宏基因組測序技術在頜面部間隙感染細菌分布中的研究

陳怡恒 鄭宏雨 李紫璇 吳永超 牛志興 彭彥惠 趙軍方 孫強

鄭州大學第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科，鄭州450052

口腔頜面部感染是口腔頜面外科最常見急癥之一，多繼發(fā)于牙源性及腺源性感染，由于口腔頜面部解剖結構存在上行及下行的潛在通道，感染易向顱內、縱隔擴散，導致腦膿腫、縱隔膿腫、膿毒癥等嚴重并發(fā)癥的發(fā)生，病情兇險威脅患者生命[1]，以往資料[2]表明，其死亡率高達61.5%。頜面間隙感染致病菌的早期確定及針對性用藥尤為重要，然而傳統(tǒng)病原微生物檢測手段雖具有快速、簡單、成本及技術要求低等特點，但無法對標本所含病原微生物做出整體分析。尤其是病毒、未知或難培養(yǎng)的病原微生物，目前的檢測方法為涂片、培養(yǎng)、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）等，均具有較大局限性[3-4]。近年來，宏基因組測序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）技術越來越受到重視，可以在不使用任何引物或探針的情況下，對待測樣品所有DNA片段進行擴增和測序[5]。理論上，mNGS可以在一次實驗中識別所有潛在的病原體，對標本中可能存在的病原體進行全面檢測，從而有助于頜面部間隙感染的早期診斷。

1 材料和方法

1.1 一般資料

收集2020年3—6月鄭州大學第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科收治的符合入選排除標準的16例頜面部間隙感染患者的臨床資料，其中男性12例，平均年齡為（54.08±17.21）歲；女性4例，平均年齡為（71.15±12.50）歲。感染部位分別為單間隙9例，多間隙7例。感染來源分別為牙源性12例，非牙源性4例。納入標準：1）年齡＞18歲；2）確診為頜面部間隙感染患者；3）應用抗生素前已留取病變局部抽吸膿液；4）患者或其家屬已簽署知情同意書。排除標準：1）妊娠期婦女；2）合并頜面部外其他部位感染；3）送檢樣本的微生物核酸含量＜100 copies·mL-1。

1.2 樣本采集

應用抗生素前收集患者頜面部局部腫脹抽吸液2份，同時送醫(yī)院微生物培養(yǎng)以及臨床精準用藥中心進行病原體mNGS。樣本量：醫(yī)院微生物培養(yǎng)需要抽吸液樣本至少1 mL，及時送檢；mNGS樣本需抽吸液至少2 mL，4～20℃暫存，2 h內送檢，如不能及時送檢，-20℃保存，24 h內送檢。

1.3 檢測方法

1.3.1 常規(guī)細菌培養(yǎng) 采用梅里埃VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)對膿液進行細菌鑒定及藥敏試驗分析，VITEK試驗卡中的GN卡用于革蘭陰性桿菌鑒定，GP卡用于革蘭陽性球菌鑒定，采用K-B法藥敏試驗進行補充分析。

1.3.2 mNGS 1）核酸提取和文庫構建：提取2～3 mL膿液標本，將標本與玻璃珠混合震蕩，按照MinION試劑盒的標準建庫流程提取DNA和構建測序文庫；2）測序與數據預處理：測序過程基于牛津納米孔技術（Oxford nanopore technologies，ONT）平臺和ONT MinKNOW軟件v3.3.2完成，通過ONTGuppy軟件v3.0.3將原始序列數據（fast5文件）進行堿基讀取得到存儲測序數據（fastq測序文件），然后利用比對軟件blastn-short v2.7.1+進行樣本拆分；3）數據清洗：去除讀長≤500堿基的序列、質量控制值＜8的低質量序列；4）去宿主和菌種鑒定：使用比對軟件Minimap2 v2.14-r883將序列與人類參考基因組（GRCh38）進行比對來去除宿主序列。使用比對軟件Centrifuge v1.0.4將其余序列比對到微生物序列，并通過比對軟件Megablast v2.7.1進行驗證。剔除比對到多種細菌的序列，然后計算對應微生物的物種豐度（比對到該物種的序列/比對到所有微生物的序列數）；5）耐藥分析：采用耐藥基因數據庫（comprehensive antibiotic research database，CARD）v2.0.2中耐藥基因序列作為參考序列，使用ONT測序質控后的長序列進行比對，將比對上的序列進行局部組裝后，獲取對應的基因型，從而進行耐藥基因的精確鑒定，進而得到相關耐藥藥物種類、具體耐藥藥物、基因家族和耐藥機制等注釋信息。

1.4 mNGS微生物陽性判定方法

細菌的檢出序列數（Reads）＞200，同時細菌檢出豐度（檢出序列數占所有檢出微生物序列數的比例）＞0.5[6]。

1.5 觀察指標

觀察2種方法的檢驗周期、陽性檢出率、厭氧菌、兼性厭氧菌以及需氧菌檢出率、相對物種豐度、耐藥基因型等。

1.6 統(tǒng)計分析

采用SPSS 24.0軟件對所得數據進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數或百分比表示，比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 部分因素與革蘭陽性菌和陰性菌比例的關系

12例男性中，革蘭陽性菌與陰性菌檢出比例為39.1%（9/23），4例女性中，革蘭陽性菌與陰性菌檢出比例為50%（5/10），其差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；9例單間隙中，革蘭陽性菌與陰性菌檢出比例為40.91%（9/22），7例多間隙中，革蘭陽性菌與陰性菌檢出比例為45.45%（5/11），差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；12例牙源性中，革蘭陽性菌與陰性菌檢出比例為38.46%（10/26），4例非牙源性中，革蘭陽性菌與陰性菌檢出比例為57.14%（4/7），差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 檢驗周期、陽性檢出率的比較

常規(guī)細菌培養(yǎng)的檢驗平均時間為（83.25±11.64）h，mNGS的平均檢驗時間為（18.81±3.73）h，mNGS較細菌培養(yǎng)的檢驗周期明顯縮短（P＜0.05）；常規(guī)細菌培養(yǎng)的陽性檢出率為31.25%（5/16），mNGS的陽性檢出率為100%（16/16），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3 厭氧菌、兼性厭氧菌及需氧菌檢出率的比較

常規(guī)細菌培養(yǎng)的厭氧菌檢出率為0（0/16），mNGS厭氧菌的檢出率為93.75%（15/16），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；常規(guī)細菌培養(yǎng)的兼性厭氧菌檢出率為25.00%（4/16），mNGS的兼性厭氧菌檢出率為75.00%（12/16），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；常規(guī)細菌培養(yǎng)的需氧菌檢出率為12.50%（1/16），mNGS需氧菌的檢出率為25.00%（4/16），差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.4 mNGS致病菌分布狀況

16例樣本檢測出15種致病菌，其中3種為革蘭陽性菌，從高到低依次為咽峽炎鏈球菌占68.75%（11/16）、星座鏈球菌占50.00%（8/16）、化膿鏈球菌占12.50%（2/16）；12種為革蘭陰性菌，從高到低依次為中間普雷沃菌占81.25%（13/16）、牙齦卟啉單胞菌占68.75%（11/16）、產黑色素類桿菌占43.75%（7/16）、核粒梭菌占43.75%（7/16）、齒垢密螺旋體占25.00%（4/16）、壞死梭桿菌占25.00%（4/16）、中間鏈球菌占18.75%（3/16）、福賽斯坦納菌占18.75%（3/16）、肺炎克雷伯桿菌12.50%（2/16）、具核梭桿菌占12.50%（2/16）、大腸桿菌占6.25%（1/16）、流感嗜血桿菌占6.25%（1/16）（圖1）。在本次研究中表達較高的關鍵致病菌（占比在50%以上）依次為：中間普雷沃菌、咽峽炎鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌、星座鏈球菌；其中，中間普雷沃菌的物種豐度在性別方面的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），咽峽炎鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌、星座鏈球菌的物種豐度在性別方面的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；中間普雷沃菌、咽峽炎鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌、星座鏈球菌的物種豐度在感染來源（牙源性和非牙源性）方面的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；中間普雷沃菌、咽峽炎鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌、星座鏈球菌的物種豐度在多間隙與單間隙中的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖1 mNGS致病菌分布狀況Fig 1 Distribution of pathogenic bacteriain mNGS

2.5 mNGS非致病菌分布狀況

在16例樣本中，13例檢測出49種非致病菌（圖2），其中16種革蘭陽性菌，32種革蘭陰性菌，1種真菌。

圖2 mNGS非致病菌分布狀況Fig 2 Distribution of non-pathogenic bacteria in mNGS

16種革蘭陽性菌從高到低依次為：微小微單胞菌、極小奇異菌、齦溝產線菌、毛螺旋菌、溝跡真桿菌、分生艱難桿菌、中間鏈球菌、艱難梭菌、無乳鏈球菌、齒齦歐氏菌、停乳鏈球菌、口腔鏈球菌、丁酸鹽產生菌、痤瘡丙酸桿菌、表皮葡萄球菌、丙酸丙酸桿菌。

32種革蘭陰性菌從高到低依次為：普雷沃菌屬（棲居普雷沃菌、棲牙普雷沃菌、中間普雷沃菌、深黑色普雷沃菌、靶心普雷沃菌、產黑色素普雷沃菌）、擬桿菌屬（解肝素擬桿菌、動膠擬桿菌、脆弱擬桿菌、多氏擬桿菌、普通擬桿菌、副擬桿菌、卵形擬桿菌）、卟啉單胞菌屬（牙齦卟啉單胞菌、不解糖卟啉單胞菌）、彎曲桿菌屬（簡明彎曲菌、纖細彎曲菌）、福賽斯坦納菌、牙齦二氧化碳噬纖維菌、杜克雷嗜血桿菌、梭桿菌屬（牙周梭桿菌、具核梭桿菌、壞死梭桿菌）、韋榮球菌屬（小韋榮球菌、嚙齒韋榮氏球菌）、齒密螺旋體、爭論貪噬菌、口腔纖毛菌、口腔支原體、齲齒放線菌、生痰二氧化碳噬纖維菌、長奈瑟菌。

1種真菌為聚多曲霉。

2.6 耐藥基因型的分布狀況

本研究發(fā)現了8種抗菌藥物耐藥類型，在耐藥基因型中，大環(huán)內酯類耐藥5種，林可酰胺類耐藥4種，四環(huán)素類耐藥9種，頭霉素類耐藥5種，鏈霉素類耐藥1種，氟喹諾酮類耐藥7種，頭孢菌素類耐藥4種，碳青霉烯類耐藥2種（表1）。

表1 耐藥基因型的分布狀況Tab 1 Distribution of resistant genotypes

3 討論

在頜面部間隙感染中細菌培養(yǎng)是臨床中最常用的檢測致病菌的方法，但細菌培養(yǎng)時間普遍較長，且許多細菌不易培養(yǎng)，多重感染易被忽視，PCR檢測具有極高的靈敏度和特異性，但無法完成宏基因組篩查，檢出率較低，對于重癥的頜面多間隙感染患者來說，因傳統(tǒng)檢測方法無法及時確定病原體信息，不能提早針對性用藥，從而易使病情惡化[7]。因此，快速、特異的病原體檢測方法，對有頜面間隙感染的早期診斷和有針對性的用藥控制感染的擴散具有重要的意義。

mNGS可以分析病原體群體基因組成及功能，解讀病原體群體的多樣性與豐度，探求病原體與環(huán)境、宿主之間的關系，挖掘具有應用價值的基因資源，有利于開發(fā)新的病原體活性物質[7]。而且該技術不依賴于傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)，直接對臨床樣本中的核酸進行mNGS，然后與數據庫進行比對分析，根據比對到的序列信息來判斷樣本包含的病原微生物種類，能夠快速、客觀地檢測臨床樣本中較多的病原微生物（包括病毒、細菌、真菌、寄生蟲），且無需特異性擴增[8-12]，該方法不僅可以避開傳統(tǒng)方法（培養(yǎng)法、血清法和PCR法）的局限性，快速地檢測出已知病原體，還可以發(fā)現許多未知病原體，直接分析出樣本中的病原體譜、豐度和分布情況，了解潛在病原體的變化情況，有助于診斷一些不明病原體引發(fā)的感染性疾病[13-16]。

本研究統(tǒng)計了細菌培養(yǎng)及mNGS兩種方法的檢驗周期，結果發(fā)現，mNGS的檢測時間較細菌培養(yǎng)顯著縮短。Fan等[17]使用mNGS在48 h內快速診斷中樞神經系統(tǒng)布氏桿菌病，而培養(yǎng)法則需耗時7 d。Grumaz等[18]將mNGS用于重癥血流感染患者的病原體檢測，平均報告時間從常規(guī)血培養(yǎng)的5 d縮短至30 h以內，上述報道均與本研究結果相符。而在重癥的頜面多間隙感染患者中，快速獲取病原體相關信息的意義更為突出，縮短檢測時間可為患者爭取寶貴的治療時間，有效提高搶救的成功率。mNGS對于病原體檢出的陽性率遠高于細菌培養(yǎng)，Parize等[19]在免疫抑制的患者中，通過mNGS發(fā)現了較傳統(tǒng)方法更高比例的細菌及病毒感染；Street等[20]對關節(jié)假體感染進行mNGS檢測，觀察到該技術對病原體種水平的檢出敏感性為93%，上述研究均提示，mNGS較細菌培養(yǎng)的敏感性更高，與本研究結果一致。由于前期經驗性廣譜抗菌藥物的使用、病原體生長緩慢或病原體對生存條件要求苛刻等因素，往往會導致培養(yǎng)陽性率低，最終帶來治療延誤、住院時間延長、病死率增加等問題[21]。mNGS的高敏感性使它能夠檢測到臨床罕見、培養(yǎng)困難、甚至既往未知的病原體，對明確感染性疾病的診斷意義重大。

本次研究利用mNGS，在檢測出的致病菌中，革蘭陰性菌依次為中間普雷沃菌、牙齦卟啉單胞菌、產黑色素類桿菌、肺炎克雷伯菌，革蘭陽性菌依次為咽峽炎鏈球菌、星座鏈球菌、化膿鏈球菌；在非致病菌中，革蘭陰性菌依次為普雷沃菌屬、擬桿菌屬、卟啉單胞菌屬，革蘭陽性菌依次為微小微單胞菌、極小奇異菌、齦溝產線菌。常規(guī)細菌培養(yǎng)檢測出的病原菌，革蘭陽性菌依次為星座鏈球菌、咽峽炎鏈球菌，革蘭陰性菌為肺炎克雷伯菌。在兩種方法檢出的致病菌中，中間普雷沃菌、牙齦卟啉單胞菌、產黑色素類桿菌為革蘭陰性厭氧菌，咽峽炎鏈球菌、星座鏈球菌、化膿鏈球菌為革蘭陽性兼性厭氧菌，肺炎克雷伯菌為革蘭陰性需氧菌，本研究顯示，mNGS對于厭氧菌及兼性厭氧菌檢出陽性率遠高于細菌培養(yǎng)。李冰等[22]利用mNGS，對厭氧菌檢測的陽性率為82.76%，證明了mNGS在厭氧菌感染的精準化診斷方面相比細菌培養(yǎng)具有優(yōu)勢。周圍等[23]對2例重癥醫(yī)學科感染性休克患者，采用mNGS進行感染性微生物檢測，且最終根據mNGS檢測結果確診為厭氧菌感染。上述研究均顯示，mNGS相比細菌培養(yǎng)，在厭氧菌的診斷方面上更具有優(yōu)勢，與本研究結果一致。本次納入研究的16位頜面間隙感染患者，在入院后均抽取其感染部位膿液，同時進行mNGS及細菌培養(yǎng)，對符合切開引流指征的患者行局部切開引流，因細菌培養(yǎng)陽性檢出率低，無法準確指導臨床用藥，故本研究根據mNGS檢出致病菌及耐藥基因情況并參照相關用藥指南[24-26]對每個患者制定了個性化用藥方案，本研究的樣本檢測分析及指南的臨床用藥建議可選擇及推薦的抗生素藥物主要有：氨芐西林舒巴坦、青霉素G結合甲硝唑、頭孢菌素頭孢曲松結合甲硝唑等。經過治療后，16位患者的臨床癥狀及炎癥指標均明顯改善，因此mNGS有助于臨床的精準用藥，并且在耐藥基因檢出方面，mNGS可解決很多現有的技術無法處理的問題[27]。

本研究的不足之處在于樣本量有限，對分析部分因素與革蘭陽性菌、陰性菌比例的關系，以及關鍵致病菌的豐度對性別、感染來源及擴散部位的相關性分析缺乏可靠性，今后需擴大樣本量進一步統(tǒng)計分析，增加結論的可靠性。

盡管mNGS敏感度較高，但仍有很多不足之處，mNGS檢測結果是一個病原體列表，可能同時呈現多項陽性結果，臨床醫(yī)師難以僅僅依靠測序結果確定真正的病原菌，因此，檢測結果需要跨學科的全方位解讀[28-29]，而且不同的檢測機構，在病原菌鑒定以及相對豐度計算方面會出現差別[30]，目前，mNGS生物信息分析流程缺乏統(tǒng)一標準，研究人員基于個人經驗、可及性以及簡便性選用分析軟件，會對病原檢測結果的可重復性及準確性造成影響，成為mNGS臨床應用標準化的障礙。

綜上所述，與常規(guī)細菌培養(yǎng)相比mNGS具有檢驗時間短、靈敏度高、準確率高的特點，為頜面部間隙感染病原微生物的確定提供新方法，并有利于該疾病的早期臨床診斷與治療。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。