abcam，USA)；OCN 抗體(Affinity Biosciences，USA)；Smad6 抗體(成都正能生物科技公司)；羊抗鼠、羊抗兔二抗(中杉金橋)；ECL發(fā)光液(普利萊)；堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(碧云天)；堿性磷酸酶檢測試劑盒(P0321S，碧云天)。

2慢病毒的轉(zhuǎn)染和MC3T3-E1 細胞成骨分化培養(yǎng) 取生長狀態(tài)良好的MC3T3-E1 細胞，0.25%胰蛋白酶消化后將MC3T3-E1 細胞以1 × 105/孔的密度接種于六孔板中，使用10%胎牛血清α-MEM全培養(yǎng)液培養(yǎng)，放置于5% CO2、37℃孵箱。第2 天細胞換液時，PBS 洗3 次后，直接加入miR-129-5p 的慢病毒(control、mimic 和inhibitor)、助轉(zhuǎn)劑和無血清的α-MEM 培養(yǎng)基，4～6 h 后補液(含胎牛血清的培養(yǎng)基)，24 h 換液。72 h 熒光顯微鏡下觀察GFP 熒光，以確保轉(zhuǎn)染效率達到80%～90%，進行后續(xù)實驗。轉(zhuǎn)染后的細胞直接進行成骨分化培養(yǎng)，每隔2 d 換成骨誘導(dǎo)液，在誘導(dǎo)分化7 d和14 d 時測定成骨表達標志物Runx2 和OCN。

3堿性磷酸酶染色觀察細胞染色情況 轉(zhuǎn)染慢病毒的MC3T3-E1 細胞，加入小鼠成骨分化誘導(dǎo)液(賽業(yè)，中國) 培養(yǎng)。成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)7 d 后，棄去培養(yǎng)基，使用PBS 緩沖液沖洗3 次，按照堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(C3206，碧云天) 使用說明，將經(jīng)過成骨誘導(dǎo)細胞樣品用4% 多聚甲醛溶液固定30 min 后，PBS 清洗細胞3～5 次。按照說明書配置染色工作液，顯色緩沖液3 mL，BCIP 液(300×) 10 μL，NBT 溶液(150×)20 μL，共計3.03 mL ALP 染色工作液。去除PBS，加入能適量ALP 染色工作液，確保能充分覆蓋樣品。室溫避光孵育30 min，直至顯色達到預(yù)期效果。PBS 清洗工作液3～5 次以中止顯色反應(yīng)，自然光下拍照。

4堿性磷酸酶活性檢測ALP 表達 如“材料和方法 3”中的細胞培養(yǎng)方法，在7 d 時收集樣品，進行ALP 活性檢測。采用細胞裂解液裂解細胞后，加入溶液稀釋10 倍顯色底物1.5 mL，充分溶解混勻，冰上放置。取標準品溶液10 μL p-nitrophenol溶液，用檢測緩沖液稀釋至0.2 mL，最終濃度為0.5 mmol/L。使用96 孔板設(shè)置空白對照孔、標準品孔和樣品孔。用槍頭輕輕吹打混勻，37℃孵育5～10 min。每孔加入100 μL 反應(yīng)終止液終止反應(yīng)。在405 nm 測定吸光度，計算出樣品中的堿性磷酸酶活性。

5茜素紅染色檢測鈣結(jié)節(jié) 成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)21 d 后，取各組細胞PBS 沖洗3 次，加入4%多聚甲醛，固定30 min，棄去固定液，PBS 沖洗3 次，使用茜素紅(賽業(yè)) 染色10 min，PBS 沖洗3 次，拍照。再將染色的細胞用10%十六烷基吡啶氯化物溶解，并用酶標儀測定在562 nm 處的吸光度值用以半定量分析。

6實時熒光定量PCR 檢測成骨基因mRNA 轉(zhuǎn)染miR-129-5p 慢病毒的三組細胞(control、mimic和inhibitor)，體外成骨誘導(dǎo)7 d 和14 d 后，將待檢測的細胞六孔板中每孔加入1 mL Trizol，放入1.5 mL 無RNA 酶EP 管中。每1 mL Trizol 加200 μL三氯甲烷，劇烈震蕩15 s 后，室溫孵育10 min。提前預(yù)冷離心機至4℃，12 000 g 離心20～25 min。取上層水相到新管中加入600 μL 異丙醇，顛倒混勻，室溫孵育15 min。低溫離心機在4℃下12 000 g 離心15 min。去掉上清，加入1 mL DEPC水配制的75% 乙醇，渦旋或顛倒混合。4℃下7 500 g 離心7 min。去上清，用吸水紙小心將管壁和管蓋上殘留的液體吸干。加入20 μL DEPC，輕彈數(shù)次使其溶解。測定RNA 的濃度。按照說明書反轉(zhuǎn)錄體系，以1 000 ng 的RNA 為模版，反轉(zhuǎn)錄為更為穩(wěn)定的cDNA(組分：2×mRNA master mix 10 μL，總RNA 1 μg，無RNA 水定容至20 μL)。使用實時PCR 系統(tǒng)，熒光反應(yīng)條件為94℃ 2 min →95℃ 20 s→ 58℃ 30 s→ 循環(huán)40 次。根據(jù)標準曲線計算mRNA 水平，將每個樣品與內(nèi)參基因β-actin比較，結(jié)果以2-ΔΔCt表示。所用的引物均為生工生物有限公司提供，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

7Western blot 檢測Runx2 和OCN 的蛋白表達 轉(zhuǎn)染MC3T3-E1 細胞并成骨誘導(dǎo)7 d 和14 d 后，向6 孔板中加入含蛋白酶抑制劑(PMSF) 的RIPA 裂解液，冰上仔細刮取細胞并裂解30 min 收集蛋白產(chǎn)物。按照試劑盒(Thermo Fisher Scientific USA)的說明，BCA 法測定蛋白含量后，取定量的總蛋白量后進行凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜后，TBST洗膜3 次，每次10 min。5% 的脫脂牛奶封閉1 h后，一抗Runx2(兔抗，CST，USA) 和OCN(兔抗，Affinity，USA) 按照1∶1 000 濃度配制后孵育，4℃過夜孵育，TBST 洗兩次，室溫二抗孵育1 h 后，TBST 洗3 次后，ECL 發(fā)光液顯色。

8雙熒光素酶檢測miR-129-5p 與Smad6 的關(guān)系Targetscan 預(yù)測miR-129-5p 和Smad6 3’UTR 區(qū)可能的結(jié)合位點，合成包含Smad6 的野生型(Smad6-wt)或突變體(Smad6-mut) 種子區(qū)的序列，并將其克隆到熒光素酶質(zhì)粒中。293T 細胞培養(yǎng)在α-MEM 培養(yǎng)基(含10% 胎牛血清) 中生長至80%融合后，將其與指定的報告基因構(gòu)建體和海腎熒光素酶質(zhì)粒一起接種于48 孔板中(1 × 104/孔)。轉(zhuǎn)染后24 h 加入熒光素酶反應(yīng)底物，使用酶標儀先后測定(Thermo Multiskan FC)螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的吸光度值，用海腎熒光素酶熒光強度標準化后，統(tǒng)計比值數(shù)據(jù)并作圖。

9統(tǒng)計學分析 采用Graphpad Prism 7 軟件對數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學分析。兩組數(shù)據(jù)間的比較采用兩獨立樣本t檢驗分析，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1慢病毒轉(zhuǎn)染效率 miR-129-5p 慢病毒過表達(mimic)、敲低(inhibitor) 和陰性對照(control)感染MC3T3-E1 細胞24 h 后收集細胞，PCR 檢測顯示mimic 組miR-129-5p 的表達量高于對照組，inhibitor 組表達低于對照組(P＜0.05)。見圖1。

圖1 miR-129-5p 在MC3T3-E1 細胞中的轉(zhuǎn)染效率(aP＜0.05，bP＜0.01)Fig.1 Transfection efficiency of miR-129-5p in MC3T3-E1 cells(aP＜0.05,bP＜0.01)

2堿性磷酸酶及鈣結(jié)節(jié)形成情況 成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)7 d 時，堿性磷酸酶染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)mimic 組較control 組堿性磷酸酶活性明顯增強；inhibitor組則弱于control 組。成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)21 d 時，倒置顯微鏡下觀察茜素紅染色檢測鈣結(jié)節(jié)形成和礦化情況，mimic 組鈣化結(jié)節(jié)明顯多于control 組，inhibitor 組鈣化結(jié)節(jié)則少于control 組(P＜0.05)。見圖2。

圖2 堿性磷酸酶(7 d)和茜素紅染色情況(21 d)(aP＜0.05，bP＜0.01)Fig.2 Alkaline phosphatase (7 days) and Alizarin red staining (21 days)(aP＜0.05,bP＜0.01)

3miR-129-5p 促進MC3T3-E1 細胞成骨分化基因Runx2 和Ocn 表達 在成骨誘導(dǎo)分化7 d 時，mimic組成骨早期轉(zhuǎn)錄因子Runx2 在mRNA 和蛋白水平上均升高。成骨誘導(dǎo)分化14 d 后，與inhibitor 組和control 組相比，過表達miR-129-5p 后成骨分化晚期基因OCN 的表達均上調(diào)。這些結(jié)果表明miR-129-5p 促進了MC3T3-E1 細胞向成骨細胞的分化。見圖3。

圖3 Runx2 和OCN 的mRNA 和蛋白表達水平(aP＜0.05，bP＜0.01)A：成骨分化后control 組，mimic 組和inhibitor 組Runx2 和OCN 蛋白的表達水平(β-actin 標準化)；B：成骨分化7 d 時，Runx2 的mRNA 表達水平。成骨分化14 d 時，OCN 的mRNA 表達水平Fig.3 mRNA and protein expression of Runx2 and OCN (aP＜0.05,bP＜0.01)A:The expression levels of Runx2 and OCN proteins in the control group,mimic group and inhibitor group (standardized by β-actin);B:Runx2 mRNA expression level at 7 days.OCN mRNA expression level at 14 days

4miR-129-5p 靶向調(diào)控Smad6 表達 Targetscan預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-129-5p 的潛在靶基因有1 000 多個，其中Smad6 是其中一個靶基因，雙熒光素酶實驗驗證miR-129-5p 是否作用于Smad6 的3’UTR區(qū)域。結(jié)果表明轉(zhuǎn)染Smad6 野生型的293T 細胞的熒光素酶活性明顯低于對照組，而轉(zhuǎn)染突變型的293T 細胞與其陰性對照組的熒光素酶活性無顯著差異。Western-blot 檢測Smad6 的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)在MC3T3-E1 細胞過表達miR-129-5p 后，Smad6蛋白表達降低(圖4)，進一步說明Smad6 是miR-129-5p 潛在調(diào)控的靶基因。

圖4 Smad6 是miR-129-5p 調(diào)控的靶基因(aP＜0.01)A：生物信息網(wǎng)站Targetscan 預(yù)測miR-129-5p 可能調(diào)控Smad6 基因及調(diào)控位點區(qū)域；B：Smad6 熒光素酶活性檢測結(jié)果；C：過表達miR-129-5p mimic 后靶基因Smad6 蛋白水平下調(diào)Fig.4 Smad6 as the potential target gene regulated by miR-129-5p (aP＜0.01)A:Bioinformatics website Targetscan predicts that miR-129-5p may regulate the Smad6 gene and its regulatory site region.B:Smad6 luciferase activity detection results;C:Down-regulation of target gene Smad6 protein level after miR-129-5p mimic

討論

成骨細胞具有合成骨基質(zhì)蛋白的能力，在維持骨骼微結(jié)構(gòu)和體內(nèi)平衡中起著關(guān)鍵作用[8]。MC3T3-E1 細胞是小鼠成骨前體細胞系，具有成骨分化的潛能，是研究成骨分化和骨形成的良好細胞載體[9]。microRNAs 是一種高度保守、非編碼的RNA，主要通過與互補序列的mRNA 直接相互作用，誘導(dǎo)mRNA 降解或抑制其轉(zhuǎn)錄后翻譯，進而影響許多生物學進程[10]。而且microRNA 和轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)控細胞增殖分化，并已成為近年來研究骨代謝治療的相關(guān)靶點。Zhao 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，miR-497-5p 在骨質(zhì)疏松患者中低表達，在MC3T3-E1 細胞分化過程中表達上調(diào)。miR-497-5p 通過靶向Hmga2 抑制了JNK 通路的激活，促進了MC3T3-E1 細胞成骨分化。同樣，成肌細胞分泌的胞外小泡中的miR-196a-5p 可促進ST-2 細胞和MC3T3-E1 細胞向成骨細胞分化[12]。而Chen等[13]發(fā)現(xiàn)miR-17-3p 下調(diào)Bmp2 誘導(dǎo)的MC3T3-E1細胞的成骨分化，是通過靶向調(diào)控Sox6 表達實現(xiàn)的。Tao等[14]發(fā)現(xiàn)miR-181a-3p通過靶向調(diào)節(jié)Bmp10從而抑制人骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-129-5p 在細胞成骨分化中表達上調(diào)，繼而猜想miR-129-5p 可能在成骨分化起作用。我們選取了小鼠成骨前體細胞MC3T3-E1 作為研究對象。堿性磷酸酶活性是衡量成骨細胞早期分化的指標，主要在細胞外基質(zhì)分泌階段分泌。慢病毒載體過表達miR-129-5p，發(fā)現(xiàn)mimic組堿性磷酸酶染色和活性高于對照組。茜素紅染色可通過鈣結(jié)節(jié)的染色間接反映出骨質(zhì)形成的多少。mimic 組鈣結(jié)節(jié)的染色較深、數(shù)量多，這說明miR-129-5p 在成骨分化晚期促進了成骨前體細胞礦化。為了深入研究miR-129-5p 的成骨分化作用，我們檢測了成骨相關(guān)基因Runx2、OCN 的mRNA 和蛋白表達，過表達組均上調(diào)，這驗證了我們之前的染色結(jié)果。

通過Targetscan 網(wǎng)站生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，成骨相關(guān)基因Smad6 可能是miR-129-5p 潛在的靶基因。SMAD 家族蛋白主要分為受體調(diào)節(jié)型SMAD、共同伴侶SMAD 和抑制型SMAD。Smad6是抑制型SMAD，其會干擾SMAD 受體或SMADSMAD 的相互作用，并負反饋調(diào)節(jié)BMP/SMAD 通路[15-16]。SMAD 家族成員促進了來自配體激活受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)位至細胞核以調(diào)節(jié)下游靶基因的表達[17-18]。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C明，Smad6 可能是miR-129-5p 調(diào)控的靶基因，過表達miR-129-5p 后Smad6 蛋白水平下調(diào)，這表明miR-129-5p 可能是通過調(diào)控Smad6 的表達來調(diào)控MC3T3-E1 的成骨分化水平，具體機制需要進一步討論。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-129-5p 參與了MC3T3-E1 細胞成骨分化，成骨分化相關(guān)基因Runx2 和OCN 表達升高，為揭示骨分化和骨再生的分子機制提供了初步的理論依據(jù)。